一种酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂及其在真菌毒素去除中的应用

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1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂及其在真菌毒素去除中的应用。

背景技术：

2.真菌毒素具有高毒性和强化学稳定性，常存在于谷物和动物制品中，对人和动物具有毒性、致癌性、致畸性和诱变性活性，长期摄入真菌毒素超标的食物和饲料对人和动物具有严重的急慢性毒害作用，能够导致人类和动物的疾病和死亡，谷物和食品中造成污染的真菌毒素成为了热点问题。因此发展高效的真菌毒素降解方法，对谷物、饲料、食品的安全和人类、动物的健康具有重要意义。
3.现阶段降解真菌毒素的方法中，生物酶法催化降解真菌毒素产物毒性明显降低甚至无毒，是一种重要的真菌毒素降解方法，具有高效、绿、反应条件温和等特点，可以避免复杂的操作、特殊的设备以及较高的环境要求。但是使用游离酶进行催化降解，酶活性容易受到环境条件的影响，稳定性差，不利于回收，使成本增加，限制了在工业上的广泛应用。芬顿反应是利用过氧化氢和纳米铁磁合成羟基自由基的一种高效、简便的生成活性氧的方法，已广泛应用于各种有机污染物的降解。目前将芬顿反应应用于真菌毒素的降解未见报道。而在传统的芬顿反应中，过氧化氢不稳定，当一次加入过多时容易引起羟基自由基猝灭；另一方面，芬顿反应需要酸性环境，有利于铁离子的相互稳定转化，避免铁离子沉淀，但酸性试剂添加过多，会造成环境污染。
4.将芬顿反应与酶催化氧化反应相结合是提高羟自由基生产效率的一种重要方法。据文献报道，huang等利用游离的葡萄糖氧化酶和亚铁离子的级联反应生成羟自由基，催化降解三氯乙烯(浓度为10mg/l)，8小时内催化降解了78％，操作简单，但是无法回收利用，造成了成本增加(y.huang，h.liu，s.liu，c.li，s.h.yuan，chemosphere，253，126648.(2020))；aber等将葡萄糖氧化酶固定在磁铁矿上，降解染料酸黄12(浓度为12mg/l)，2小时降解了62.27％，利用磁性易于回收，但是降解效率一般(s.aber，e.mahmoudikia，a.karimi，f.mahdizadeh，water air soil pollut，227，93.(2016))。因此，目前关于酶-金属级联催化的芬顿反应仍存在很多问题，包括回收利用难、成本高、催化效率低、催化慢、催化剂制备条件不佳等。存在的技术瓶颈在于，目前所用的固定化载体的纳米孔径小、传质阻力大。
5.因此，现有技术还有待于改进和发展，开发一种高效催化、稳定、可重复使用的新型复合催化剂并将其应用于降解真菌毒素具有及其重要的意义。

技术实现要素：

6.为解决酶-金属级联的芬顿反应中不易于分离回收、催化效率低的问题，本发明提供了一种酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂及其制备方法，利用介孔结构的纳米花状
共价有机框架为载体通过原位还原的方法固定金属颗粒，最后通过物理吸附酶形成。该方法制备的复合催化剂，通过酶和金属协同催化以及介孔共价有机框架吸附的底物富集，高效去除真菌毒素，不仅具有级联催化的芬顿反应的优势，同时易于回收且具有良好的催化活性和稳定性，可重复使用，在食品和环境等领域具有很好的应用前景。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.一种酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂，其制备方法为利用共价有机框架为载体，通过共沉淀的方法将金属离子原位还原成金属颗粒固定在共价有机框架上，最后经物理吸附酶形成。
9.进一步地，所述酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂由酶、金属纳米颗粒和纳米花状介孔共价有机框架组成；所述金属颗粒为磁性四氧化三铁颗粒；所述酶为葡萄糖氧化酶；所述共价有机框架形貌为纳米花状，孔径为2-50nm。
10.本发明进一步提供了上述酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂的制备方法，步骤如下：
11.(1)合成纳米花状介孔共价有机框架：均苯三甲醛与对二苯胺按质量比1～3∶1溶解在1，4-二氧六环中，加入乙酸反应0.4～0.6小时，真空干燥得到黄固体；
12.(2)合成金属-介孔共价有机框架：将共价有机框架加入到fecl3溶液中，搅拌，fe
3+
通过物理吸附在共价有机框架上，结束后离心去除未吸附上的fe
3+
，无氧条件下加入fecl2溶液和氨水继续加热搅拌反应。反应结束后在外部磁场下回收得到；
13.(3)合成酶-金属-介孔共价有机框架：将金属-共价有机框架加入含酶的水溶液中，酶经过物理吸附结合在金属-介孔共价有机框架表面合成。
14.进一步地，所述步骤(1）中均苯三甲醛与对二苯胺的质量比为2∶1。
15.进一步地，所述步骤(1）中合成条件为120℃，孵育时间为3天。
16.进一步地，所述步骤(1)中离心转速为3000-8000rpm，离心时间为3-8min。
17.进一步地，所述步骤(1）中干燥方式为真空干燥，干燥温度为80℃。
18.进一步地，所述步骤(2)中fecl3与fecl2的摩尔比为2∶1。
19.进一步地，所述步骤(2）中fecl3的浓度为0.04～0.12m，fecl2的浓度为0.02～0.06m。
20.进一步地，所述步骤(2)中合成条件为水浴50℃，搅拌反应时间为30-60分钟。
21.进一步地，所述步骤(3)中酶溶液的浓度为0.01-1mg/ml。
22.进一步地，所述步骤(3)中合成条件为0-37℃，反应时间3-24h。
23.进一步地，所述步骤(3)中合成反应结束后通过磁分离获得花状固定化酶催化剂。
24.所述步骤(3)中干燥方式选自冷冻干燥、真空干燥、自然风干中的一种。
25.本发明进一步提供了一种利用酶-金属-介孔共价有机框架去除真菌毒素的应用，包括以下步骤：
26.(1）解毒处理：往真菌毒素水溶液中加入上述制备的酶-金属-共价有机框架复合催化剂，加入葡萄糖，搅拌反应；
27.(2）酶-金属-共价有机框架复合催化剂重复使用：磁性分离，催化剂沉淀经洗涤、干燥后重复使用。
28.进一步地，所述步骤(1)中真菌毒素浓度10-250ppb。
29.进一步地，所述步骤(1)中酶-金属-共价有机框架复合催化剂的浓度为0.1-1mg/ml。
30.进一步地，所述步骤(1)中葡萄糖浓度为5-200mm。
31.进一步地，所述步骤(1)中反应温度为25-55℃，搅拌转速为100-300rpm，反应时间为2-24h。
32.进一步地，所述步骤(1)中溶液ph值为3-7。
33.进一步地，所述步骤(2)中干燥方式选白冷冻干燥、真空干燥、自然风干中的一种。
34.本发明具有以下优点：
35.(1)本发明的酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂通过分区域将葡萄糖氧化酶和磁性四氧化三铁纳米颗粒共固定化在纳米花状介孔共价有机框架上，具有高比表面积、高活性和高稳定性等优点，能够高效催化真菌毒素降解和吸附，在外加磁场条件下，催化剂被回收，可多次重复使用。
36.(2)本发明的酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂制备方法简便，能高效降解去除真菌毒素，在食品安全和环境保护等领域具有很好的应用前景。
附图说明
37.图1为实施例1所制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂的扫描电镜图。
38.图2为实施例4中葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂在不同葡萄糖浓度下降解黄曲霉毒素b1的催化效率。
39.图3为实施例5中在不同葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂浓度下对黄曲霉毒素b1的去除效率。
40.图4为实施例6中葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂在不同ph下降解黄曲霉毒素b1的催化活性。
41.图5为葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂处理黄曲霉毒素b1、赭曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的去除效率。
42.图6为比较葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂与四氧化三铁-共价有机框架催化剂降解黄曲霉毒素b1的催化效率。
43.图7为葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂的重复使用性。
具体实施方式
44.下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。
45.实施例1
46.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂的制备。
47.48mg均苯三甲醛和24mg对苯二胺溶解在1，4-二氧六环中，然后在混合物中加入乙酸。搅拌0.5小时，得到黄固体，将固体120℃孵育3天。孵育结束后将固体8000rpm离心3分钟，然后放入80℃真空干燥箱得到花状共价有机框架。
48.将2mg共价有机框架加入0.06m fecl3溶液，吸附3小时。将固体离心洗涤，加入2ml去离子水，加入400μl 0.03m fecl2溶液，通入氮气除氧，再慢慢加入800μl氨水，反应30分
钟。反应结束后在外部磁场下回收得到四氧化三铁-共价有机框架。
49.将10mg四氧化三铁-共价有机框架加入到2ml 1mg/ml葡萄糖氧化酶溶液中，室温下反应3小时。结束后磁分离洗涤，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂。
50.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂中酶活性为32.4u/mg，金属催化剂催化黄曲霉毒素b1的转换频率为16.9h-1
。本实施例制备的所制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂的扫描电镜图如图1所示，从图中可以看出，共价有机框架形貌为纳米花状，金属颗粒尺寸为8.9nm，复合催化剂平均孔径为18nm。
51.实施例2
52.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂的制备。
53.96mg均苯三甲醛和48mg对苯二胺溶解在1，4-二氧六环中，然后在混合物中加入乙酸。搅拌0.5小时，得到黄固体，将固体120℃孵育3天。孵育结束后将固体5000rpm离心5分钟，然后放入80℃真空干燥箱得到花状共价有机框架。
54.将2mg共价有机框架加入0.04m fecl3溶液，吸附3小时。将固体离心洗涤，加入2ml去离子水，加入400μl 0.02m fecl2溶液，通入氮气除氧，再慢慢加入800μl氨水，反应45分钟。反应结束后在外部磁场下回收得到四氧化三铁-共价有机框架。
55.将10mg四氧化三铁-共价有机框架加入到2ml 0.01mg/ml葡萄糖氧化酶溶液中，室温下反应12小时。结束后磁分离洗涤，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂。
56.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂中酶活性为35.7u/mg，金属催化剂催化黄曲霉毒素b1的转换频率为19.6h-1
。金属颗粒尺寸为6.7nm，复合催化剂平均孔径为39nm。
57.实施例3
58.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂的制备。
59.48mg均苯三甲醛和24mg对苯二胺溶解在1，4-二氧六环中，然后在混合物中加入乙酸。搅拌0.5小时，得到黄固体，将固体120℃孵育3天。孵育结束后将固体3000rpm离心8分钟，然后放入80℃真空干燥箱得到花状共价有机框架。
60.将2mg共价有机框架加入0.12m fecl3溶液，吸附3小时。将固体离心洗涤，加入2ml去离子水，加入400μl 0.06m fecl2溶液，通入氮气除氧，再慢慢加入800μl氨水，反应60分钟。反应结束后在外部磁场下回收得到四氧化三铁-共价有机框架。
61.将10mg四氧化三铁-共价有机框架加入到2ml 0.5mg/ml葡萄糖氧化酶溶液中，室温下反应24小时。结束后磁分离洗涤，冷冻干燥得到葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂。
62.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂中酶活性为28.2u/mg，金属催化剂催化黄曲霉毒素b1的转换频率为22.3h-1
。金属颗粒尺寸为12nm，复合催化剂平均孔径为11nm。
63.实施例4
64.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂在不同葡萄糖浓度下降解黄曲霉毒素b1的催化效率。
65.具体步骤如下：反应溶液由200ng/ml黄曲霉毒素b1，0.5mg/ml实施例1制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂和不同浓度的葡萄糖(1mm、10mm、50mm、100mm和200mm)组成。调初始ph值为5，室温下200rpm搅拌反应2h。反应结束后磁吸分离，将催化剂用超纯水洗涤后重悬于原体积的超纯水即可重复利用。
66.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂在不同葡萄糖浓度下降解黄曲霉毒素b1的催化效率如图2所示，从图中可以看出当葡萄糖浓度为50mm时，可以降解38％的黄曲霉毒素b1，高于其他葡萄糖浓度的降解效率。
67.实施例5
68.在不同葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂浓度下对黄曲霉毒素b1的去除效率。
69.具体步骤如下：反应溶液由100ng/ml黄曲霉毒素b1，100mm葡萄糖和不同浓度的实施例1制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂(0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml和1mg/ml)组成。调初始ph值为5，室温下200rpm搅拌反应12h。反应结束后磁吸分离，将催化剂用超纯水洗涤后重悬于原体积的超纯水即可重复利用。
70.在不同葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂浓度下对黄曲霉毒素b1的去除效率如图3所示，从图中可以看出浓度为0.5mg/ml的催化剂对黄曲霉毒素b1的去除效率为97％，0.75mg/ml和1mg/ml的催化剂对黄曲霉毒素b1的去除效率为100％。
71.实施例6
72.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂在不同ph下降解黄曲霉毒素b1的催化活性。
73.具体步骤如下：反应溶液由100ng/ml黄曲霉毒素b1，50mm葡萄糖和0.5mg/ml实施例1制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂组成。分别调初始ph值为3、4、5、6和7，室温下200rpm搅拌反应2h。
74.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂在不同ph下降解黄曲霉毒素b1的催化活性如图4所示，从图中可以看出葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂在ph范围3-7有稳定的催化活性，ph为5时，催化活性最高。
75.实施例7
76.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂去除赭曲霉毒素。
77.反应溶液由1μg/ml赭曲霉毒素，50mm葡萄糖和0.5mg/ml实施例1制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂组成。调初始ph值为5，室温下200rpm搅拌反应24h。反应结束后磁吸分离，将催化剂用超纯水洗涤后重悬于原体积的超纯水即可重复利用。
78.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂对赭曲霉毒素的去除效率为92％。
79.实施例8
80.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂降解去除玉米赤霉烯酮。
81.反应溶液由1μg/ml玉米赤霉烯酮，50mm葡萄糖和0.5mg/ml实施例1制备的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂组成。调初始ph值为5，室温下200rpm搅拌反
应2h。反应结束后磁吸分离，将催化剂用超纯水洗涤后重悬于原体积的超纯水即可重复利用。
82.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂对玉米赤霉烯酮的去除效率为86％。
83.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂处理黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素(ota)和玉米赤霉烯酮(zen)的去除效率如图5所示。
84.对比例1
85.以传统四氧化三铁-介孔共价有机框架催化剂降解去除黄曲霉毒素b1作为对比。
86.传统四氧化三铁-共价有机框架催化剂的芬顿反应体系与葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂的级联反应体系有差异，过氧化氢产生方式以及ph的调机制不一样，进而影响催化效率。在本对比例中探讨级联反应体系对真菌毒素催化降解的影响。
87.具体步骤如下：首先分别取相同催化活性的实施例1中制备的四氧化三铁-共价有机框架和葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架，取两只离心管，1号离心管加入0.15mg/ml葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架、50mm葡萄糖和100ng/ml黄曲霉毒素b1，2号离心管加入等量四氧化三铁-共价有机框架、等量过氧化氢和100ng/ml黄曲霉毒素b1，混匀。调初始ph值为5，室温下200rpm搅拌反应4h，反应结束后磁吸分离。经测定上述两组实验反应溶液中黄曲霉毒素b1含量的差异，代表了催化剂对毒素降解效率的差异。
88.葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂(1号管)与四氧化三铁-共价有机框架催化剂(2号管）降解黄曲霉毒素b1的催化效率比较如图6所示，可以看出葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂对黄曲霉毒素b1的降解效率是传统四氧化三铁-共价有机框架催化剂的3.5倍。
89.实施例9
90.将每次催化降解反应结束后的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-介孔共价有机框架复合催化剂进行磁性分离回收、洗涤、干燥后再次进行真菌毒素降解实验，连续10个循环中以0.75mg/ml的葡萄糖氧化酶-四氧化三铁-共价有机框架复合催化剂重复降解黄曲霉毒素b1溶液，以验证其稳定性和可重复使用性。如图7所示，多次循环后催化剂的催化效果降低程度较少，7次循环后其催化效果依旧能达到90％以上，循环使用8次后仍然保持80％左右的初始活性，表明制备的复合催化剂具备良好的稳定性和可循环利用性。
91.上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。

技术特征：

1.一种酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂，其特征在于，所述复合催化剂由酶、金属纳米颗粒和纳米花状介孔共价有机框架组成；所述金属颗粒为磁性四氧化三铁颗粒；所述酶为葡萄糖氧化酶；所述介孔共价有机框架形貌为纳米花状，孔径为2-50nm；所述葡萄糖氧化酶和磁性四氧化三铁纳米颗粒共固定化在纳米花状介孔共价有机框架上；所述复合催化剂的制备方法包括以下步骤：(1)合成纳米花状介孔共价有机框架：均苯三甲醛与对二苯胺按质量比1～3：1溶解在1，4-二氧六环中，加入乙酸反应0.4～0.6小时，将得到的黄固体孵育一段时间后，再经离心处理和真空干燥得到纳米花状共价有机框架；(2)合成金属-介孔共价有机框架：将纳米花状介孔共价有机框架加入到fecl3溶液中，fe
3+
通过物理吸附在共价有机框架上，先后加入fecl2溶液和氨水加热搅拌反应，反应结束后在外部磁场下回收得到金属-介孔共价有机框架；(3)合成酶-金属-介孔共价有机框架：将金属-介孔共价有机框架加入含葡萄糖氧化酶的水溶液中，葡萄糖氧化酶经过物理吸附结合在金属-介孔共价有机框架表面，反应结束后通过磁分离获得花状固定化的酶-金属-纳米花状介孔共价有机框架。2.根据权利要求1所述的酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂，其特征在于，所述步骤(2)中fecl3与fecl2的摩尔比为2：1，fecl3的浓度为0.04～0.12mm，fecl2的浓度为0.02～0.06mm。3.权利要求1或2所述的一种利用酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂在真菌毒素去除中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用方法具体为：在含真菌毒素水溶液中加入所述酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂，加入葡萄糖，搅拌反应，催化真菌毒素的降解。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：含真菌毒素的水溶液ph值调节为3-7。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述真菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、呕吐毒素、玉米赤霉烯酮中的至少一种。7.根据权利要求4至6任一所述的应用，其特征在于，降解反应后催化剂可回收重复利用，具体步骤为：真菌毒素降解反应后的产物经过磁性分离，得到不含真菌毒素的水溶液和催化剂沉淀，催化剂沉淀经洗涤、干燥后重复使用。

技术总结

本发明公开了一种酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂及其在真菌毒素去除中的应用，属于生物技术领域。该复合催化剂利用纳米花状介孔共价有机框架为载体，通过原位还原法在载体内部合成金属颗粒，通过物理吸附在载体表面固定酶，在介孔共价有机框架上分区域共固定化酶和金属纳米颗粒。该酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂对真菌毒素有强吸附作用，且同时具有高的酶和金属催化活性，通过强吸附作用和酶与金属协同催化作用，应用于高效去除真菌毒素。该复合催化剂具有磁响应，有良好的重复使用性能。本发明提供的酶-金属-介孔共价有机框架复合催化剂适用性广，制备方法简便，易于工业化，具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。