同源克隆简介
一、 材料准备和冷诱导 2
二、 RNA提取和反转录 2
四、 体外连接和转化 3
五、 菌落筛选和测序 3
七、 race法获取基因的3’和5’末端 4
同源克隆简介
一、 材料准备和冷诱导
1. 材料培养
2. 材料冷诱导
二、 RNA提取和反转录
1. RNA提取准备(参考文件夹RNA提取相关知识)
2. RNA提取过程(参考文件夹RNA提取过程)
3. RNA反转录为cDNA
a) RNA 5ul/8ul
体系 oligodT 1ul
15ul RNaseFree-ddH2O 补足15ul
b) 70℃ For 5 min
c) 冰预 For 5 min
印尼d) 加入 5×buffer 5ul
dNTP 1.25ul
体系 RRI 1ul
M-MLVR 1ul
RNaseFree-ddH2高中语文教学大纲O 1.75ul
e) 42℃ For 1h
三、 PCR扩增基因中间片段和回收
1. 同源引物设计
理解如何进行设计，并学着去同源引物设计（参考生物信息学材料） 2. PCR体系(25ul)
cDNA模板 2.5ul
ddH2O 17.2ul
Buffer 2.5ul
Taq酶 0.4ul有效教学研究
dNTP 0.4ul
引物 上下游各1ul,共2ul（参考抗寒基因引物文件夹）
3. 反应程序
1) 94℃ for 5min
2) 94℃ for 30s
3) 45℃-58℃ for 45s
4) 72℃何处寻真相 for 1min
5) Go to 2 , 5 times
6) 94℃ for 30s
7) 55℃ for 45s
8) 72℃ for 1min王牌拖拉机
9) Go to 6, 30times
10) 72℃ for 10min
11) 16℃ for ever
12) end
其中反应体系和程序可根据实际情况进行改变，注意理解每一步的原由。
4. 电泳检测
理解琼脂糖凝胶电泳全过程及相关注意事项（查阅资料）
营造地表形态的力量5. 切胶回收
参考DP209--离心柱型--普通D（pdf文件）
四、 体外连接和转化
1. 体外连接
参考pGM-T克隆试剂盒
2. 转化
1) 准备工作
a LB培养基配制 b 感受态细胞制备
2) 转化过程
参考pGM-T克隆试剂盒
五、 菌落筛选和测序
1． 利用а互补作用进行蓝白斑筛选，从转化的平板中挑去白斑画线扩大培养；
2． 选择画的好的线，进行菌落PCR，过程同普通PCR ,只是把原来的模板换作ddH2O；
3． 选择PCR出条带的线条进行摇菌，送公司进行测序。
六、 序列分析和race引物设计
利用DNAMAN和Primer5.0 以及NCBI网站进行序列分析和RACE引物设计
七、 race法获取基因的3’和5’末端
RACE法获取cDNA 两端（查阅资料）
八、 基因全长拼接和生物信息学分析
race 法获得两段片段之后，将整个基因整合在一起，所得序列进行Blastn验证和序列结构分析。
