1.本发明属于生物技术领域，具体涉及木荷
亲和性相关基因及其
标记和应用。
背景技术：
2.木荷(schima superba)为亚热带地区广布树种，自然分布于我国南方多个省份，种内个体变异较大。收集保存了木荷7个省份37个产地的木荷资源优树资源1000余份，在进行种内杂交授粉时，木荷存在不同优树无性系间亲和性差异，导致无性系授粉组合间座果率在27.3-95％之间变化，杂交种子产量差异较大。这给生产应用带来较大的困扰。
3.研究认为，在植物杂交不亲和实验中，存在配子体型(gsi)和孢子体型的(ssi)不亲和类型，一般情况下，ssi发生在柱头部位，而gsi发生在花柱或子房(晚期自交不亲和lsi)中。在gsi系统中，s-rnase(雌性决定因子)和s-locusf-box蛋白(slf/sfb，雄性决定因子)交互影响，从而决定了花粉管的生长和精子释放。
4.然而，现有技术中并未公开有关木荷亲和性鉴定的相关报道。
技术实现要素：
5.针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种木荷亲和性相关基因及其标记和应用的技术方案。
6.本发明具体采用以下技术方案实现：
7.本发明第一方面提供了木荷亲和性相关基因，其包括ssu11g00456，ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616，所述ssu11g00456的
核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ssu11g00484的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ssu13g01012的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述ssu09g00616的核苷酸序列如seq id no.4所示。
8.本发明第二方面提供了木荷亲和性相关基因s-rnase：ssu11g00456(主要在子房中表达，是gsi系统的母本决定因子，在s位点与slf/sfb作用，起到识别花粉，抑制非亲和花粉管生长的作用)，slf/sfb：ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616(主要在花粉中表达，是gsi系统的父本决定因子，在s位点和s-rnase作用，影响亲和s-rnase活性，促进亲和花粉管生长)。这些基因均在授粉后48小时表达，对于异源花粉管的生长具有特殊的生长调控作用(图2)。
9.其中，ssu11g00484和李属的gi因子(亲和性识别功能)在系统分类上划为一类(图4)，且在全株都有一定的表达(图5)，该基因与ssu11g00456基因连锁(图7，8)，具有定位识别基因型间s-rnase的功能。
10.本发明第三方面提供了木荷亲和性标记，其包括用于鉴定木荷亲和性基因ssu11g00484和ssu13g01012(slf/sfb)的标记；
11.所述鉴定木荷亲和性基因ssu11g00484的标记包括标记8411、标记8441、标记8431和标记8421，所述鉴定木荷亲和性基因ssu13g01012的标记包括标记1221和标记1211；
12.所述标记8411的上游
引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，标记8411的下游引
物的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述标记8441的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，标记8441的下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述标记8431的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，标记8431的下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述标记8421的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，标记8421的下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；所述标记1221的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，标记1221的下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述标记1211的上游引物的核苷酸序列如seq id no.15所示，标记1211的下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示。
13.本发明第四方面提供了上述木荷亲和性标记在鉴定木荷亲和性中的应用。
14.本发明第五方面提供了利用上述木荷亲和性标记鉴定木荷亲和性的方法，其具体为利用所述的标记对木荷进行基因型鉴定。
15.进一步，所述的方法具体包括：
16.1)提取植物基因组dna；
17.2)利用鉴定的标记上下游引物，进行pcr扩增；
18.3)利用全自动核酸蛋白分析仪(qsep100，bioptic.inc.台湾)，5bp分辨率卡夹进行条带分离鉴定；
19.4)根据条带分离情况，进行基因分型，判断亲本亲和性。
20.本发明的有益效果为：
21.通过利用木荷亲和性基因进行授粉对象的基因型鉴定，可以提早获得授粉受精容易，结种量高的杂交组合，为木荷种子产量的提高提供方法。
附图说明
22.图1花粉管在花柱和子房中的生长过程；
23.注：a.24h异交(亲和)；b.24h自交(非亲和)；c.36h异交(亲和)；d.36h自交(非亲和)；e.48h异交(亲和)；f.48h自交(非亲和)。
24.图2ssu11g00456，ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616分别在花柱和子房中24,48和72h的表达情况。
25.图3木荷ssu11g00626、ssu11g00456和ssu05g01984与蔷薇科、车前科、芸香科、茜草科和茄科物种s-rnase基因系统进化关系。
26.图4木荷ssu11g00484、ssu13g01012、ssu09g00616、ssu10g01793、ssu02g00077和ssu09g01602与蔷薇科、车前科和茄科物种slf/sfb基因系统进化关系。
27.图5木荷ssu11g00626、ssu11g00456、ssu05g01984、ssu11g00484、ssu13g01012、ssu09g00616、ssu10g01793和ssu02g00077在花粉、子房、花柱和叶片中的表达情况。
28.图6ssu11g00456氨基酸序列和结构示意图。
29.图7ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616氨基酸序列图。图8ssu11g00456、ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616的连锁关系图。
30.图9ssu11g00456(a)和ssu11g00484(b)连锁位置结构示意图。
31.图10部分引物在不同木荷材料中的电泳结果。
32.图11部分引物在不同木荷材料中的条带分离情况。
具体实施方式
33.以下结合实施例来进一步说明本发明。
34.实施例1：亲和性候选基因筛选
35.前期研究发现，木荷为lsi物种，自交(非亲和)花粉受阻在48h时的子房中发生(图1f)。通过差异转录组(有参，木荷基因组)结果鉴定发现，在子房中存在s-rnase基因ssu11g00456，以及3个slf/sfb类似基因ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616，在自交(非亲和)花粉管进入子房阶段，表达显著上调，利用24,48和72h授粉后的花柱和子房为材料，进行qrt-pcr验证这几个候选基因的表达复合转录组表达趋势(图2)，认为这几个基因在木荷杂交亲和性中具有重要的作用。
36.其中ssu11g00456的核苷酸序列如seq id no.1所示，ssu11g00484的核苷酸序列如seq id no.2所示，ssu13g01012的核苷酸序列如seq id no.3所示，ssu09g00616的核苷酸序列如seq id no.4所示。
37.实施例2：亲和性候选基因的结构分析
38.(1)ssu11g00456为s-rnase基因，存在5个保守区域c1-c5，3个内含子区域，和2个高度变异区域hva和hvb(在c2和c3之间)(图6)。在hva区中，存在一个高度变异的snp位点ssusnp85(a和t变异)，当碱基为a时，氨基酸为非极性丙氨酸，而为t时，为极性苏氨酸。该基因与柑橘属处于一个分枝并和李属的s-rnase基因在一个亚分枝下。
39.(2)ssu11g00484、ssu13g01012和ssu09g00616为sfb基因(图7)，蛋白具亲水极性。序列鉴定结合遗传图谱分析，发现ssu11g00484的f-box结构域存在5个多态性snp位点(ssusnp3434，ssusnp3392，ssusnp3369，ssusnp3362，ssusnp3337)与ssu11g00456的hva区存在显著的连锁关系(图8,9)。
40.实施例3：亲和性标记的开发
41.基于上述发现，利用基因序列进行ssr标记开发，鉴定到ssu11g00484基因存在4个ssr位点，ssu13g01012基因存在2个ssr位点。根据序列及退火温度等，设计了19对引物用于标记筛选，部分引物电泳结果如图10所示。利用全自动核酸蛋白分析仪(qsep100，bioptic.inc.台湾)，5bp分辨率卡夹进一步筛选，选择条带清晰，多态性强的引物6对(图11)。经筛选可用的引物如表1所示。
42.表1ssu11g00484和ssu13g01012 ssr位点信息
[0043][0044]
表2亲和性标记及引物序列
[0045][0046]
实施例4：亲和性标记用于木荷基因型鉴定
[0047]
基于上述引物，利用木荷34,26,65,30,96,88,87,5,8,3号无性系进行基因型鉴定。
[0048]
采集植物叶片，提取基因组dna，利用设计引物，进行pcr扩增(表3)。将扩增反应液利用全自动核酸蛋白分析仪(qsep100，bioptic.inc.台湾)，5bp分辨率卡夹进行条带分离鉴定，并与对应基因型比较分类。
[0049]
表3扩增程序和条件
[0050][0051]
注：扩增试剂采用2
×
taqplusmastermix(诺唯赞公司)。
[0052]
结果显示，条带可初步将无性系划分为5个基因型(表4)，且与亲和性相关显著(表5)。基因型间进行杂交，尤其是以s1作为母本设置组合，亲和性较高，座果率平均在44％以上，基因型内杂交，亲和性较低，座果率在10％以下。
[0053]
表4基因型划分
[0054][0055]
表5部分交杂交实验统计结果展示
[0056]
技术特征：
1.木荷亲和性相关基因，其特征在于包括ssu11g00456，ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616，所述ssu11g00456的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述ssu11g00484的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述ssu13g01012的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述ssu09g00616的核苷酸序列如seq id no.4所示。2.如权利要求1所述的基因作为木荷亲和性相关基因的用途。3.如权利要求2所述用途，其特征在于ssu11g00456抑制非亲和花粉管生长的用途，ssu11g00484，ssu13g01012和ssu09g00616影响亲和s-rnase活性并促进亲和花粉管生长的用途。4.木荷亲和性标记，其特征在于包括用于鉴定木荷亲和性基因ssu11g00484的标记以及用于鉴定木荷亲和性基因ssu13g01012的标记；所述鉴定木荷亲和性基因ssu11g00484的标记包括标记8411、标记8441、标记8431和标记8421，所述鉴定木荷亲和性基因ssu13g01012的标记包括标记1221和标记1211；所述标记8411的上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，标记8411的下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述标记8441的上游引物的核苷酸序列如seq id no.7所示，标记8441的下游引物的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述标记8431的上游引物的核苷酸序列如seq id no.9所示，标记8431的下游引物的核苷酸序列如seq id no.10所示；所述标记8421的上游引物的核苷酸序列如seq id no.11所示，标记8421的下游引物的核苷酸序列如seq id no.12所示；所述标记1221的上游引物的核苷酸序列如seq id no.13所示，标记1221的下游引物的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述标记1211的上游引物的核苷酸序列如seq id no.15所示，标记1211的下游引物的核苷酸序列如seq id no.16所示。5.如权利要求4所述的木荷亲和性标记在鉴定木荷亲和性中的应用。6.利用权利要求4所述的木荷亲和性标记鉴定木荷亲和性的方法，其特征在于利用所述的标记对木荷进行基因型鉴定。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于具体包括：1)提取植物基因组dna；2)利用鉴定的标记上下游引物，进行pcr扩增；3)利用全自动核酸蛋白分析仪，5bp分辨率卡夹进行条带分离鉴定；4)根据条带分离情况，进行基因分型，判断亲本亲和性。
技术总结
木荷亲和性相关基因及其标记和应用，属于生物技术领域。本发明公开了木荷亲和性相关基因、木荷亲和性相关基因的标记以及木荷亲和性相关基因的应用。通过利用木荷亲和性基因进行授粉对象的基因型鉴定，可以提早获得授粉受精容易，结种量高的杂交组合，为木荷种子产量的提高提供方法。提高提供方法。提高提供方法。
技术研发人员：
张蕊 滕国新 杨汉波 范金根 周志春
受保护的技术使用者：
中国林业科学研究院亚热带林业研究所
技术研发日：
2022.09.20
技术公布日：
2023/3/3
