第34卷第2期2007年3月
浙 江 大 学 学 报(理学版)
Journal of Zhejiang U niversity(Science Edition)
http ://www.journals.zju.edu/sci
Vol.34No.2Mar.2007
收稿日期:2006201216.
基金项目：国家农业科技成果转化资金项目(02EFN213310651)；浙江省自然科学基金资助项目(302442)；浙江省教育厅重点项目(20040898)；浙江省新世纪151人才基金(2005).
作者简介：王春琳(1965-)，男，教授，博士，主要从事水产经济动物繁育研究.
王春琳，尹 飞，宋微微
(宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江宁波315211)
摘 要：通过生物化学成分测定，分析黑斑口虾蛄(Oratosquilla kem pi )胚胎和幼体不同发育时期的水分、总脂和脂肪酸的组成及体积分数、质量分数变化.结果显示，黑斑口虾蛄在胚胎和幼体的发育过程中，水的体积分数先降低，至原肠胚期开始升高，到第二相幼体期达到最高，之后又有所回落；脂类占组织干重的比率呈升高趋势，但分别在膜内无节幼体、第二相幼体和仔虾蛄期略有降低；脂类占组织湿重的比率呈降低趋势；花生四烯酸、EPA 和D HA 的体积分数都呈降低趋势.在胚胎及幼体发育过程中脂类及不饱和脂肪酸是作为能量物质被消耗并且与其组织、器官的形成有密切关系. 关 键 词：黑斑口虾蛄；胚胎发育；幼体发育；脂类；脂肪酸
中图分类号:S968.2 文献标识码:A 文章编号:1008-9497(2007)02-223-05
WAN G Chun 2lin ,YIN Fei ,SON G Wei 2wei (Facult y of L i f e S ciences and B iotechnology ,N ingbo Universit y ,N ingbo 315211,China )
Analysis of lipid and fatty acid composition during embryonic and larval development of Oratosquilla kempi .Journal of Zhejiang University (Science Edition ),2007,34(2):223～227
Abstract :Water content ,lipid and fatty acids composition during embryonic and larval development o
f Oratosquilla kem pi were determined by biochemical methods.The results showed that water content decreased first ,then in 2
creased in the gastrula stage of embryonic development ,reached the highest content at the second phrase larvae stage and then began to decrease f rom the third phase larva stage.The content of lipid in the dry weight increased with the embryonic development stages ,but decreased at intramembranous nauplius stage ,the second phase larva ,and the
infant stage of larvae development.The rate of lipid in wet weight decreased and the content of C20:4ω6、20:5
ω3(EPA )and C22:6ω3(D HA )decreased.It suggested that the variations in biochemical composition during the devel 2opment stages f rom egg to the infant of Oratosquilla kem pi were concerned with energy metabolizing and closely correlated with the development of the tissue and organization.
K ey w ords :Oratosquilla kem pi ;embryonic development ;larval development ;lipid ;fatty acid
在甲壳动物虾蟹类胚胎发育过程中，大量脂类
作为能量物质而被消耗或用来构建身体的各个组织器官.虾蟹类的胚胎和幼体的营养与其生长、发育密
切相关.研究胚胎及幼体发育过程中脂类等生化成分的变化对进一步探讨甲壳动物的生殖和发育特点有一定的学术意义.
有关甲壳动物虾蟹类胚胎生化成分的研究，国
内外已有报道[1～7]，但迄今未见虾蛄类胚胎及幼体发育过程中生化成分变化的研究报道.本文通过研究黑斑口虾蛄(Oratosquill a kem pi )胚胎和幼体不同发育时期的水分、脂类物质和脂肪酸体积分数、质量分数的变化，初步探讨这些生化成分的变化与胚胎、幼体形态结构发育的关系，为提高其胚胎孵化率及幼体变态率、存活率，以及大规模人工育苗提供理
论依据.
1 材料和方法
1.1 材 料
黑斑口虾蛄亲体来自浙江三门湾，选取性腺发育成熟、已交配、体长为10～14cm的雌性个体放养于室内铺有20cm海泥、7m×4m×1.3m的水泥池中，放养量为200只/池，定时投喂新鲜鱼虾肉，随时观察虾蛄产卵及胚胎发育.收集已孵幼体，另池进行幼体培育，投喂卤虫无节幼体、桡足类与虾肉等饵料，充气.培育期间水温为21～26℃，盐度为23.56.分别采集受精卵、囊胚期、原肠胚期、膜内无节幼
体期、膜内假状幼体期、第一相幼体期、第二相幼体期、第三相幼体期和仔虾蛄期等[8]各期样品1g，冰冻备用.
1.2 方 法
1.2.1 水分的测定
取新鲜胚胎和幼体组织，在70℃下烘烤至恒重，测定水的体积分数.
1.2.2 总脂的提取
收集不同发育时期样品，清水冲洗，用吸水纸吸干体表水份，称1g(湿重)置于比管中，用Folch 程序[即氯仿2甲醇(2∶1)抽提法][9]提取总脂.减压，使有机溶剂挥发，用电子天平(±0.1mg)准确称重，并于4℃冰箱中保存，以备气相谱分析.
1.2.3 脂肪酸测定
1.2.3.1 脂肪酸甲酯化
将上述所得脂肪置于10mL试管中，加入1～2 mL苯2石油醚的混合溶液(容积比1∶1)溶解脂类，再加入
1～2mL0.4N・L-1的氢氧化钾2甲醇溶液，振荡混合均匀后，静置10min，加蒸馏水8mL，静置分层，取上清液，浓缩后用于气相谱分析.
1.2.3.2 气相谱参数设置
用毛细管气相谱法分析脂肪酸体积分数，分析条件为分流进样系统；所用气相谱仪为Agi2 lent6890系列气相谱系统，毛细管柱为30.0mm ×0.25mm(温度上限为325℃)的H P25.5%Phe2 nyl Met hyl Siloxane，型号为Agilent19091J2413；进样器温度300℃；检测器温度300℃；起始温度60℃，保留2min，然后以20℃・min-1的速度升至150℃，再以4℃・min-1的速度升至280℃，共计39min；氢气的流速为40mL・min-1；空气流速为400mL・min-1，补偿气体氮气的流速为35mL・min-1，分流比为1∶1～100；压力为60kPa.1.2.3.3 脂肪酸标准试剂曲线的制作
脂肪酸标准样品购自Sigma公司，用正已烷配制成一定浓度，在同样的参数条件下，分别在一定的洗脱时间形成峰，并借此作为脂肪酸定性的依据.脂肪酸的定量采用峰面积归一化法确定.
2 结 果
2.1 胚胎和幼体发育过程中水分变化
在黑斑口虾蛄胚胎发育过程中，水的体积分数先减后增(见图1).从受精卵、囊胚期到原肠期的发育过程
中水分逐渐减少，分别为61.97%、56.13%和55.28%.从膜内无节幼体期又开始升高，为56.24%.膜内假状幼体期水的体积分数达到最大值64.82%，增长率为15.26%.幼体孵化出膜后，从第一相幼体到第二相幼体阶段水的体积分数明显升高，由76.3%增至89.03%，增长率为16.68%.从第二相幼体到仔虾蛄阶段呈下降趋势，第三相幼体为82.63%，仔虾蛄为71.29%.
图1 黑斑口虾蛄胚胎和幼体发育各期水的体积分数Fig.1 The water contents of Oratosquilla kem pi during embryonic and larval development stages
Ⅰ：受精卵;Ⅱ：囊胚期;Ⅲ：原肠胚期;Ⅳ：膜内无节幼体期;Ⅴ：膜内假状幼体期;Ⅵ：第一相幼体;Ⅶ：第二相幼体;Ⅷ：第三相幼体;Ⅸ：仔虾蛄
Ⅰ:fertilized egg stage;Ⅱ:blast ula stage;Ⅲ:gastrula stage;Ⅳ:in2 tramembranous nauplius stage;Ⅴ:intramembranous pseudozoaea stage;Ⅵ:t he first phase larva;Ⅶ:t he second phase larva;Ⅷ:t he t hird phase larva;Ⅸ:t he infant
2.2 胚胎和幼体不同发育时期脂类和脂肪酸的组成2.2.1 脂类的质量分数
如图2所示，在黑斑口虾蛄胚胎发育中，总脂占干重的比率变化不明显，但在后期略有上升.从受精卵到膜内无节幼体期
，总脂质量分数由占干重的15%下降到12.39%.在膜内假状幼体期，总脂质量分数上升，达15.09%，增幅为21.79%.当幼体孵化出膜后，总脂质量分数因幼体发育时期的不同而有所差别.各期幼体总脂占干重比率的变化幅度较
422浙江大学学报(理学版) 第34卷
大，从膜内假状幼体期到第一相幼体期、第二相幼体到第三相幼体期和第三相幼体到仔虾蛄期的发育过程中变化幅度都在20%以上.
黑斑口虾蛄各期胚胎总脂占湿重的比率变化不明显，而各期幼体总脂占湿重的比率呈降低趋势，分别为第一相幼体5.14%、第二相幼体1.56%、第三相幼体2.03%、仔虾蛄0.97
%.
图2 黑斑口虾蛄胚胎和幼体发育各期脂类的质量分数
Fig.2 Proportion of lipid of Oratosquilla kem pi dur 2
ing embryonic and larval development stages
Ⅰ：受精卵;Ⅱ：囊胚期;Ⅲ：原肠胚期;Ⅳ：膜内无节幼体期;Ⅴ：膜内假状幼体期;Ⅵ：第一相幼体;Ⅶ：第二相幼体;Ⅷ：第三相幼体;Ⅸ：仔虾蛄
Ⅰ:fertilized egg stage ;Ⅱ:blast ula stage ;Ⅲ:gastrula
stage ;Ⅳ:intramembranous nauplius stage ;Ⅴ:intramem 2branous pseudozoaea stage ;Ⅵ:t he first phase larva ;Ⅶ:t he second phase larva ;Ⅷ:
t he t hird phase larva ;Ⅸ:t he infant 2.2.2 脂肪酸的体积分数
从表1可见，黑斑口虾蛄各期胚胎和幼体中，占
主要比例的脂肪酸为C16∶0(棕榈酸)、C16∶1
ω7(棕榈油酸)、18∶0(硬脂酸)、C18∶1
ω9(油酸)、C20∶4ω6(花生四烯酸)、20∶5ω3(EPA )和C22∶6
ω3(D HA ).从受精卵到仔虾蛄的发育过程中,C14∶0(豆蔻酸)、C16∶0和C16∶1
ω7在原肠胚期体积分数最高，分别为5.00%、19.52%和11.51%，以后体积分数总体上呈逐渐降低趋势.胚胎发育过程
中C18∶0、C18∶1ω9、C20∶5ω3和C22∶6
ω3的体积分数变化幅度较缓，在幼体发育过程中C18∶1
ω9和EPA 的体积分数则呈上升趋势.除了C18∶0、C18∶1和C20∶3外，各期幼体的脂肪酸的体积分数均较胚胎中的低.
3 讨 论
3.1 水的体积分数变化
在胚胎发育过程中，随着胚胎的不同部分逐步分化形成各种组织和器官，卵黄物质不断消耗，使水分的体积分数增高.
膜内假状幼体期是黑斑口虾蛄幼体破膜孵化的关键时期，需吸收大量水分以利出膜，出膜后幼体体积的增大也是靠吸水，所以黑斑
口虾蛄从原肠期发育到第二相幼体期含水量不断增
加.这与日本沼虾(M acrobrachi um ni p ponensis )和表1 黑斑口虾蛄胚胎和幼体发育不同时期脂肪酸组成(%)变化
Table 1 Variation in fatty acid composition (%)of Oratosquilla kem pi during embryonic and larval development stages
脂肪酸fatty acid Ⅰ
Ⅱ
ⅢⅣⅤⅥⅦⅧⅨC14∶0
3.87
3.42
5.00
3.71
2.53
3.39
1.39
三民主义青年团1.61
1.02
C16∶016.6016.0119.5215.1015.4718.5713.2213.5112.93C18∶0
6.968.18
7.07 6.41 6.967.09
8.107.297.14ΣSFA
29.0826.7133.1623.7923.4529.0522.7122.4121.09C16∶1ω79.237.6011.517.267.357.35 1.95 2.27 2.68C18∶1
ω915.6616.7416.3613.3715.3116.6411.9133.4028.48C22∶1
1.62 1.60 1.19 1.35
2.20
3.07 2.13 2.000.75ΣMU FA 26.7925.9329.3821.0423.6927.0615.9937.6731.91C20∶4ω613.4315.5513.2016.2619.6417.7815.5810.0411.11C20∶5ω3
4.37 4.93 4.20 4.94 4.36 2.41 3.24 3.44 4.16C20∶3ω30.98 1.270.88 1.23 2.19 2.05-0.28-C22∶6ω318.3618.8513.3621.5116.7511.1716.8317.861
5.27ΣPU FA 37.1440.6031.6443.9442.9433.4135.6531.6230.54EPA/D HA
0.24
恩度0.26
0.31
0.23
0.26
0.22
0.19
0.19
0.27
注 ΣSFA 为饱和脂肪酸体积分数总和;ΣMU FA 为单不饱和脂肪酸体积分数总和;ΣPU FA 为多不饱和脂肪酸体积分数总和;“-”表示
未检出
ΣSFA :Sums of saturated fatty acid ;ΣMU FA :Sums of monounsaturated fatty acid ;ΣPU FA :Sums of ployunsatutated fatty acid ;“-”:not detected
中华绒螯蟹(Eriochei r si nensis )等甲壳动物基本相似[1～7].
黑斑口虾蛄从膜内假状幼体发育到第二
相幼体初期，此阶段的幼体尚未开始摄食，而且由于活动增强以及各组织器官进一步发育造成卵黄及各
5
22 第2期王春琳，等：黑斑口虾蛄胚胎和幼体不同发育时期脂类及脂肪酸组成分析
种能量物质的大量消耗，也使水的体积分数大幅度增加.当幼体进一步发育到第三相幼体和仔虾蛄时，幼体经过大量摄食，从外界补充了大量脂肪和其它干物质，使水的体积分数降低.
3.2 脂类质量分数的变化
kis2009在黑斑口虾蛄受精卵到膜内无节幼体期的发育过程中，其总脂占干重的比率总体呈下降趋势，但差别不是很明显.这可能是因为在胚胎发育过程前阶段少部分脂类以能量的形式被消耗，而膜内无节幼体期
前后是消化器官、感觉器官和附肢等器官分化与形成关键时期，新陈代谢旺盛，脂类作为能源利用稍稍增多，总脂质量分数减少，但大部分脂类主要用来构建各组织及器官[7].进入膜内假状幼体期后，脂类质量分数有所上升，这是因为在胚胎的各组织器官进一步发展的过程中，腹部分节处出现黑素，胚胎透明区两侧的素条纹变粗形成复眼.复眼素的主要成分是脂类物质[1,5]，复眼等器官的形成需要大量脂类物质的积累，其中一部分脂类可由胚胎的蛋白质提供[2].在第二相幼体期脂类质量分数下降，因为此时卵黄物质基本耗尽，幼体开始摄取外源营养物质.经过一段时间的积累，到第三相幼体期，脂类占干重的比例达到最高值.证明饵料中脂类物质的质量分数对幼体发育过程中脂类的增减有较大的影响.
3.3 脂肪酸组成及体积分数的变化
南美白对虾(Penaeus v anname)卵中主要的脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸、花生四烯酸和D HA，而在无节幼体中则为棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸、花生四烯酸、EPA和D HA[6]；日本对虾(M ar2 s u penaeus j a ponicus)卵中主要的脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、油酸、EPA和D HA[10]；白对虾(Penaeus seti f erus)幼体中主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸、花生四烯酸和D HA[11]；中国对虾(Penaeus chi nensis)卵中主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸、花生四烯酸、EPA和D HA[12].本实验中，黑斑口虾蛄的卵和幼体中主要脂肪酸为棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、花生四烯酸、EPA和D HA.可见黑斑口虾蛄的脂肪酸组成与以上几种对虾的脂肪酸组成不同.另外，白对虾脂
肪酸中花生四烯酸的体积分数较多，且在幼体发育过程中有较大幅度的增加；南美白对虾幼体发育过程中花生四烯酸的比例却在下降；而黑斑口虾蛄胚胎发育过程中花生四烯酸的体积分数有所升高，但是在幼体发育阶段却在减少，这可能是由于在胚胎发育过程中，花生四烯酸需要大量积累为后面的幼体发育提供能量.南美白对虾、日本对虾和中国对虾的EPA和D HA比例的变化趋势相同，均在增加.但黑斑口虾蛄从胚胎到仔虾蛄的发育过程中,EPA的体积分数却在减少，其平均值为4.01%，略低于成熟雌体的EPA(5. 61%)；而其幼体和胚胎中D HA(15.55%)的平均体积分数却高于成熟雄体(10.23%)[13]，但其总体体积分数也有所下降.这是由于EPA和D HA等高度不饱和脂肪酸(HU FA)是海水鱼虾蟹类的必需的脂肪酸[14]，是胚胎及幼体发育过程中的能量供体，也是造成ΣPU FA大量减少的主要原因.
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