敲除PRMT1基因的sgRNA及PRMT1基因敲除细胞系的构建方法和应用

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敲除prmt1基因的sgrna及prmt1基因敲除细胞系的构建方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及敲除prmt1基因的sgrna及prmt1基因敲除细胞系的构建方法和应用。

背景技术：

2.基因组操作技术是基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。通过人为操作引起基因组特定碱基插入、缺失或替换等，对基因组进行精确修饰和定向编辑的基因组编辑(genome editing)技术的出现使得生命科学的各大领域有了新的进步，并且被广泛应用于基础研究和临床等方面。早期开发的基因编辑技术对细胞活性的损伤较大，插入效率较低，因此，其应用较为受限。crispr-cas9基因编辑技术为衍生的第三代新型基因编辑技术，由cas9核酸酶和特异性的导向rna(sgrna)组合构成，该技术应用范围广泛，操作编辑，具有广阔的应用前景。
3.crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出的特有免疫系统～crispr系统。利用这个系统，细菌可以把病毒基因从自己的染体上切除。crispr-cas9最早来源于细菌/古细菌的一种获得性免疫防疫机制，经人工改造开发得到，是利用单链导向rna(sgrna)介导的一种特异性靶向基因组编辑技术。人为设计一种靶向特定基因组的sgrna，转染进入细胞，sgrna自由扩散进入细胞核，带有入核序列的cas9核酸酶进入细胞核，cas9定向结合sgrna靶向的基因组pam序列并进行高效切割，切割后的基因组发生断裂，并激发细胞固有的同源重组修复机制和非同源末端自我修复过程，实现对基因组特定位点的精确编辑和修饰。相比于第一代第二代基因编辑技术，crispr-cas9基因编辑技术能大规模实现基因精准编辑，使用便捷，编辑效率高，操作简便，成本低廉，适用范围广泛，为基因组定向改造、调控与应用带来巨大应用前景，因此，该技术获得2021年诺贝尔化学奖，目前已深度应用在精准医疗，胚胎基因编辑等领域。
4.宿主精氨酸甲基转移酶1(protein arginine methyl transferase 1,prmt1)是蛋白质精氨酸甲基转移酶家族中的一个成员，该家族所有成员均可催化底物蛋白发生单甲基精氨酸修饰，并增加第二个甲基，产生一个不对称的二甲基精氨酸修饰，prmt1属于i型prmt，可催化底物蛋白发生不对称二甲基精氨酸修饰，目前认为，多数精氨酸甲基化修饰位点符合r gg，rg和rxr重复序列。目前以报道prmt1发挥甲基酶活性调节众多底物，如组蛋白、pias1、hnrnpa1等，进而调节细胞信号通路的转导、转录调节和rna代谢等。鸡源存在5个prmt成员，prmt1，prmt3，prmt4，prmt5和prmt7，不存在prmt2，prmt6，prmt8和prmt9。crispr-cas9基因编辑虽然广泛应用于哺乳动物细胞和植物细胞，但是在低等生物，非哺乳动物细胞基因编辑应用仍未广泛开展，至今未构建出鸡源prmt1基因敲除的df-1细胞株。
5.传染性法氏囊病病毒(ibdv)为禽双rna病毒科唯一成员，主要攻击3-5周龄的雏
鸡，损害雏鸡的免疫中枢器官法氏囊，破坏雏鸡的免疫机能，导致雏鸡免疫功能低下，引起继发感染，大大提高雏鸡死亡率，俗称“鸡的艾滋病”，开展ibdv的基础研究对防控ibdv至关重要，因此，通过crispr-cas9基因编辑技术构建抑制ibdv复制的细胞株对研究ibdv特征意义重大。

技术实现要素：

6.有关鸡源prmt1蛋白的生物学功能，对干扰素调节及病毒复制的作用仍然未知。基于上述存在的问题，本发明首先提供了一种靶向prmt1基因的高效sgrna(核苷酸序列为：5'-gggaatcgggtcggatccat-3')，该sgrna可特异性靶向prmt1，并介导crsipr-cas9技术实现df-1细胞完全敲除prmt1基因，获得稳定敲除prmt1基因的df-1细胞株，该敲除细胞株干扰素诱导能力显著提高，而且能显著抑制ibdv的复制。能够应用在调节干扰素水平和抑制法氏囊病病毒复制的领域中(例如以药物、组合物、调控剂等形式)。
7.本发明的另一目的在于提供抑制prmt1基因/蛋白表达的试剂在制备预防或法氏囊病病毒感染药物中的应用，所述试剂包括上述的sgrna和cas9蛋白的mrna序列。
8.本发明的另一目的在于提供一种基于crsipr技术构建prmt1基因敲除细胞株的方法，包括以下步骤：
9.(1)根据上述的敲除prmt1基因的sgrna，设计两条反向互补核苷酸链，分别为：f：5'-caccggggaatcgggtcggatccat-3'和r：5'-aaacatggatccgacccgattcccc-3'；将上述两条反向互补核苷酸链酸链变性、退火形成双链；
10.(2)将步骤(1)得到的双链与酶切后的cas9载体进行连接，得到重组敲除表达载体；
11.(3)将步骤(2)得到的重组表达载体使用exfet2000转染试剂转染鸡成纤维细胞系df-1细胞，经过继续培养、嘌呤霉素筛选及单克隆化筛选，得到prmt1基因敲除细胞株。
12.优选地，在上述方法的步骤(2)中，cas9载体为lenticrisprv2载体。
13.优选地，在上述方法的步骤(3)中，df-1细胞为处于对数生长期的细胞。
14.优选地，在上述方法的步骤(3)中，嘌呤霉素筛选中的嘌呤霉素的浓度为2μg/ml。更优选地，嘌呤霉素筛选的操作具体为：转染24h后，用含2μg/ml的嘌呤霉素的10％fbs的mem细胞培养液培养24h，然后更换为含2μg/ml的嘌呤霉素的10％fbs继续培养24h，然后再更换为含2μg/ml的嘌呤霉素的10％fbs继续培养24h，实现嘌呤霉素筛选。
15.本发明的有益效果为：本发明基于crispr/cas9技术提供了一种靶向敲除prmt1基因的sgdna，该sgrna能够特异性靶向prmt1基因并结合crispr-cas9技术实现宿主细胞完全敲除prmt1基因，获得稳定敲除prmt1基因的df-1细胞株，该敲除细胞株干扰素诱导能力显著提高，而且能显著抑制ibdv的复制，为开展ibdv基础研究提供了有力工具，敲除prmt1的鸡育种工作提供了科学依据。
附图说明
16.图1所示为prmt1 sgrna构建进入lenticrispr/cas9载体测序图；
17.图2所示为prmt1 sgrna酶切效率检测图；
18.图3所示为prmt1基因敲除单克隆细胞prmt1蛋白western blotting检测结果图；
19.图4所示为敲除细胞株prmt1基因测序结果图；
20.图5所示为prmt1敲除细胞株与正常细胞系生长形态图；
21.图6所示为prmt1敲除细胞株与正常细胞系增值活性图；
22.图7所示为prmt1敲除细胞株干扰素检qpcr测结果图；
23.图8所示为ibdv在prmt1敲除细胞株中复制水平的qpcr检测结果图；
24.图9所示为ibdv在prmt1敲除细胞株中复制水平的western blotting检测结果图；
25.图10所示为ibdv在prmt1敲除细胞株中复制水平的tcid50检测结果图。
具体实施方式
26.以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。
27.实施例1：基于crispr/cas9技术构建鸡源prmt1基因敲除细胞株
28.1.sgrna设计与合成
29.根据ncbi-genbank公布的鸡源prmt1基因(101750306)下载相应核苷酸序列并设计引物。引物序列如下：
30.上游引物sgrna-f:5'-caccggggaatcgggtcggatccat-3'；
31.下游引物sgrna-r:5'-aaacatggatccgacccgattcccc-3'。
32.2.重组基因敲除表达质粒lenticrisprv2-prmt1/sgrna的构建
33.(1)退火：将上下游引物等量混匀，采用沸水浴自然降温的方法进行退火。
34.(2)酶切：抽提新鲜载体lenticrisprv2(质粒图谱见addgene:#52961，https://www.ad dgene.org/)，利用bsmbi限制性内切酶进行酶切，37℃酶切反应2h。酶切体系如下：
[0035][0036]
(3)胶回收：酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后使用胶回收试剂盒进行割胶纯化，具体步骤如下：
[0037]
(a)1％琼脂糖凝胶电泳后在紫外灯照射下进行切胶，将切下的凝胶块放入2.0ml离心管汇总；
[0038]
(b)对凝胶块进行称重，每0.1g凝胶块加入200μl buffer a，置于55℃水浴锅中作用20min，期间可适当晃动，加速融化，直至凝胶块完全融化；
[0039]
(c)向(b)中加入等量体积的buffer b，并充分混匀；
[0040]
(d)将步骤(c)中的混合溶液转移至装有套管的离心结合柱中，10，000r/min室温离心30s，弃掉底物废液，离心3次，直至所有混合容易全部结合上离心柱；
[0041]
(e)再向结合柱离心管中加入500μl wash buffer a，10,000r/min室温离心30s，弃掉收集管废液；
[0042]
(f)再向结合柱离心管中加入500μl wash buffer b，10,000r/min室温离心30s，弃掉废液；
[0043]
(g)将步骤(f)中的离心柱10,000r/min空离2min，并室温开盖静止2min；
[0044]
(h)将离心柱放入无菌1.5ml离心管中，向离心柱中加入50μl洗脱液，10,000r/mi n室温离心1min，即可得到纯化的dna溶液，-80℃保存备用。
[0045]
(4)连接：使用t4 dna连接酶将sgrna与回收后的载体进行连接，4℃连接12h，具体反应体系(10μl)如下：
[0046]
lenticrisprv2酶切回收载体(50ng/μl)0.5μl
[0047]
sgrna退火双链5μl
[0048]
t4 dna连接酶1μl
[0049]
t4 dna连接酶buffer 1μl
[0050]
ddh2o 2.5μl
[0051]
(5)转化：从-80℃冰箱中取出dh5α感受态细胞置于冰上融化，将连接产物加入dh5α感受态细胞中，混匀，冰上放置10min；将混合物置于42℃水浴锅中热激90s；取出混合物快速置于冰上静置5min，向混合物中加入1ml无抗lb培养基，并置于37℃的震荡摇床上震荡培养45min，对离心管中的混合物进行低速离心，弃掉上层lb培养基，保留部分液体，用移液器重悬管底的感受态细胞加入事先准备好的氨苄固体lb培养基平板上进行37℃过夜培养，挑取单菌落进行摇菌扩大培养并送测序(如图1所示)。
[0052]
(6)质粒抽提：根据测序公司返回的测序结果挑选测序正确的菌液，并进行质粒抽提，具体步骤如下：
[0053]
(a)吸取100μl原始菌至100ml灭菌锥形瓶中，锥形瓶中加入20ml氨苄液体lb培养基进行过夜培养；
[0054]
(b)取10ml菌液于15ml离心管中，室温1,000r/min离心5min，将菌液全部离心至管底，弃掉上清废液；
[0055]
(c)向离心管中加入500μl含有rnasea的buffer p1，充分重悬左右菌体，静止5min；
[0056]
(d)向离心管中加入500μl buffer p2，轻轻上下颠倒离心管6次，直至液体变的清亮较为透明，室温静止5min；
[0057]
(e)向离心管中加入700μl buffer p3，轻轻上下颠倒离心管8次，直至出现白絮状物，室温静止5min，再室温12,000r/min高速离心10min，直至絮状物全部沉淀至管底；
[0058]
(f)取(e)中的上清液至装有底管的吸附柱中，室温12,000r/min高速离心30s，重复3次，直至所有上清液都经过吸附柱；
[0059]
(g)向吸附柱中加入500μl wash buffer，室温12,000r/min高速离心30s，弃掉废液，再重复洗涤一次；
[0060]
(h)将吸附柱室温12,000r/min高速离心1min，开盖室温静止1min；
[0061]
(i)将吸附柱套入新的无菌1.5ml离心管中，加入100μl eb(elution buffer)，室温静止1min；
[0062]
(j)将吸附柱室温12,000r/min高速离心1min，洗脱得到吸附柱上的质粒，测定浓度后，保存于-40℃备用；
[0063]
(7)转染：使用南京诺唯赞公司出品的exfect转染试剂将lenticrisprv2-prmt1-sgrn a重组质粒转染进入鸡成纤维细胞(df-1细胞)，具体操作步骤如下：
[0064]
(a)df-1细胞在六孔板细胞培养板中培养，密度长至70％左右，即可进行转染；
[0065]
(b)弃掉原培养基，加入1.6ml含2％血清的新鲜mem培养基；
[0066]
(c)准备两个无菌ep管，一管200μl无血清mem培养基中加入10μl exfect转染试剂，同时，另一管200μl无血清mem培养基中加入4μg重组质粒(1,000ng/μl)，两管室温静止5min；
[0067]
(d)将两管溶液进行混匀，室温静止15min；
[0068]
(e)将混合溶液加入6孔板的细胞中，继续培养4h；
[0069]
(f)4h后，弃掉原先培养基，重新加入含10％血清的mem培养基，继续培养。
[0070]
(8)嘌呤霉素药物筛选，具体操作步骤如下：
[0071]
(a)先用12孔板培养未转染质粒的df-1细胞，分别加入0.5、1、1.5、2、2.5、3μg/ml嘌呤霉素的完全培养基继续培养48h，48h内杀死所有df-1细胞的最低嘌呤霉素浓度为2μg/ml；
[0072]
(b)将转染后的细胞培养48h后，更换含2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基继续培养24h，观察细胞状态，发现部分细胞出现死亡，弃掉原先培养基，更换含2μg/ml嘌呤霉素的完全培养基继续培养24h，观察细胞状态，发现还有部分存活细胞，更换为不含嘌呤霉素的完全培养基继续培养24h以恢复细胞状态。
[0073]
(9)t7e1法鉴定prmt1 sgrna切割效率：由于t7e1酶能特异性识别基因组切割后修复产生的十字架结构，因此，常用t7e1酶切法鉴定sgrna的切割效率，具体方法如下：
[0074]
(a)利用水煮法分别提取正常df-1细胞和嘌呤霉素筛选后的df-1细胞的基因组dna，在prmt1切割位置附近设计430bp的鉴定pcr引物，引物序列如下：
[0075]
prmt1f:gacaccataagaccccccagaggac
[0076]
prmt1r:ccaaatcctcccttttcacccca
[0077]
(b)分别扩增正常df-1细胞和嘌呤霉素筛选后的df-1细胞基因组，扩增体系如下：
[0078]
2*rapid fast green mix 25μl
[0079]
dna模板2μl
[0080]
prmt1f 2μl
[0081]
prmt1r 2μl
[0082]
ddh2o 19μl
[0083]
按照50μl体系进行pcr扩增，扩增程序如下：95℃5min，95℃30s，56℃30s，72℃20s；扩增35个循环，最后72℃延伸10min。pcr结束后利用1％琼脂糖凝胶鉴定pcr扩增结果，并对pcr产物进行清洁回收纯化pcr产物。
[0084]
(c)取正常df-1细胞和筛选后的df-1细胞pcr产物进行t7e1酶切鉴定，体系如下：
[0085]
pcr产物200ng
[0086]
10*t7e1 buffer 2μl
[0087]
t7e1 1μl
[0088]
ddh2o up to 20μl
[0089]
上述反应体系从95℃进行touch down pcr酶切，酶切结束后取部分产物进行1％琼脂糖凝胶鉴定并扫描条带灰度评估酶切效率(如图2和表1所示)。
[0090]
表1prmt1 sgrna酶切效率统计
[0091][0092]
(10)利用有限稀释法筛选单克隆细胞，加入含edta的胰酶消化上述嘌呤霉素筛选过的df-1细胞，消化完全后加入含10％fbs的mem细胞培养基后低速离心收集细胞，弃掉上清后再加入2ml mem细胞培养基重悬细胞，取2μl细胞悬液加入到新的6孔板一个孔中，再往其中加入2ml含10％fbs的mem培养基，共接种一块6孔板细胞，多余的细胞继续培养至密度70％左右保种冻存。稀释的6孔板细胞继续培养，每五天更换一次含10％fb s的mem培养基，待细胞长至肉眼可见的细胞岛，显微镜下观察每个细胞岛并做好标记，用胰酶消化并用移液器吸出每个细胞岛至24孔板中继续培养，待长满后进行下一步鉴定。
[0093]
(11)单克隆细胞western blot鉴定：待上述吸出的24孔板细胞长满至单层后，用胰酶进行消化，用pbs收集细胞至ep管中并低速离心收集细胞，弃掉上清，用少量mem培养基重悬细胞，一半留在原孔继续培养，一半收集起来，加入50μl np40细胞裂解液，4度裂解30min后，高速离心10min，弃掉沉淀保留上清，加入20μl 4*蛋白上养缓冲液，充分混匀后沸水浴煮沸10min，所制备的蛋白样品暂存于4℃冰箱用于后续的wb检测：
[0094]
(a)首先配制聚丙烯酰胺凝胶，包含8％分离胶和5％浓缩胶，配方如下：
[0095]
各组分名称5％浓缩胶8％分离胶h2o1.21ml2.6ml40％丙烯酰胺250 μl1mltris8.80μl1.25mltris6.80.5ml0μl10％sds20μl50μl10％aps20μl50μltemed2μl2μl
[0096]
按上述配方配制好下层胶，先灌注好下层分离胶，上层加入异丙醇进行压线，室温静置待下层胶凝固后，弃掉上层异丙醇并用双蒸水清洗三遍，配制上层浓缩胶并灌注，迅速插入加样梳，室温静置1h待上层胶凝固后，轻轻取出梳子进行后续的sda-page实验；
[0097]
(b)加样：第一个孔加入蛋白预染marker 2μl；第二个空加入正常df-1细胞蛋白样品；后面几个孔依次加入待鉴定细胞蛋白样品；
[0098]
(c)电泳：电泳设备采用bio-rad迷你垂直电泳系统进行，先使用低压(80v)电泳30min左右，待溴酚蓝进入分离胶后，加大电压到120v继续电泳至溴酚蓝指示剂到玻璃板底即可停止电泳；
[0099]
(d)转膜：电泳结束后将凝胶多余部分裁掉去除，将剩余凝胶浸泡于转膜缓冲液中。准备好两张厚转膜滤纸，一张与膜大小比较接近的硝酸纤维素膜(nc膜)，nc膜和转膜滤纸先浸泡在转膜缓冲液中几分钟充分湿润，由下到上依次叠上滤纸-nc膜-凝胶-滤纸，摆放整齐置于半干转膜仪上，轻轻按压排除内部空气，盖上转膜仪盖子，以25v限压，0.2ma恒流，转膜35min，转印结束后取出nc膜；
[0100]
(e)封闭：将转印好的nc膜浸泡在含5％脱脂奶的pbs缓冲液中，室温静置20min，之后用pbs缓冲液清洗5遍，每次10min；
[0101]
(f)一抗孵育：按照prmt1抗体说明书1：1000稀释，置于4℃摇床震荡孵育过夜；
[0102]
(g)二抗孵育：第二天将nc膜用pbst震荡洗涤5次，每次5min，按照1:10,000稀释二抗，常温震荡孵育1h，之后用pbst震荡洗涤5次，每次5min；
[0103]
(h)蛋白成像及保存，western blot检测结果显示c5克隆未能检测到prmt1蛋白，表明prmt1基因已完全敲除(如图3所示)。
[0104]
(12)prmt1-/-df-1细胞基因测序：采用常规pcr法扩增prmt1基因组靶点序列附近并进行测序，以确认prmt1基因是否发生缺失或插入导致移码突变，具体操作步骤如下：
[0105]
(a)利用水煮法提取prmt1-/-df-1细胞基因组dna，使用常规pcr法扩增特异性条带，将pcr产物进行清洁回收；
[0106]
(b)将pcr回收产物进行ta克隆连接，连接体系及反应过程参考takara pmd18t试剂盒说明书进行；
[0107]
(c)将连接产物进行转化，转化过程参见步骤(5)，第二天挑取单菌落送测序，测序结果显示prmt1-/-df-1在prmt1基因靶点附近缺失11个碱基(如图4所示)，证明成功筛选得到稳定敲除prmt1基因的df-1细胞株。
[0108]
(13)prmt1-/-df-1细胞株活性测定：显微镜下观察正常df-1细胞和prmt1-/-df-1细胞不同代次细胞形态，结果发现两者细胞形态无明显差别(如图5所示)，同时利用cck8试剂盒测定两者细胞的不同时间点活性差异，结果发现prmt1-/-df-1细胞与正常df-1细胞活性无显著差异(如图6所示)。在连续传代后，检测该细胞株的prmt1蛋白表达，同时对prmt1基因组进行测序，发现该细胞株prmt1基因敲除十分稳定，没有出现恢复现象。可见，该细胞株具有较大的应用前景。
[0109]
综上所述，本发明通过crispr/cas9技术成功构建了prmt1基因敲除的df-1细胞株。为鸡源prmt1基因及蛋白功能研究提供有力工具。
[0110]
实施例2：prmt1基因敲除df-1细胞株对mda5诱导干扰素产生的影响
[0111]
用prmt1基因敲除df-1细胞株和野生型df-1细胞，进行正常传代培养后传至6孔板细胞，分别转染flag-chmda5质粒，48h后抽提细胞总rna并反转录，采用qpcr的方法检测ifn-β的mrna水平，结果发现，相比于正常df-1细胞，prmt1-/-df-1细胞株ifn-β的mrna水平上升约300倍(如图7所示)。
[0112]
实施例3：prmt1基因敲除df-1细胞株对ibdv复制的影响
[0113]
用prmt1基因敲除df-1细胞株和野生型df-1细胞，进行正常传代培养后传至6孔板细胞，待细胞密度长至80％左右，分别同时感染1moi ibdv，并同时在感染后6h和12h后收样品，qpcr检测结果显示(如图8所示)，prmt1-/-df-1中的ibdv基因拷贝数在6h和12h均显著低于正常df-1细胞，可见敲除prmt1基因后，抑制ibdv复制；同时wes tern blotting结果显示(如图9所示)，在prmt1-/-df-1细胞株中，ibdv产生的vp1/vp2/vp3蛋白显著低于正常df-1细胞；tcid
50
结果显示(如图10所示)，ibdv在prmt1-/-d f-1细胞株中的复制能力显著低于正常df-1细胞。以上结果表明，通过基因编辑技术获得p rmt1基因敲除的df-1细胞能够显著抑制ibdv的复制，具有抗ibdv复制的特性。
[0114]
以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。

技术特征：

1.一种敲除prmt1基因的sgrna，其特征在于，其核苷酸序列为：5'-gggaatcgggtcggatccat-3'。2.抑制prmt1基因/蛋白表达的试剂在制备预防或法氏囊病病毒感染药物中的应用，其特征在于，所述试剂包括权利要求1所述的sgrna和cas9蛋白的mrna序列。3.一种基于crsipr技术构建prmt1基因敲除细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)根据权利要求1所述的敲除prmt1基因的sgrna，设计两条反向互补核苷酸链，分别为：f：5'-caccggggaatcgggtcggatccat-3'和r：5'-aaacatggatccgacccgattcccc-3'；将上述两条反向互补核苷酸链酸链变性、退火形成双链；(2)将步骤(1)得到的双链与酶切后的cas9载体进行连接，得到重组敲除表达载体；(3)将步骤(2)得到的重组表达载体使用转染试剂转染鸡成纤维细胞系df-1细胞，经过继续培养、嘌呤霉素筛选及单克隆化筛选，得到prmt1基因敲除细胞株。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的cas9载体为lenticrisprv2载体。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，df-1细胞为处于对数生长期的细胞。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，嘌呤霉素筛选中的嘌呤霉素的浓度为2μg/ml。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，嘌呤霉素筛选的操作具体为：转染24h后，用含2μg/ml的嘌呤霉素的10％fbs的mem细胞培养液培养24h，然后更换为含2μg/ml的嘌呤霉素的10％fbs继续培养24h，然后再更换为含2μg/ml的嘌呤霉素的10％fbs继续培养24h，实现嘌呤霉素筛选。8.一种prmt1基因敲除df-1细胞株，其特征在于，由权利要求3至7任一项所述的方法制备得到。9.权利要求8所述的prmt1基因敲除df-1细胞株在调节干扰素水平中的应用。10.权利要求8所述的prmt1基因敲除df-1细胞株在抑制法氏囊病病毒复制中的应用。

技术总结

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及敲除PRMT1基因的sgRNA及PRMT1基因敲除细胞系的构建方法和应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术提供了一种靶向敲除PRMT1基因的sgDNA，该sgRNA能够特异性靶向PRMT1基因并结合CRISPR-Cas9技术实现宿主细胞完全敲除PRMT1基因，获得稳定敲除PRMT1基因的DF-1细胞株，该敲除细胞株干扰素诱导能力显著提高，而且能显著抑制IBDV的复制，为开展IBDV基础研究提供了有力工具，敲除PRMT1的鸡育种工作提供了科学依据。敲除PRMT1的鸡育种工作提供了科学依据。