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（收稿２００９—１２—１０；修回２０１０－０１—２４）
骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究进展’秦安清刘黎青△于娜◇周盛年△▲山东中医药大学基础医学院（济南２５０３５５） 【中图分类号】Ｑ２５【文献标识码】Ａ【文章编号】ｌＯＯＯ一７３６９（２０１０）０３～０３７８—０３
＊山东省科技攻关课题（ＮＯ：２００７ＧＧｌ０００２０１７）；山东省中医药管理局资助课题（ＮＯ：２００７—００６）
△通讯作者：刘黎青周盛年
▲山东大学齐鲁医院神经内科（济南２０００１２）
◇山东省昌乐县中医院（昌乐２６２４００）
骨髓问充质干细胞（ＢｏｎｅＭａｒｒｏｗＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＢＭＳＣｓ）又称骨髓基质干细胞，是骨髓细胞中除去造血干细胞（非粘附细胞）之外的细胞部分，作为成体干细胞之一，具有多项分化潜能，能向骨、软骨、肌肉、神经、角膜上皮细胞等中胚层或外胚层组织细胞分化，是组织工程中重要的种子细胞之一，并且具有取材方便，扩增迅速，可自体移植等特点，因
万方数据
陕西中医２０１０年第３１卷第３期３７９
此，具有广泛的应用前景［１６］。
１骨髓间充质千细胞定义、识另ｑ、表型鉴定
１．１骨髓问充质干细胞的定义骨髓间充质干细胞（ＢＭＳＣｓ）是存在于骨髓中的一种具有成骨潜能的细胞，在相差显微镜下，显示出成纤维细胞的外观，其主要形态是梭形，核纺锤形，体积较大；透射电镜下大部分表现为椭圆形。核大，染质分布稀疏，电子密度较低，含１个至多个核仁不等，胞质内细胞器少，相邻细胞问可见缝隙连接。因其呈成纤维细胞样生长，既往被称为集落形成单位成纤维细胞（ｃｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔｓｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓＣＦｕ—Ｆ），骨髓基质
成纤维细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｓｔｒｏｍａｌｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ），１９９１年Ｃａｐｌａｎ等将其命名为骨髓间充质干细胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＢＭＳＣｓ）［“。研究表明，骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，具有向骨、软骨、韧带、肌腱等中胚层组织及神经外胚层组织分化的能力，甚至还有研究表明ＢＭＳＣｓ可以分化为肝细胞和胰岛样细胞ＣＴ－ｓ］。ＢＭＳＣｓ固有的优势和特性，使其成为组织工程理想的种子细胞，在骨组织工程、软骨组织工程、神经组织修复及其他组织修复中得到广泛应用。
１．２骨髓问充质千细胞的分离纯化骨髓中的ＢＭＳＣｓ含量较低，约占有核细胞的０．００１％～Ｏ．０１％，因此如何分离纯化ＢＭＳＣｓ极为重要，目前主要有以下四种方法：贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法和免疫磁珠法［９。…，其中贴壁法根据ＢＭＳＣｓ具有在塑料培养瓶中贴壁生长，而血细胞和造血干细胞悬浮生长的特性对其进行分离，具有较为简单、易于掌握、不易发生污染等优点，比较适合于初次培养者Ｉ密度梯度法较为复杂，其原理是根据骨髓中各细胞成分的比重不同而分离ＢＭＳＣｓ，运用ＰｅｒｃｏＵ液（１．０７３９／ｍＬ）或者Ｆｉｅｏｌｌ液（１．０７７９／ｍＬ）对骨髓进行梯度离心，去除骨髓中的血液成分，获取界面的有核细胞进行培养，经密度梯度法离心后得到的细胞纯度较高；流式细胞仪法（ＦＡＣＳ）和免疫磁珠法（ＭＡＣＳ）的原理是根据细胞体积不同和细胞表面的一些特殊标志，用特异性抗体结合磁性进行细胞分选，由于目前尚未发现特异性很强的表面标志分子，因此很难应用于分离培养，此外，这两种方法对细胞活性有一定的影响。
双面英雄１．３表型鉴定方法ＢＭＳＣｓ的表型不一，具有间充质细胞、上皮细胞和内皮细胞的特点，因此一直没有发现ＢＭＳＣｓ的特异性表面标志物，大多数实验室通过ＢＭＳＣｓ不表达造血干细胞标记物（如ＣＤｌｌ、ＣＤ３ｌ、ＣＤ。５等），而表达ＣＤ．‘’ＣＤ，１、ＣＤ９０、ＣＤ。。。等标志来进行ＢＭＳＣｓ的初步鉴定。此外，Ｇａｎｇ［１１１等发现阶段特异性胚胎干细胞抗原４（ｓｔａｇｅ—ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｙｒｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ４）可用于鉴定ＢＭＳＣｓ。ＭａｒｔｉｎｅｚＩｈｚ］等通过ＲＴ—ＰＣＲ检测神经节苷脂ＧＤ２（ｎｅｕｒａｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅＧＤ２）合成酶表达的方法证实ＧＤｚ是区别ＢＭＳＣｓ和其他骨髓细胞的特异性标志物，从而提高了ＢＭＳＣｓ鉴定的效率和特异性。目前比较公认的具有相对特异性的ＢＭＳＣｓ标记物包括ＣＤ。ＣＤ，。及ＣＤ。。抗原。
２骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的实验研究目前，体外诱导ＢＭＳＣｓ分化为神经样细胞的方法主要有３种：ｗｏｏｄｂｕｒｙ［１３］等ＤＭＥＭ培养体系、Ｓａａｃｈｅｚ［“］等神经营养因子为基础的培养体系以及ＤｅｎｇＥｌ５］等的黄嘌呤和环腺苷酸的诱导方法。这些实验都有诱导剂，根据诱导剂的不同可分为中药制剂诱导剂和化学诱导剂。
２．１中药制剂诱导的实验研究伴随科技的进步，中药提纯技术不断提高，中药制剂作为诱导剂的研究得到了可喜的进展，其中多数为抗氧化性中药或中药制剂，如麝香、丹参、天麻、黄芩、刺五加、当归、肌萎灵等。刘金保［１６］等用当归注射液做为诱导剂，成功体外诱导大鼠ＢＭＳＣｓ分化为如何提高口语表达能力
神经细胞；董晓先［１７３等运用天麻诱导大鼠ＢＭＳＣｓ分化为神经元样细胞；王嫒［１８］等运用刺五加注射液体外诱导大鼠ＢＭＳＣｓ分化为神经元样细胞。中药作为诱导剂不仅能够成功的达到试验效果，而且具有某些方面的优势，如毒副作用小，可应用于人体移植等，一些研究表明ｐ巯基乙醇等诱导剂在诱导细胞的同时，存在细胞损伤从而使细胞的存活率降低，难以达到临床移植应用的大量缅胞要求，王继明ｎ们等入运用中药制剂肌萎灵注射液诱导入骨髓基质干细胞，发现中药肌萎灵不仅促进骨髓基质千细胞的增殖，而且能够促进骨髓基质干细胞向神经细胞的分化，同时又避免了一些常用诱导剂的副作用，从而有利于提高临床ＢＭＳＣｓ移植中枢神经系统疾病的疗效和安全。
２．２化学诱导荆的实验研究骨髓问充质干细胞具有旺盛的分裂增生能力和多向分化潜能。体外培养的骨髓间充质干细胞在不同的诱导因素下可以向不同的谱系分化。体外诱导ＢＭＳＣｓ分化神经元细胞采用的诱导剂主要是抗氧化剂和生长因子。如ｐ巯基乙醇、二甲基亚砜、丁化羟基苯甲醚，表皮生长因子、脑源性营养因子与视黄酸等。ＳａｎｃｈｅｚＲａｍｏｓ［１４］等用神经营养因子及ＡＴＲＡ为诱导剂建立了体外诱导ＢＭＳＣｓ向神经细胞分化的培养体系，但是神经元样细胞的阳性转化率仅为０．５％；Ｄｅｎｇ［１５１等用ＩＢＭＸ／ｄｂＣＡＭＰ诱导ＢＭＳＣｓ向神经元样细胞分化的阳性率为２５％；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ［１妇等用ｐ巯基乙醇、二甲基亚砜和丁化羟基苯甲醚等一些抗氧化剂成功诱导骨髓间充质干细胞分化为神经元，诱导后７８％的骨髓间充质干细胞表达神经元特有的标记如ＮＦ、ＮＳＥ、Ｎｅｓｔｉｎ等。２００７年，吴晓牧［２０］等在Ｗｏｏｄｂｕｒｙ
的基础上进行改造，联合运用ＥＧＦ、ＢＮＥ和ＡＴＲＡ作为诱导剂成功诱导ＢＭＳＣｓ分化为具有典型的神经元形体的细胞，其中７７％的细胞ＮＳＥ（神经元烯醇化酶）表达阳性，５０％的细胞Ｎｓｅｔｉｎ表达阳性，所有细胞ＧＦＡＰ均表达阴性。近些年来的研究发现骨髓间充质干细胞可以被诱导分化为特征类型的神经元。２００５年，Ｇｕｏ等口日用载有ＧＤＮＦ、ＩＬ一１、脑神经胶质细胞等条件培养，经体外诱导骨髓间充质干细胞可以分化成为多巴胺能神经元样细胞。
３ＢＭＳＣｓ分化为神经元的可能机制ＢＭＳＣｓ是一种多能分化的细胞，可在一定条件下增分化为多种细胞。随着研究的深入，人们对于骨髓间充质干细胞诱导分化的机制产生了浓厚的兴趣，不同的研究者对于骨髓间充质干细胞的分化机制提出了不同的假说，但是尚不明确，王相利乜纠采用Ｌ—ＤＥＭ、｝巯基乙醇诱导大鼠骨髓间充质干细胞，通过ＲＴ—ＰＣＲ法检测神经生长因子、神经生长因子受体ＴｒｋＡｍＲＮＡ表达变化后发现，神经生长因子在诱导分化前后稳定表达，神经生长因子受体ＴｒｋＡ在分化诱导后表达减少，因此认为神经生长因子／ＴｒｋＡ信号途径可能在骨髓间充质干细胞诱导分化为神经细胞
万方数据
３８０陕西中医２０１０年第３１卷第３期
的过程中起作用｝其实，ＢＭＳＣｓ可以分泌多种细胞因子，包括ＩＬ、ＮＧＦ、ＥＰＯ、ＬＩＦ、
ＣＳＦ２１、ＢＤＮＦ、ＶＥＧＦ等。这些因子均可调节神经细胞的生长、增殖、分化。此外，骨髓间充质干细胞还有促进内源性神经干细胞的增殖、分化、促进轴突再生、再髓鞘化的作用。
４展望ＢＭＳＣｓ具有体外扩增培养及自我更新的能力，转入外源基因后不影响其特性，因此成为基因修饰以缺陷性疾病的理想的靶细胞；其极高的分化潜能、复制能力和免疫抑制功能及横向分化能力使其在修复再生缺陷组织、中风、外伤及Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’Ｓ病方面具有广阔的前景，但是其中也存在许多问题，如ＢＭＳＣｓ在组织修复的同时可能定植于肿瘤组织，为肿瘤细胞的生长提供合适的微环境、外源性转染ＢＭＳＣｓ效率较低、如何获得高纯度的ＢＭＳＣｓ、ＢＭＳＣｓ是否会基因突变及有效控制其定向分化［２引、ＢＭＳＣｓ分化的神经细胞是否具有神经细胞的功能，能否与周围神经细胞有效整合、建立神经通路等。因此，探索分离有效成分的新方法。建立一套完整有效的体外培养、扩增、鉴定、定向分化诱导体系，在不改变其干细胞特性的前提下，实现快速大规模的扩增。为基础和临床研究提供充足的细胞来源成为亟待解决的问题。
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