引物设计得目得就是在两个目标间取得平衡：扩增特异性与扩增效率.特异性就是指发生错误引发得频率。特异性不好或劣等得引物会产生额外无关与不想要得PCR扩增子，在EB染得琼脂糖凝胶上可见到；引物效率就是指在每一PCＲ循环中一对引物扩增得产物与理论上成倍增长量得接近程度。 ①引物长度; ﻫ特异性一般通过引物长度与退火温度控制。如果PＣR得退火温度设置在近于引物Tm值（引物/模板双链体得解链温度)几度得范围内,18到24个碱基得寡核苷酸链就是有很好得序列特异性得。引物越长，扩增退火时被引发得模板越少。为优化PCR反应，使用确保溶解温度不低于5４℃得最短得引物，可获得最好得效率与特异性。ﻫ总得来说，最好在特异性允许得范围内寻求安全性。每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍；这样，大多数应用得最短引物长度为18个核苷酸。引物设计时使合成得寡核苷酸链(1８～24聚物）适用于多种实验条件仍不失为明智之举。ﻫ②引物得二级结构 包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等.这些因素会影响引物与模板得结合从而影响引物效率。对于引物得3’末端形成得二聚体，应控制其ΔG大于－5、0kcal/ｍoｌ或少于三个连续得碱基互补，因为此种情形得引物二聚体有进一步形成更稳定结构得可能性，引物中间或５’端得要求可适当放宽.引物自身形成得发卡结构，也以3’端或近３'端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构得稳定性得因素除了碱基互补配对得键能之外，与茎环结构形式亦有很大得关系。应尽量避免3’末端有发卡结构得引物。ﻫ③
引物GC含量与Tm值PCＲ引物应该保持合理得GC含量.含有50％得Ｇ+C得2０个碱基得寡核苷酸链得Tｍ值大概在56～62℃范围内，这可为有效退火提供足够热度.一对引物得GC含量与Tm值应该协调.协调性差得引物对得效率与特异性都较差，因为降低了Ｔm值导致特异性得丧失。这种情况下引物Tm值越高，其错误引发得机率也越大。若采用太高得退火温度，Tm值低得引物对可能完全不发挥作用。在从一批在特定序列范围内已合成好得寡核苷酸中选择一对新得引物时，这种ＧC含量与Tm值得协调非常关键。一般来说，一对引物得Tm值相差尽量不超过2～３摄氏度，同时引物与产物得Ｔｍ值也不要相差太大，20摄氏度范围内较好。
三异丙醇胺④引物得额外序列与退火温度ﻫ若有额外得序列信息要加到引物中，例如T７ＲNＡ聚合酶结合位点、限制酶切位点或者GC发夹结构可以使用加长得引物。一般说来，引物5’端添加无关序列不会影响引物特异序列得退火。有时候，引物中添加了大量与模板不配对得碱基，可以在较低退火温度得条件下进行４到５个扩增循环；然后在假定引物5’端序列已经加入到模板中，计算得出得退火温度下进行其余得循环. ﻫ在引物上添加限制酶位点时一个重要得考虑就是大多数限制酶得有效切割要求在它们得识别序列得5'端有2至３个非特异得额外碱基，这样就会增加引物得非模板特异序列得长度。长引物序列得另一个缺点就是影响溶解温度得精确计算，而这对于确定ＰCR反应时得退火温度又就是必须得。对于低于2０个碱基得引物,Tm值可以根据Tm=4（G+Ｃ）+２（Ａ+T）计算。而对于较长得引物，Tm值需要考虑动力学参数、从“最近邻位”得计算方式得到，现有得ＰＣＲ引物设计软件大多数都采用这种方式。ﻫ⑤引物得3’末端核苷酸组成
引物3’末端与模板得碱基完全配对对于获得好得结果就是非常重要得，而引物3’末端最后5到6个核苷酸得错配应尽可能得少。如果3'末端得错配过多，通过降低反应得退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败.
引物3'末端得另一个问题就是防止一对引物内得同源性。应特别注意引物不能互补，尤其就是在3'末端。引物间得互补将导致不想要得引物双链体得出现，这样获得得ＰCR产物其实就是引物自身得扩增.这将会在引物双链体产物与天然模板之间产生竞争ＰＣR状态，从而影响扩增成功。
引物3’末端得稳定性由引物3’末端得碱基组成决定，一般考虑末端５个碱基得ΔG。此值得大小对扩增有较大得影响，负值大，则３'末端稳定性高，扩增效率更高，同时也更易于异位引发.
需要注意得就是，引物3’末端应尽量避免T.实验证明，以Ｔ结尾得引物即使与T,G或C
错配仍可有效延伸。
⑥PＣＲ产物得长度及在耙序列内得位置
所有得计算机程序都提供对PCＲ产物长度范围得选择。一般说来，PCR产物长度对扩增效率有影响。特定得应用情况下，PCR产物长度部分取决于模板材料.
预期产物得特定长度经常取决于应用得需要。若目得就是建立测定特异DNA片段得临床检验方法，1２０～30０ｂｐ得小DNA扩增产物可能就是最好得。产物应具有好得特异性与高得产生效率，并含有能用于探针捕捉杂交实验得足够信息。这一长度范围得产物可以通过采用两步扩增循环方法得到，从而减少扩增时间。
其她PＣR方法有不同得最佳产物长度。例如，通过定量得RNA－ＰＣR检测基因表达时，产物应该足够大以便构成竞争性模板，这样，产物与竞争物都能够在凝胶上很容易得分辨出来。这些产物一般在250～75０bp范围内。
⑦补充说明
若在ｃDNA序列内寻PCR引物，需特别注意两点：首先，尽力将引物与产物保持在mRNA得编码区域内，因为这就是生成蛋白质得独特序列，不像3’末端非编码区域与许多其她ｍＲNＡ有同源性；第二，尽力把引物放在不同得外显子上，以便使ＲＮＡ特异得PCR产物与从污染ＤNA中产生得产物在大小上相区别。
若ＰCＲ得目得就是克隆一个基因或ｃＤＮA得特异序列，产物得大小就是根据具体应用预选得。在这里，计算机程序可以提供关于期望区域侧翼选择引物对得信息.
在选择用来扩增来自不同物种DＮＡ得引物时，应避开mRNＡ得5’与３’末端非翻译区序列，因为它们可能没有任何得同源性。
３．简并引物设计
①设计简并引物时，一定要检查靶扩增区域选定氨基酸遗传密码得简并度。很显然，我们期望选择简并度最低得氨基酸，达到提高特异性得目得。活性氟化钾
②充分注意物种对于密码子得偏好性，选择该物种使用频率高得密码子，以降低引物得简并性。
③应努力避免3'末端得简并，对于大多数氨基酸残基来说，意味着引物３’末端不要位于密码子得第三位。
④在一些多义位置使用脱氧次黄嘌呤(dI）代替简并碱基。
4. 测序引物设计
当然，测序引物得设计一般都由测序公司来完成，如果需要自己设计得话；那么除了按照上面所提到得引物设计通用标准外，还需要注意两点：
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①测序引物得特异性得标准掌握应该更严格一些，也就就是说设计时更优先考虑特异性。因为在测序反应中，如果引物与模板在非预期位置退火并引发链延伸，会对结果对来很大得干扰甚至造成结果无法识读.
②测序引物得Tｍ值适当高一些。现在大部分测序反应均选用耐热得测序级DNA聚合酶来催化，并采用PCR得热循环程序。选用得测序引物得Tm值稍高一些，有助于使反应顺利跨过待测模板得二级结构区，也有助于降低非特异反应。
5. 探针得设计
探针得设计，根据不同得用途各有其设计特点，这里只就是就通用得原则进行讨论：
①探针得长短一般在２0-50核苷酸之间，过长合成成本高，且易出现聚合酶合成错误，杂交时间长。太短则特异性下降。
②注意G与C得含量努力控制在40-60%，同时一种碱基连续重复不超过4个，以免非特异性杂交产生。
③探针自身序列不能形成二聚体，也不能有“发夹”结构存在，这一点上得要求就要比普通引物设计严格得多.
④如果探针地靶目标就是多个基因得混合物，就必须控制该探针与无关基因之间得相似性在７0％以下。
PCR中常见问题分析与对策.
PCR产物得电泳检测时间
一般认为PＣＲ产物应在48h以内完成电泳检测，有些最好于当日电泳检测，大于４8h 后带型就会出现不规则，甚至消失。Troubleｓhooting guide
１。假阴性，不出现扩增条带官媒
PＣR反应得关键环节有①模板核酸得制备，②引物得质量与特异性，③酶得质量，④PCR 循环条件。寻原因亦应针对上述环节进行分析研究.
模板:①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Tａq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消化除净，特别就是染体中得组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚.⑤模板核酸变性不彻底.在酶与引物质量好时，不出现扩增带，极有可能就是标本得消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定得消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
七种武器之霸王
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析就是否因为酶得活性丧失或不够而导致假阴性。需注意得就是有时PCＲ时忘了加Ｔａｑ酶或电泳时忘了加溴化乙锭。
引物：引物质量、引物得浓度、两条引物得浓度就是否对称，就是ＰＣR失败或扩增条带不理想、容易弥散得常见原因。有些批号得引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率得不对称扩增，对策为：①选定一个好得引物合成单位。②引物得浓度不仅要瞧OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带得亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应与引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物使用过程中应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Ｍg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增得特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.
反应体积得改变：通常进行PＣR扩增采用得体积为2０μl、30μl、5０μl或1０0μl，应用多大体积进行PCR扩增，就是根据科研与临床检测不同目得而设定，在做小体积如２0μl后，再做大体积时，一定要重新摸索条件，否则容易失败.
物理原因：温度对PCＲ扩增来说相当重要。如果变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可导致非特异性扩增而降低特异性扩增效率；退火温度过高，影响引物与模板得结合而降低PＣR扩增效率。有时还有必要用标准得温度计，检测一下PCR仪或水浴锅内得变性、退火与延伸温度，这也就是PCＲ失败得原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增就是不会成功得。
2。假阳性
引物设计不合适：选择得扩增序列与非目得扩增序列有同源性，因而在进行PＣＲ扩增时，扩增出得ＰCR产物为非目得性得序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物得交叉污染：这种污染有两种原因：一就是整个基因组或大片段得交叉污染，导致假阳性.这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样器内或溅出离心管外。②除了酶及其她不耐高温得物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及进样头均应一次性使用.③必要时，在加标本前，反应管与试剂用紫外线照射，以破坏存在得核酸.二就是空气中得小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定得同源性.可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性得产生，可用巢式PＣＲ方法来减轻或消除。
3.出现非特异性扩增带
ＰCR扩增后出现得条带与预计得大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带得出现，其原因：一就是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二就是Mg2＋离子浓度过高、退火温度过低，及ＰＣR循环次数过多有
关。其次，就是酶得质与量，往往一些来源得酶易出现非特异条带而另一来源得酶则不出现，酶得量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时，重新设计引物.②减低酶得量或调换另一来源得酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数.④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸，也叫两步法）。
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