游 伟 时宇静1 韩焱晶2 贾宝辉 图 娅3
(中国中医科学院广安门医院，北京100053;1中国中医科学院中药研究所，北京100700;
2中国中医科学院针灸研究所，北京100700;3北京中医药大学，北京100029)
摘 要 目的：观察电针对慢性应激模型大鼠糖皮质激素及其受体的影响，进而探讨电针抗抑郁的作用机制。方法:SD大鼠随机分为空白组、模型组、百优解组、束缚组、电针组、糖皮质激素拮抗剂组、电针加糖皮质激素拮抗剂组，每组10只。采用慢性应激结合孤养21d造模。选取!百会∀透!印堂∀穴电针慢性应激模型大鼠，用糖皮质激素受体拮抗剂RU486阻断下丘脑 垂体 肾上腺(H PA)轴的负反馈通路。放射免疫法检测肾上腺皮质酮含量，实时荧光定量逆转录 聚合酶链式反应法检测海马、下丘脑、垂体糖皮质激素受体(GR)mRNA的表达。结果：与空白组比较，束缚组大鼠肾上腺皮质酮的分泌明显增多(P<0 05)，而电针组与束缚组比较皮质酮的过度分泌明显降低(P<0 05)。束缚组大鼠GR m RNA在海马、下丘脑及垂体的表达显著下降(P<0 05)，电针组与束缚组比较海马、下丘脑、垂体GR的生成增多(P<0 05)。以上两指标，模型组和糖皮质激素拮抗剂组的变化与束缚组一致；与模型组比较，百优解组仅可明显升
高海马GR mRNA 的表达(P<0 05)；与糖皮质激素拮抗剂组比较，电针加糖皮质激素拮抗剂组可降低肾上腺皮质酮的含量(P<0 05)，升高海马GR mRNA的表达(P<0 05)，但其降低肾上腺皮质酮含量和升高下丘脑、垂体GR mRNA表达的作用均不及电针组(P<0 05)。结论：电针对糖皮质激素的过度分泌有直接的调控作用，并可通过增强GR mRNA的表达，改善H PA轴负反馈中枢的功能障碍。当H PA轴负反馈通路被阻断后，电针的作用减弱。
关键词 电针 抑郁 慢性应激 糖皮质激素受体表达 肾上腺皮质酮 海马 下丘脑 垂体 肾上腺轴 中图分类号R245 9+7 文献标志码A 文章编号1000 0607(2010)04 0261 06
Effect of Electroacupuncture of!Baihui∀(GV20) !Yintang∀(EX HN3)on the Expression of Glucocorticoid and Glucocorticoid Receptor mRNA of the C hronic Stress Model Rats
YO U W ei, SH I Yu jing1, H A N Y an jing2, JI A Bao hui, T U Y a3(Guang#anmen H os p ital,China A cad emy of Chinese M edical Sciences,Beij ing100053,China;1I ns titute of Chines e M ater ia Medica,China A cademy of Chines e M ed ical S ci ences,Beij ing100700;2I ns titute of A cu mox ibustion,China A cademy of Chinese M edical Sciences,Beij ing100700;3Bei j ing Univers ity o f Chines e M edicine,Beij ing100029)
ABSTRACT Objective To obser ve the effect of electroacupuncture(EA)on the expression of glucocor
ticoid(GC)mR NA and GC i n the hippocampus,hypothalamus and pituitary in depression rats so as to s tudy i ts m echanism underl ying EA resi s ting depression.Methods Seventy SD rats were random ized into normal control,model,Fluoxetine(Flu),cons trai nt stress,EA,R U 486(an antagoni st of GC)and EA+R U486groups(n=10/group).C hronic depression model was establi shed by l onely raising and chroni c unpredictable mild stress for21days.EA(2Hz,0 6m A)was applied to!Bai hui∀(GV20)and!Yintang∀(EX H N3) for20m in,once daily for21days.Subcutaneous injecti on of RU486(20m g/kg)was gi ven to the rats from the14th day on and con
项目来源：国家自然科学基金资助(30701121)
第一作者：游伟，男，硕士研究生。E mail:yoyo3535@126 com
通讯作者：贾宝辉(1976-)，女，博士，主治医师，研究方向：针刺神经系统疾病的机制研究。E m ail:m yrroossee@yahoo com cn 图娅，女，博士生导师，研究方向：针灸经典理论的现代研究。E mail:tuyab@263 n et
tinuous l y for7days in order to block the negati ve feedback reflex of hypothalam us pitui tary adrenal(HPA)axis.Cortisol(COR T) content of the adrenal gland tissue was detected by radi oimm unassay.The expression of GC receptor(GR)m RN A in the hippocam pus,hypothalam us and pitui ta
ry ti ss ues was determined by real time quanti tati ve reverse transcription polymer ase chain reaction (R T PC R).Results Com pared wi th the normal control group,adrenal C OR T content of m odel group was i ncreased s i gni ficantly (P<0 05),and in com pari son wi th model group,adrenal C ORT level of EA group decreased evi dently(P<0 05).Comparison between the R U486and EA+R U486groups s howed that the adrenal COR T content,and hippocam pal GR m RN A expres si on level of the latter were rem arkably lower than those of the former(P<0 05).Compared with the normal control gr oup,the expression level of GRmR N A of the hipppocampal and pituitary ti s sues i n the model,constraint str ess,and R U486groups,and those of the hy pothalamus in the constraint s tres s and RU486groups were down regulated significantly(P<0 05).In comparison with the con straint stress group,hippocam pal,hypothalamic and pituitary GR m RN A expression level in the EA group were upregulated cons i d erably(P<0 05).N o significant differences were found among model,Flu,constraint s tres s,R U486and EA+RU486groups in the ardenal C OR T contents,and hippocam pal,hypothalamic and pitui tary GR mR N A express i on levels(P>0 05).Conclusion E A can effecti v ely down regulate adrenal C OR T content and hippocampal GR m R N A expres sion and norm alize the fu nction of H PA axis n ega ti ve feed reflex in the depress ion rats,w hich m ay contri bute to its effect in relieving depres sion.
KEY W ORDS Electroacupuncture; Depression; C hronic stress; Glucocorticoi d receptor express i on; Adrenal corti costerone; Hippocam pus; Hypothalam us pitui tary adrenal axis
抑郁症的病因尚未完全阐明，但生活事件(life ev ents,LEs)，尤其是应激性生活事件起!扳机∀作用[1]。抑郁症发病前约92%的患者有LEs，提示LEs在抑郁症发生中起重要作用[2]。我们选择目前国外学者广泛采用的孤养抑郁模型与慢性轻度不可预见性的应激模型相结合建立抑郁动物模型展开研究。该模型通过各种应激刺激诱发动物行为的异常改变，具有高度的有效性，并可持续几个月，基本符合抑郁模型的要求，是目前国外文献中广泛使用的模型[3-4]。
抑郁症患者存在显著的神经内分泌改变，体现为下丘脑 垂体 肾上腺(hypothalamus pituitary ad r enal,H PA)轴的功能亢进，即H PA轴上肾上腺糖皮质激素(GC)的分泌过多，以及在海马、下丘脑和垂体3个部位,GC和糖皮质激素受体(GR)结合介导的H PA轴负反馈功能的障碍[5]。有报道称应用抗GC对重症抑郁效果很好，提示GC在抑郁的发病过程中起关键作用。本实验通过观察电针后慢性应激模型大鼠肾上腺GC和海马、下丘脑和垂体GR的改变，探讨电针抗抑郁作用的机制。
1 材料与方法
1 1 实验动物
SD大鼠，雄性，体重160~180g，由北京维通利华动物公司提供。除了实验期间的特殊要求外，其余时间动物均饲养于温度(18~25%)和湿度[(55& 2)]%相对较为恒定的动物饲养室，自然光线。1 2 试剂与仪器
皮质酮(cortisol,CORT)放免试剂盒(北京华英生物技术研究所);T rizol提取总RNA试剂盒(美国Inv itro gen公司)；逆转录 聚合酶链式反应试剂盒、T aqDNA聚合酶、dNT P、Access RT PCR system及琼脂糖(美国Promega公司);SYBR Green荧光染料(美国Gibco公司);SYBR Green PCR M aster M ix(美国MJ公司); actin、GR引物(北京奥科生物技术公司合成);DNA marker(北京邦定 泰克生物技术公司)。
182型 放射免疫计数仪(日本);9600型PCR 仪(美国Perkin Elm er公司);H V3000多用电泳仪(北京东方仪器厂);Labofug e400R高速低温离心机(德国H eraeus公司)；紫外分光光度计(意大利GBC公司)；凝胶扫描成像分析仪(美国Kodak公司);MicroBeta T rilux1450微量液体闪烁计数仪(美国Perkin E lmer公司);Prism7000型Real time Quantitative PCR system(美国M J公司)。
1 3 动物分组
通过开野实验将3min内水平运动次数加垂直运动次数不足30次或超过120次的大鼠剔除，然后按体重随机分组，每组10只。每笼5只，饲养7d 以适应环境。然后开始慢性应激程序和电针，除空白组仍养外，其余改为每笼1只孤养。∋空白组：无应激且养21d，简称Co n;(模型组：应激且孤养21d，简
称m odel;)百优解组：应激且孤养并给予百优解(盐酸氟西汀分散片,20mg/片，美国Eli
Lilly公司)21d，于每天应激刺激1h前，按0 18mg/kg 体重、0 018mg/mL浓度灌胃给药，简称Flu;∗束缚组：应激且孤养并给予与针刺时相同强度和时间的束缚21d，简称constraint stress;+电针组：应激且孤养并给予电针21d，简称EA;，糖皮质激素拮抗剂组：应激且孤养21d，并于造模的第14天开始每天给予腹部皮下注射RU486,20m g/kg，连续7d，简称RU486;−电针加糖皮质激素拮抗剂组：应激且孤养并给予电针21d，并于造模的第14天开始每天给予腹部皮下注射RU486,20mg/kg连续7d，简称EA+RU486。
1 4 模型制备
采用慢性应激模型结合孤养，根据文献[6]方法改进。造模动物全部孤养，接受21d各种不同的应激，包括冰水游泳(10%,5min)、夹尾(180s)、禁水(24h)、禁食(24h)、电击(电压为30V，电击5s，间歇5s，共进行120s)、昼夜颠倒(24h)、温箱(40%, 5min)，平均每种刺激使用3次。
1 5 电针方法
选取!印堂∀穴和!百会∀穴，使用H ANS LH 202型电针仪(北京华卫产业开发公司)，于每日进行应激刺激前1h进行电针。进针方向两穴相对，平刺进针，进针深度为0 5~1cm，电针频率为2H z，电流强度
为0 6mA，每次20min，每天1次，共电针21d。由于大鼠的!百会∀!印堂∀穴相距较近，在电针操作中需要注意避免短路。
1 6 检测指标
1 6 1 肾上腺CORT含量的测定
造模结束后快速断头，取肾上腺，立即称重后放入煮沸的生理盐水(1mL)中煮沸3min，加1m ol/L 冰醋酸0 5mL，于匀浆器中匀浆提取，再用1m ol/L 的NaOH0 5mL中和,4%离心(3000r/min) 30min，取上清液，放射免疫法测定CORT含量。
1 6
2 海马、下丘脑、垂体组织GR mRNA表达的检测
采用实时荧光定量逆转录 聚合酶链式反应法测定。
(1)总RNA的提取
取大鼠海马、下丘脑、垂体组织放入1mL玻璃匀浆器中，加入1mL T rizol试剂，充分匀浆,15~ 30%放
置5min，加入0 2mL氯仿，剧烈震荡15s, 15~30%放置2~3min，于2~8%12000r/m in离心15m in后，取水相，加入0 5m L异丙醇,-20%沉淀2h以上,2~8%12000r/min离心20m in，弃上清，沉淀中加入70%乙醇1m L，洗涤RNA，混匀, 2~8%7500r/m in离心5min，空气吹干样品，用30~50L DEPC处理过的水溶解RNA,55~60%孵育5min，取2L或3L RNA用DEPC处理过的水(或无RNA酶的T E缓冲液)稀释100倍。测定RNA浓度，并鉴定其纯度(紫外分光光度法)和完整性(电泳)，其余样品于-70%冻存。
(2)引物设计
GR：上游:5# ACC CT G CT A CAG TAC T CA T GG A 3#，下游:5# CTT GGC TCT TCA GAC CT T CCT 3#; actin上游:5# GGC TAC AGC T TC A CC ACC AC 3#，下游:5# T CA GGA GGA GCA AT G AT C TT G 3#。
根据基因库收录的相关基因mRN A序列，用Oligo6 0软件在5#和3#端分别设计需检测基因的引物，设计的引物通过互联网以Blast比对引物与基因库之间的同源性。
(3)逆转录反应
逆转录反应在9600型PCR仪上进行。反应条件如下:25%20min,42%50m in。
(4)定量PCR反应
实时荧光定量PCR反应在ABI Prism7000型荧光定量PCR仪上进行。PCR条件设置如下: 94%灭活2m in,94%变性30s、64%退火1min、70%延伸2min，共40个循环。循环结束后70%最后延伸7m in。反应结束后进行熔解曲线分析，以鉴定PCR产物的特异性。使用Sequence Detection System软件(v ersion1 0)分析PCR过程各检测样本的Ct(threshold o f cycle)值。
(5)相对定量的Ct值比较法(即2 !!Ct法)
2 !!Ct方法的数据分析：本实验使用相对定量的方法[1]，以 actin作为内对照，以空白组作为校准, 2 !!Ct是各处理组基因表达相对于1周龄的倍数改变。
相对含量的变化=2 !!Ct.100%
1 7 统计学处理
所有实验数据用均数&标准差(x&s)表示，应用SAS统计软件进行数据处理。在进行显著性检验时，多组间均数的两两比较采用析因设计方差分析、单因素方差分析等，再用Duncan检验,P<0 05时为差异有统计学意义。
2 结 果
2 1 电针对慢性应激模型大鼠肾上腺CORT 含量的影响
从图1可见，模型组、束缚组大鼠出现了肾上腺CORT 升高(与空白组比较P <0 05)；电针可显著改善肾上腺CORT 的分泌，使其降低(P <0 05)；百优解对肾上腺CORT 的高分泌也表现出一定的调节作用;RU 486组由于阻断了GR 受体，使负反馈受到抑制，从而影响肾上腺CORT 分泌，表现为肾上腺的CORT 含量增加较大(与空白组比较P <0 05)；电针加RU 486组与电针组比较，肾上腺CORT 含量升高(P <0 05)，但其含量较RU 486组有明显下调(P <0 05)。
2 2 电针对慢性应激模型大鼠海马、下丘脑、垂体GR m RNA 表达的影响2 2 1 总RNA 完整性鉴定
总RNA 完整性鉴定，各泳道均为3个不同片断的条带，即5S 、18S 、28S，且5S 灰度均明显低于18S 、28S 。说明各样品的mRNA 完整，未被RNA 酶降解。2 2 2 电针对慢性应激模型大鼠海马GR m RNA 表达的影响
从图2结果可以看出，模型组、束缚组及RU 486组大鼠海马GR m RNA 的表达显著降低(P <0 05)；电针组与束缚组比较，电针加RU 486组与RU 486组比较,GR mRNA 的表达均明显增多(P <0 05)；百优解组与模型组比较GR m RNA 的表达亦有所升高P <0 05
。
图1 电针对慢性应激大鼠肾上腺皮质酮水平的影响(!x &s ) Fig 1 Compariso n o f the cort isol (CO RT )levels o f the adr enal gland in rats o f the Con,depression mo del (model),co nstr aint stress,F luox etine (Flu),EA ,RU 486and EA +RU 486g r oups( x &s )
*
P <0 05与空白组比较(v s Con g ro up);#P <0 05与
模型组比较(v s model g roup);/
P <0 05与束缚组比较(vs
co nstr aint stress gr oup);0
P <0 05与电针组比较(vs EA
gr oup);
1
P <0 05与RU 486组比较(vs RU 486gr oup).
2 2
3 电针对慢性应激模型大鼠下丘脑GR mR NA 表达的影响
从图3可见，模型组的GR mRNA 表达量有下调的趋势；束缚组、RU 486组GR mRNA 的表达量与空白组比较显著降低(P <0 05)；电针组与束缚组比较GR m RNA 的表达显著升高(P <0 05)；电针加RU 486组与电针组比较GR m RNA 的表达量减少(P <0 05)；百优解组与模型组比较差异无统计学意义(P
>0 05)。
2 2 4 电针对慢性应激模型大鼠垂体GR m RNA 表达的影响
从图4可知，在慢性应激刺激下，大鼠垂体GR mRNA的表达量显著下调(P<0 05)，电针可以逆转这一变化(P<0 05)。RU486组GR m R NA的表达也显著降低(P<0 05)，且电针加RU 486组与电针组GR m RNA的表达量存在差异(P<0 05)。
图4 电针对慢性应激大鼠垂体糖皮质激素受体(GR) mRN A表达的影响(x&s)
Fig4 Effect of EA on the expr essio n of G R mRN A in the pituit ary o f the rats o f Co n,model,co nstr aint stress,F lu, EA,RU486,EA+RU486gr oups(x&s)
*P<0 05与空白组比较(v s Con g roup);#P<0 05与模型组比较(v s model g roup);/P<0 05与束缚组比较(vs co nstr aint stress gr oup);0P<0 05与电针组比较(v s EA gr oup).
3 讨 论
各种应激刺激都可使血中GC水平升高。我们的研究也证实，长期的慢性刺激可导致大鼠肾上腺的GC过度分泌。M ilebella[7]发现，抑郁症患者的H PA轴功能亢进是状态依赖的，即随着抑郁的缓解,H PA
轴功能亢进也逐步恢复正常。H PA轴反馈调节异常可能是由于GR功能降低所致。大量的研究[8]还显示，抑郁症病人常有高皮质激素血症和下丘脑GR对皮质激素(如地塞米松)的抑制不敏感，抑郁症患者地塞米松脱抑制发生率显著高于健康人，提示中枢GR过敏。通过实时荧光定量PCR 技术，我们检测了慢性应激模型大鼠海马、下丘脑、垂体GR mRNA的表达。由于肾上腺分泌的GC量增多，而3个负反馈中枢的GR mRNA表达量却有不同程度的降低，提示慢性应激模型大鼠存在中枢GR过敏，负反馈调节功能障碍。
纵观近年来电针抑郁症的实验研究，可以发现，电针抑郁症的作用机制是多途径的，这体现了针灸疾病整体、综合调整的特点。临床研究也显示，电针抑郁症有一定疗效且副作用少，能较好地改善抑郁伴随的焦虑、睡眠障碍等躯体症状。因此躯体不适主诉多、焦虑症状明显、年老体衰或体质敏感、不耐药物副反应的患者可首选针灸[9-10]。我们通过对现有针刺抗抑郁临床文献的研究，确定百会和印堂为该课题实验研究的针刺用穴。百会为督脉要穴，位居头之巅顶，为手足三阳经与督脉及足厥阴肝经之会，犹天之极星居北，为百脉聚会之处，可调补中气，健脑宁神，具开窍醒神之功，是宁心调神之要穴[11]。印堂穴虽属经外奇穴，但因取穴在两眉头连线的中点，位于督脉循行路线上，故与督脉相通。本着!经脉所过，主治所及∀，其对于与脑有关的神志病有着肯定的作用[12]。两穴透刺共奏运行气血、开窍醒神之功。
电针!百会∀透!印堂∀使慢性应激模型大鼠肾上腺分泌的GC减少，同时可上调应激大鼠海马、下丘脑和
垂体的GR mRN A表达。电针加RU486组和RU486组比较GC的分泌显著减少，提示电针对GC的过度分泌存在直接的下调作用。电针加RU 486组与电针组比较GR mRNA在下丘脑、垂体的表达显著降低，说明当H PA轴负反馈通路被阻断后，电针的作用减弱。我们推测电针的作用机制可能为:(1)由于GR分为∀、 两种亚型,∀为功能型, 为抑制型，正常情况下,∀型占主动，而在某些疾病时会发生∀和 互换, 亚型表达增强，结果造成GR受抑制。电针可增强∀亚型的表达，下调 亚型的表达，从而增加GR的表达[13]。(2)近几年来，研究人员用放射配体结合法证明GR中可能有低亲和力的GR L存在，其kd在10-6m ol/L数量级，而给患者静脉注射有效果的大剂量地塞米松(5m g/kg)时，血浆中的地塞米松浓度恰好为10-6m ol/L。休克时GR减少，如果减少的幅度不超过50%，血浆中GC的浓度只要达到10-7mo l/L (GC的kd值的10倍)即可与约90%的GR结合，使GC GR的功能得以满足机体的需要；但如果GR 减少到50%以下，则必须借助于和GR L的结合才能使GC GR的功能达到正常水平[14]。电针可增强GR L的表达，从而增大GC GR结合率，改善负反馈调节。(3)电针通过降低H PA轴激素的分泌，间接调控GR m RNA的表达。
本实验中百优解组各指标的变化与模型组比较
