Cytochemistry stain for blood cells
一、过氧化物酶染
染原理
粒细胞和部分单核细胞的溶酶体颗粒中含有髓过氧化物酶(myeloperoxidase, POX或MPO)，能将底物H202分解，产生新生态氧，新生态氧可氧化四甲基联苯胶成联苯胺蓝。联苯胺蓝自我脱氢氧化形成棕的四甲基苯酿二胺，后者与亚硝基铁氧化纳结合，再进一步氧化形成稳定的蓝颗粒，沉淀于细胞质内酶所在的部位。 试剂器材
1．1%TMB(3,5,31,5f一四甲基联苯胶)乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88%乙醇溶液中，置棕瓶内，冰箱保存。
2．亚硝基铁氧化锅饱和溶液在少量蒸馏水中加入亚硝基铁氰晶体，至不再溶解为止，置棕瓶内，冰箱保存。
3．1%过氧化氢溶液取30%H2021mL加入蒸馆水29mL。
4．稀过氧化氢溶液1%H2021滴，加10 mL蒸馏水稀释(新鲜配制)。
5．瑞氏(Wright)染液。
6．新鲜涂片(骨髓或血片)、染架、洗耳球、光学显微镜等。
操作步骤
1．取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亚硝基铁饱和溶液10μL，溶液呈淡棕黄，染液应临用前配制。
2．在新鲜干燥的血片或骨髓涂片上，加0.1%TMB一亚硝基铁饱和溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹匀，染6min。3．自来水冲洗，待干，用瑞氏染液复染15~20 min。
4．自来水冲洗，待干，用油镜镜检。
注意事顶
1．血涂片或骨髓涂片应新鲜制作，涂片应厚薄适宜。
2．TMB配制在85%~88%的乙醇溶液中染效果较好，勿用90%~95%乙醇，否则细胞表面蛋白质很快凝固，妨碍试剂向胞内渗入而导致染效果差。3．H202需新鲜配制，其浓度与加入量不能随意更改。涂片中粒细胞看不见阳性颗粒，红细胞呈棕或绿，即表示H202过浓。若H202加于血片上不产生气泡，则示无效。
4．染液pH应为5.5。
5．试剂应置于低温暗处，防止因光线照射而失效。
实验评价
1．POX染是鉴别急性白血病类型最重要最常用的细胞化学染方法，临床上不管是哪种急性白血病，首先做POX染，以区分是急性髓细胞白血病还是急性淋巴细胞白血病。如变异型的急性早幼粒细胞白血病极易误诊为急单、急粒中如以小型原粒细胞为主者极易误认为急淋等。在判读细胞POX 染结果前，要先观察成熟粒细胞是否呈强阳性，以判断染是否成功。2．POX阳性说明是急性髓细胞白血病(阳性较强常见于急性粒细胞白血病，弱阳性常见于急性单核细胞白血病)；阴性说明各种急性白血病的可能性均有。因原始细胞多表现为阴性反应，故本法对白血病的分型有一定的局限性，特别是对某些分化极差的白血病，可能失去鉴别意义。 净然法师
3．四甲基联苯胺法操作简单，染效果较好，试剂无致癌作用，但对染液pH要求较高，如pH<5.0会导致假阳性结果。盛世才
二、AS-D荼盼醋酶染
染原理
血细胞内的AS-D荼酚酯酶(naphythol AS-D chloroacetate esterase, NAS-DCE)水解基质液中的AS-D荼酚，产生AS-D荼酚，进而与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐为坚牢紫酱GBC，形成的有沉淀为红。
试剂器材
1．10%甲醛甲醇固定液
甲醛25mL
甲醇75mL
混合后置4℃冰箱保存。
2．Veronal醋酸缓冲液
中国军人核心价值观甲液：
醋酸钠(含3H2O) 1.94g
钠 2.94g
蒸馏水100mL
乙液：
0.1mol/L盐酸取盐酸(比密1.190g/L)0.85mL加蒸馏水至100mL。
取甲液50mL，乙液45mL，再加蒸馏水135mL，用1mol/L盐酸调pH 至7.5~7.6。
3．基质液
AS-D荼酚100mg
丙酮0.5mL
蒸馏水5mL
Veronal醋酸缓冲液5mL
固酱紫GBC盐10 mg
不必过滤立即染，一次用完。
4．苏木素染液。
操作步骤
1．固定新鲜干燥的涂片在固定液中30 s~1min，蒸馏水冲洗，待干。2．显示放入基质液(37℃)30min，自来水冲洗。
3．复染苏木素染液复染5mn，自来水冲洗，待干，镜检。
注意事顶
1．冬季室温低，茶酚和固酱紫GBC盐不易溶解，可放37℃温箱促溶。2．茶酚在丙酮中溶解后再加其他液体。
3．NAS-DCE不被氟化钠抑制。
4．此酶染后的标本易脱，不能长期保存。
实验评价
NAS-DCE阳性反应几乎仅出现在粒细胞、较POX染更具有特异性，因此又称为"粒细胞酯酶"、"特异性酯酶"。故该酶较特异地识别粒细胞系，有助于急粒和急单的鉴别，特别是对某些POX反应较强的单核细胞白血病鉴别意义更大。
三、α一醋酸荼盼醋酶染
染原理
茶多网血细胞内的α-醋酸荼酚酯酶(α-naphythyol acetate esterase,α-NAE)在pH中性的条件下可水解基质液中的α-醋酸荼酚，释放出α-荼酚与基质液中的重氮盐偶联形成不溶的有沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。本试验常用的重氮盐对坚牢蓝B，形成的有沉淀为棕黑或灰黑。α-NAE存在于单核细胞、粒细胞和淋巴细胞中，故它是一种中性非特异性酯酶。单核系细胞的阳性可被氟化钠抑制，所以做α-NAE染时，通常同时做氟化钠抑制试验。
试剂器材
1．0.067mol/L磷酸缓冲液(pH7.6)。
甲液：Na2HPO4·12H2O 2.388g加蒸馆水至100mL。
乙液：KH2 PO4 0.908g加蒸馏水至100 mL。
取甲液87mL，乙液13mL混合，调pH至7.6。
2．基质液0.067mol/L磷酸缓冲液50 mL，加10g/Lα-醋酸荼酚(用50%丙酮为溶剂)1.0mL，充分振荡，直至最初产生的混浊物(大部分)消失为止，加重氮盐(坚牢蓝B等)50mg，振荡，过滤后立即使用。
3．10 g/L甲绿水溶液。
操作步骤
1．固定新鲜干燥涂片置10%甲醛生理盐水中5min，自来水冲洗5min，待干。
2．显示放入基质液(37℃)1h，自来水冲洗。
甲基铝氧烷3．复染l0 g/L甲绿水溶液复染5~15min，自来水充分冲洗，待干，镜检。4．氟化钠抑制试验在1mL基质液中加入1.5mg氟化钠，其余按本染法进行，染步骤同上。
注意事顶
1．标本必须新鲜，应于取材后两天内染。
2．重氮盐的选择依次为坚牢蓝B、坚牢蓝RR及坚牢黑B的染效果为好。实验评价
1．α-NAE染是一种非特异性醋酶染，是判断急性白血病的常规染方法，在中性pH时用α-NAE作底物，正常单核细胞和原始单核及幼稚单核细胞均呈阳性反应，不被氟化钠抑制；其他血细胞则呈阴性或弱阳性反应，故α-NAE又称"单核细胞酶"，结合氟化钠抑制试验，对鉴别单核细胞白血病有重要价值。
2．有时单系细胞或粒系细胞、淋系细胞阳性较弱，因此难以判断加氟化钠后的抑制情况，且有时阳性细胞是由于假阳性所致。
四、过碘酸-雪夫染
染原理
过碘酸是氧化剂，使含有乙二醇基(-CHOH-CHOH)的多糖类物质(糖原、黏多糖、黏蛋白、糖蛋白及糖酯等)氧化，形成双醛基(-CHO-CHO)。醛基与雪夫试剂中的无品红结合，使其变成紫红，定位
于细胞内的多糖所在处。在过碘酸氧化前，用麦芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶处理标本，再糖原染，可鉴别是糖原还是其他多糖类物质，如被消化则是糖原，如不被消化则为其他多糖类物质。过碘酸-雪夫反应(periodic acid-Schiff reaction, PAS)，以前又称为
糖原染。
试剂器材
1．l0g/L高碘酸溶液
HIO4·2H2O 1g
蒸馏水加至100mL
2.雪夫染液取蒸馏水200 mL加人500 mL容量的三角烧瓶，加热至沸。移开火焰，缓慢加入碱性品红1g，继续加热2min，使之充分溶解后停止加热。冷却至60℃左右时，过滤，加入1mol/L盐酸20mL，混匀。待冷却至25℃加入偏重亚硫酸钠(Na2S2O5)2g混匀，置带塞的棕玻璃瓶中，放暗处24h 后加活性炭1g，振荡混匀吸附素，用滤纸过滤后密封在棕瓶内，放冰箱保存。
3．亚硫酸液
100g/L偏重亚硫酸钠6mL
1mol/L盐酸5mL
蒸馏水100mL
每次用前新鲜配制。
4．20g/L甲绿
甲绿2g
蒸馏水加至100mL
5．淀粉酶嚼石蜡刺激分泌唾液，收集唾液离心取上清液，内含淀粉酶，将麦芽糖淀粉酶0.1~1.0g溶于0.02mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.0)100mL中。操作步骤
1．固定新鲜干燥的涂片用95%乙醇固定10 min，蒸馏水冲洗，待干。2．如涂片需要消化，可加唾液或麦芽糖淀酶，置室温消化60 min，然后用蒸馏水冲洗。
3．10g/L高碘酸氧化15~20min，蒸馏水冲洗，待干。
4．置雪夫染液中室温染30~60 min。
5．用亚硫酸溶液冲洗3次后，再用自来水冲洗2~3min，待干。
6．20g/L甲绿复染10~20 min。
7．水洗，待干，镜检。
注意事顶
1．所用染缸及器具应十分清洁、手燥。
2．固定试剂不同，染效果不同。目前较常用的有95%乙醇、纯甲醇及甲醛蒸气，其中乙醇固定后糖原颗粒明显，各成熟粒细胞的反应有较明显的颜差异，易于判断阳性反应的程度，且唾液消化后的对照标本没有假阳性，故通常选用乙醇为固定剂。
3．10 g/L高碘酸溶液质量要保证，变黄则不能用，氧化时间要准确，否则将导致假阳性或假阴性。
4．碱性品红试剂对染的影响不同品牌的碱性品红染效果不一，碱性品红的质量是试验成败的关键因素之一。雪夫(Schiff)染液应避光保存，无，变红则失效。
5．染后标本应及早观察和记录，染后标本保存8天后，将逐渐褪，保存时间延长，褪更为明显。
实验评价
1．不同疾病血细胞的PAS染呈不同程度的阳性反应，它在诊断恶性红细胞系疾病中最有价值(尤其是强阳性)；但要注意的是恶性红细胞系疾病并不都是阳性，良性红细胞系疾病也并不是全为阴性。
2．PAS染在鉴别急性粒细胞白血病和急性单核细胞白血病中作用不大，而在诊断淋巴细胞白血病、鉴别脂质代谢障碍等疾病有一定价值。
五、中性粒细胞碱性磷酸酶染
染原理
中性粒细胞碱性磷酸酶染的方法有Gomori钙-钻法和kaplow偶氮偶联法，因为钙-钻法操作较为繁琐且所需时间长，偶氮偶联法的试剂盒操作方便，染时间短，故目前国内常用偶氮偶联法，下面介绍该方法的原理。kaplow偶氮偶联法成熟中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophilic alkaline phosphatase, NAP)在pH 9.6左右的碱性环境中，能水解基质液中的磷酸荼钠底物，释放出荼酚，后者与重氮盐偶联，生成不溶性的有沉淀，定位于细胞质酶活性所在之处。
试剂器材
1．10%甲醛甲醇固定液
甲醛25mL
甲醇75mL
混合后置4℃冰箱保存。
2．丙二醇缓冲液
(1)贮备液(0.2mol/L)
2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇10.5g
蒸馏水加至50O mL
溶解后保存冰箱内。
(2)应用液(0.05mol/L，pH 9.75)
0.2mol/L贮存液25mL
0.1mol/L盐酸5mL
蒸馏水加至100 rnL
3．基质孵育液(pH9.5~9.6) α-磷酸荼酚钠20mg溶于0.05mol/L丙二醇缓冲液20mL，再加坚牢紫酱GBC盐(或重氮坚牢蓝)20mg混合后用滤纸过滤，用前临时配制。
4．1g/L苏术素复染液取1g苏木素加到蒸馏水500mL中，加热煮沸，使苏木素溶解，再加入蒸馏水500mL、碘酸钠200mg、硫酸铝钾50g，充分混匀，置棕玻璃瓶中室温保存，使用前过滤。
操作步骤
1．固定新鲜干燥的涂片用10%甲醛固定液固定30s，蒸馏水轻轻冲洗30~60s，待干。
2．显示把涂片浸入基质孵育液中，在室温下温育10~15min(冬季放孵育箱温育)。蒸馏水冲洗2min。
3．复染置苏木素复染液复染5~8min，蒸馏水冲洗1~2min，待干，镜检。注意事顶
1．坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是NAP染成败的关键。
马弗罐
2．基质孵育液必须临用前新鲜配制。
3．所用的片子要新鲜。固定后，一般在一周内进行染。做NAP染时，
