1)、大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在genebank中到相应基因序列。 引物设计通常遵守如下原则： A、引物与模板的序列要紧密互补。 B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。 C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。 D路网密度、引物长度通常在 20－三点式振荡器25bp,Tm值在 55－65℃，GC含量在 40%－60%，产物大小在100-250bp之间。 钙盐E、引物的 3’端避免使用碱基A；引物 3’端避免出现 3 个以上连续相同的碱基。 F、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子 探针设计通常遵守如下原则： A、探针位置尽可能地靠近上游引物。 B、探针长度通常在 20－30bp，Tm值在 65－70℃，通常比引物高 5－10℃，GC含量在 40%－70%。 C、探针的 5’端应避免使用碱基G。 D、整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量。 3）、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。()功率因数测量电路 4）、根据仪器特点和个人的喜好，选择标记的荧光素种类。如：FAM、Texas red、LC-Red640，LC-Red705 等，同时确定荧光定量PCR的方法，选择Taqman或beacon等，可参考前面所述。 5）、选择高品质的引物探针合成商，如闪晶生物等。 6）、外标准品的制备：一种是化学合成目的基因，它的优点是纯度高、定量准确，缺点是受化学合成工艺的限制，只能合成 120bp以下的长度；一种是将PCR扩增产物直接梯度稀释，它的优点是方便、简单，缺点是不准确、不稳定；另一种是将PCR产物克隆到载体上，然后抽提出质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量，它的优点是稳定、准确。如果是转基因食品，则要求转基因食品与非转基因食品按一定的比例混合做成标准品。稀释液可以是TE缓冲液。拷贝数＝（质量\分子量）×6.0×1023。通常外标由 4 个点到 5 个点组成，模板的浓度分别为 107/ml、106/ml、105/ml、104/ml、103/ml。 7）、合成好的引物探针，最好用双蒸水稀释成25pmol/ul的浓度，然后放－20℃保存，还应该注意避光保存探针。如果是配成 25pmol/ul的浓度，那么所加水的量是（ul）：(OD数×33)\分子量×40000 8)、PCR反应液的配制 1×PCR buffer、0.3-0.5pmol/ul的引物、0.1－0.3pmol/ul的探针、2.5-4.0mM的Mg2+、1-2U的Taq酶、0.2－0.4mM的dNTPs、0.2-1U的UNG酶、0.3-0.6mMdUTP、通常取 2-5ul的模板、反应总体积通常为 20－50ul（以上所有的浓度都是指终浓度） 9)、PCR扩增程序的设定 在lightcycler上通常是：先 50℃2 分钟、再93℃3 分钟，然后 93℃5 秒 60℃20 秒，循环40 次，在 60℃时，设定荧光检测点 在其它荧光仪器上，通常是：先 50℃2 分钟、再93℃5 分钟，然后 93℃20 秒、60℃30 秒，循环 40 工程项目融资论文次，在 60℃时，设定荧光检测点。 10）、基线或阀值的设定 通常是以 10－15 个循环的荧光值作为阀值，也可以以阴性对照荧光值的最高点作为基线。 |
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