一种稳定性提高的突变胱硫醚β裂解酶及其制备方法和应用与流程

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一种稳定性提高的突变胱硫醚
β
裂解酶及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于基因工程及生化检测技术领域，涉及一种突变胱硫醚β裂解酶制备方法、缓冲体系优化以及应用，具体涉及一种稳定性提高的突变胱硫醚β裂解酶及其制备方法和应用。

背景技术：

2.基因工程技术的发展使得工具酶的大量制备相对比较容易，但这些蛋白类产品存在储存稳定性差、易被蛋白水解酶降解、溶解性差等问题，因此必须对该类基因工程产品进行优化，改善各项性能，才能使其更好的被使用。
3.虽然固态蛋白质在低温状态下保存一般都比较稳定，但大多数蛋白质在溶液状态下却很不稳定，而目前诊断过程所用的工具酶很多情况下是要求在液态情况下保存、使用的，因此对其溶液状态下的存储稳定性要求较高。这限制了各种工具酶和工业用酶的使用，因此如何能够使工具酶在溶液状态下长时间保存，就成为极为迫切的现实问题。
4.同型半胱氨酸(homocysteine，hcy)，又称高半胱氨酸，是一种含巯基的氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物。研究表明，hcy过高可导致心脑血管疾病、胱氨酸尿症以及叶酸和维生素b12缺乏等症状，hcy是心脑血管诊断中最独特、最有效的预测指标之一，因此，快速准确检测hcy含量的方法的建立，对基础研究和临床诊断都有非常重要的意义。目前，同型半胱氨酸最主要的检测方法有：高效液相谱法(hplc)、荧光偏振免疫分析法(fpia)、酶联免疫吸附测定法(elisa)、化学发光法、酶循环法等，其中fpia法与hplc法均具有较高的精密度和灵敏度，但这两种方法的成本相对较高，操作繁琐；elisa法与化学发光法操作时间长，反应系统要求高，开发难度大；酶循环法的成本较低，开发系统简便，操作简单，而且循环酶法在全自动生化分析仪应用更为广泛。
5.酶循环法的原理是利用胱硫醚β合成酶(cbs)催化l-丝氨酸和同型半胱氨酸形成l-胱硫醚，而l-胱硫醚又在胱硫醚β裂解酶(cbl)的催化作用下形成同型半胱氨酸、丙酮酸和氨，酶循环法测定同型半胱氨酸通过三步反应，最后检测nadh变成nad
+
，吸光值在波长为340nm减少来反推计算样品中hcy的含量。因此，通过表达、纯化得到高活性、稳定性优的胱硫醚β合成酶和胱硫醚β裂解酶是运用酶循环法测定同型半胱氨酸的关键。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种稳定性提高的突变胱硫醚β裂解酶及其制备方法和应用，通过点突变方式将胱硫醚β裂解酶的序列进行改造，通过基因重组技术将其在大肠杆菌中成功获得表达，该突变胱硫醚β裂解酶具有酶活力高、产量高等优点，且该酶在液体缓冲体系中非常稳定；同时本发明还通过优化其蛋白缓冲体系成分，提高其稳定性，将该突变胱硫醚β裂解酶成功运用到同型半胱氨酸检测试剂盒中。
7.本发明的技术方案是：
8.本发明提供了一种突变胱硫醚β裂解酶，其氨基酸序列如seq id no.5所示。
9.所述突变胱硫醚β裂解酶由氨基酸序列如seq id no：1所示、核苷酸序列如seq id no：2所示的胱硫醚β裂解酶突变获得，突变位点为v27p，g191p。
10.进一步的，所述胱硫醚β裂解酶(cbl)的氨基酸序列如seq id no：1所示，其核苷酸序列如seq id no：2所示，该蛋白核酸序列seq id no：2是以dh5α为模板，以seq id no.3和seq id no.4为引物扩增获得，其中n，c末端引入bamh i，xho i酶切位点；
11.其中，seq id no.3：5
’‑
cgggatccatggcggacaaaaagcttgat-3’；
12.seq id no.4：5
’‑
ccctcgagtacaattcgcgcaaaaccggcgt-3’。
13.所述胱硫醚β裂解酶在第27位缬氨酸突变为脯氨酸，第191位甘氨酸突变为脯氨酸，突变后的胱硫醚β裂解酶序列如seq id no.5所示。脯氨酸在蛋白质结构中具有提高其热稳定性的重要作用，脯氨酸引入可以降低蛋白质去折叠时的骨架熵，同时由于脯氨酸带有疏水基，疏水基团的紧密包裹使β-转折及无规则卷曲中的键合更加牢固，从而进一步增强蛋白质空间结构的稳定性，并且多种酶通过合理的选择脯氨酸突变位点成功的提高了热稳定性。
14.本发明还提供了一种编码所述突变胱硫醚β裂解酶的基因，该基因序列是以seq id no：2为模板，以seq id no.3、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9为引物通过点突变pcr扩增突变胱硫醚β裂解酶基因序列，其中n，c末端引入bamh i，xho i酶切位点；所述突变胱硫醚β裂解酶的基因的序列如seqid no：10所示。
15.其中，seq id no.6：5
’‑
taaatagcccaattcagcgcgcttcttcgctggt-3’；
16.seq id no.7：5
’‑
aagcgcgctgaattgggctatttaccgcgccaaga-3’；
17.seq id no.8：5
’‑
tgggcagccccagtgctgtttaaggcgctggatt-3’；
18.seq id no.9：5
’‑
aacagcactggggctgcccaggtgttgtcga-3’。
19.本发明还提供了一种包括上述基因的重组载体，将扩增后的突变胱硫醚β裂解酶的基因序列通过bamh i、xhoi双酶切连接到载体pet24a上，形成重组载体pet24a-cbl(v27p，g191p)。
20.本发明还提供了一种含有所述基因的重组工程菌。所述重组工程菌采用的宿主细胞包含大肠杆菌rosetta(de3)，制备重组工程菌r/pet24a-cbl(v27p，g191p)。
21.进一步的，本发明还提供了采用重组工程菌制备突变胱硫醚β裂解酶的发酵纯化方法，包括以下步骤：扩大培养重组工程菌，加入诱导剂以及磷酸吡哆醛继续培养，培养结束后离心收集菌沉淀，菌沉淀经高压均质机破碎、镍离子亲和柱纯化获得突变胱硫醚β裂解酶。
22.具体的，突变胱硫醚β裂解酶的制备方法，包括以下步骤：
23.1)以大肠杆菌dh5α为模板，以seq id no.3-4为引物扩增seq id no.2核苷酸序列，以seq id no.2为模板，以seq id no.3、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9为引物扩增seq id no.10所示核苷酸序列；
24.2)将扩增的核苷酸序列seq id no.2、seq id no.10连接到质粒载体pet24a中，形成重组质粒；
25.3)将步骤2中的重组质粒转化入大肠杆菌感受态细胞，进行重组蛋白表达；
26.4)通过添加iptg诱导重组蛋白表达，同时在发酵过程中添加磷酸吡哆醛使其在表
达过程中便于辅酶结合，使其结合更充分，结构更正确；
27.5)通过ni离子亲和层析等方法分离纯化重组蛋白，获得突变胱硫醚β裂解酶。
28.将纯化后重组蛋白透析到pbs ph7.4缓冲体系中，并添加甘油、edta、pei、tween-80保护剂中的一种或几种。
29.本发明还提供了所述突变胱硫醚β裂解酶在同型半胱氨酸检测试剂盒中的应用。
30.进一步的，本发明还提供了优化突变胱硫醚β裂解酶的蛋白缓冲液体系，所述蛋白缓冲液体系含有以下的一种或几种保护剂：甘油、edta、pei、tween-80。
31.进一步的，所述保护剂的成分中甘油成分体积百分占比为：15％-50％；
32.和/或，所述保护剂的成分中edta添加量为2mm～5mm；
33.和/或，所述保护剂的成分中pei体积占比为0.1％-1％；
34.和/或，所述保护剂的成分中tween-80体积百分比为0.1％-1％。
35.本发明制备的突变胱硫醚β裂解酶是以大肠杆菌dh5a为模板扩增胱硫醚β裂解酶基因序列，并将其第27位缬氨酸突变为脯氨酸，第191位甘氨酸突变为脯氨酸，即：v27p，g191p；将突变后序列连接到载体pet24a，转化大肠杆菌表达菌株rosetta进行表达，并通过镍离子亲和层析柱纯化获得，获得的突变蛋白具有更优的热稳定性；同时通过添加各种保护剂更优的提高其在液体状态下的稳定性。
36.本发明的有益效果：
37.(1)本发明通过基因工程技术制备突变胱硫醚β裂解酶，同时从氨基酸序列及缓冲体系配方两个方面进行优化；在氨基酸序列上将位于蛋白质二级结构β转折区域的第27位缬氨酸、第191位甘氨酸突变为脯氨酸来提高蛋白质结构稳定性，同时优化蛋白缓冲液体系中保护剂成分来提高蛋白质在液态下的稳定性，从而制备出兼具高酶活及高稳定性的突变胱硫醚β裂解酶。
38.(2)本发明制备的突变胱硫醚β裂解酶具有酶活高、热稳定性优的优势，将该活性高、稳定性优的突变cbl应用到hcy检测试剂中，能够很好的通过热稳定性、准确性验证，制得的同型半胱氨酸检测试剂盒具有活性高、投料量少、稳定性好等优点。
附图说明
39.图1为实施例2提供的重组蛋白sds-page检测的凝胶电泳图；
40.图2为线性质控品检测结果图。
具体实施方式
41.为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.实施例1重组质粒构建
43.(1)cbl重组质粒构建
44.以大肠杆菌全基因组为模板，扩增cbl核酸序列；利用primer5引物设计软件，根据引物设计及酶切位点设计原则，结合pet24a载体酶切位点图谱，分别在上下游引物前添加
酶切位点及保护碱基，设计引物如下：
45.p1：5
’‑
cgggatccatggcggacaaaaagcttgat-3’(bamh i)(seq id no.3)
46.p2：5
’‑
ccctcgagtacaattcgcgcaaaaccggcgt-3’(xho i)(seq id no.4)
47.扩增序列为seq id no.2所示。
48.按如下表1添加反应体系，通过表2提供的扩增程序进行扩增。
49.表1 pcr体系
50.pcr反应组分50μl体系2*taq mix25上游引物1下游引物1dna模板1加ddh2o至up to 50μl
51.表2 扩增程序
[0052][0053][0054]
将pcr扩增产物回收后，通过bamh i和xhoi双酶切(本发明实施例中所采用的各种分子生物学用酶均购自大连宝生物工程有限公司)，之后回收酶切产物，连接到bamh i和xho i酶切之后的载体pet24a上，经过转化dh5α、pcr鉴定重组质粒、得到阳性转化子，并送生工测序，测序结果与genbank数据库blast比对，目的基因与genbank：cp053602.1e.coli(bl21)全基因序列中第3020971-3022155位序列符合率100％。提取重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株rosetta，获取cbl重组蛋白表达菌株：r/pet24a-cbl。
[0055]
(2)cbl(v27p，g191p)重组质粒构建
[0056]
cbl(v27p，g191p)是在cbl基础上进行氨基酸突变：将位于β转折区域的第27位缬氨酸和第191位甘氨酸突变为脯氨酸，即：v27p、g191p。利用primer5引物设计软件，设计突变互补引物p3、p4、p5和p6。设计引物如下：
[0057]
p3：5
’‑
taaatagcccaattcagcgcgcttcttcgctggt-3’(seq id no.6)
[0058]
p4：5
’‑
aagcgcgctgaattgggctatttaccgcgccaaga-3’(seq id no.7)
[0059]
p5：5
’‑
tgggcagccccagtgctgtttaaggcgctggatt-3’(seq id no.8)
[0060]
p6：5
’‑
aacagcactggggctgcccaggtgttgtcga-3’(seq id no.9)
[0061]
利用引物p1、p2、p3、p4、p5、p6以cbl为模板进行点突变pcr，获的目的基因产物为cbl(v27p，g191p)，对应核酸序列为seq id no.10。
[0062]
将pcr扩增产物回收后，通过bamh i和xhoi双酶切，之后回收酶切产物，连接到bamh i和xho i酶切之后的载体pet24a上，经过转化dh5α、pcr鉴定重组质粒、得到阳性转化子，并进行测序，测序结果与cbl序列比对，符合率为99.24％，其中第27位val和第191位gly成功突变为pro。提取重组质粒，转化大肠杆菌表达菌株rosetta，获取cbl(v27p，g191p)重组蛋白表达菌株：r/pet24a-cbl(v27p，g191p)。
[0063]
实施例2重组蛋白表达纯化
[0064]
(1)诱导表达：
[0065]
取10μl重组质粒表达菌种(实施例1的cbl重组蛋白表达菌株：r/pet24a-cbl，cbl(v27p，g191p)重组蛋白表达菌株：r/pet24a-cbl(v27p，g191p))接种于含100μg/ml卡那霉素(kan)(购自索莱宝)的5ml lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜(约16h)，从中取200μl菌液加入到含有相同浓度kan的60ml lb培养基中，37℃，200rpm振荡培养过夜，将全部菌液接种至含有相同浓度kan的1l lb培养基中，28℃，150rpm震荡培养2～2.5h后，测定od
600
在0.5～0.8之间，加入终浓度为0.5mm的诱导剂iptg(购自amresco)，加入0.1mm plp继续以28℃，150rpm振荡培养4.5h后以6000rpm离心5min，收集菌沉淀；菌沉淀用50ml 20mm pbs(ph 7.4)重新悬起，6000rpm离心15min，收集沉淀。
[0066]
(2)高压破碎：
[0067]
菌沉淀用30ml 20mm pbs(ph 7.4)重新悬起，进行低温高压破碎，参数设置：压力值910～980bar，循环3次，温度设置4℃，实际运行温度不得高于13℃。破碎结束后，将破碎产物以9000rpm，低温离心30min，收集上清。
[0068]
(3)蛋白纯化：
[0069]
取imac bestarose-ff层析柱(购自博格隆)进行亲和层析，用10倍柱体积超纯水平衡层析柱；再用10倍柱体积平衡缓冲液(20mm pbs，ph 7.4)平衡层析柱后加入蛋白样；上样结束后，用10倍柱体积平衡缓冲液(20mm pbs，ph 7.4)洗去未结合的蛋白；最后用洗脱缓冲液(20mm pbs-250mm im，ph 7.4)洗脱目的蛋白。
[0070]
将收集的蛋白样品装入透析袋，放入装有透析液(20mm pbs，ph 7.4)的烧杯中，4℃透析过夜。
[0071]
纯化后蛋白进行sds-page检测，结果如图1所示，重组蛋白(cbl，cbl(v27p，g191p))纯度在95％以上。
[0072]
实施例3
[0073]
向透析后的重组蛋白(cbl，cbl(v27p，g191p))样品中加入不同组分的保护剂，包括：
[0074]
1、将透析后的样品从透析袋中取出，添加甘油：
[0075]
(1)添加体积占比15％甘油；
[0076]
或，(2)添加体积占比25％甘油；
[0077]
或，(3)添加体积占比35％甘油；
[0078]
或，(4)添加体积占比50％甘油；
[0079]
2、向透析后样品中添加保护剂edta：
[0080]
(1)添加2mm edta；
[0081]
或，(2)添加3mm edta；
[0082]
或，(3)添加4mm edta；
[0083]
或，(4)添加5mm edta；
[0084]
3、向透析后样品中添加保护剂pei：
[0085]
(1)添加体积占比0.1％pei；
[0086]
或，(2)添加体积占比0.5％pei；
[0087]
或，(3)添加体积占比1％pei；
[0088]
4、向透析后样品中添加保护剂tween-80：
[0089]
(1)添加体积占比0.1％tween-80；
[0090]
或，(2)添加体积占比0.5％tween-80；
[0091]
或，(3)添加体积占比1％tween-80；
[0092]
5、向透析后样品中添加保护剂：甘油、edta、pei、tween-80，添加量分别为：
[0093]
(1)50％甘油，5mm edta，0.5％pei，0.5％tween-80；
[0094]
或，(2)50％甘油，5mm edta，0.5％pei；
[0095]
或，(3)50％甘油，0.5％tween-80，0.5％pei；
[0096]
将未添加保护剂的cbl、cbl(v27p，g191p)和添加了保护剂的cbl(v27p，g191p)分别进行4℃、1～2个月，37℃、7～14天的热稳定性实验，并应用于同型半胱氨酸检测试剂盒中。
[0097]
实施例4
[0098]
将本发明制备的胱硫醚β裂解酶(cbl)和突变胱硫醚β裂解酶(cbl(v27p，g191p))应用于同型半胱氨酸检测试剂盒中，该试剂盒应用循环酶法原理，试剂盒包括r1，r2两种组分，其中r1组分：三羟甲基氨基甲烷10mg/ml、丝氨酸0.08mg/ml、β-还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.36mg/ml、乳酸脱氢酶0.2mg/ml；r2组分：三羟甲基氨基甲烷10mg/ml、乙二胺四乙酸二钠0.2mg/ml、胱硫醚β合成酶1.2mg/ml、胱硫醚β裂解酶0.075mg/ml。(其中胱硫醚β裂解酶及突变胱硫醚β裂解酶为本发明制备，其余成分均购自青岛汉唐生物科技有限公司。)
[0099]
在检测性能指标时，与青岛汉唐生物科技有限公司hcy检测试剂盒对比，其中只有添加cbl不同。
[0100]
(1)活性检测
[0101]
检测标准品吸光度变化率，与汉唐hcy检测试剂盒中所用cbl(对照cbl)对比，活性分别高于对照40.62％、43.39％，检测结果如表3所示。
[0102]
表3 cbl活性检测结果
[0103][0104]
[0105]
(2)重组酶加速破坏后活性检测
[0106]
未添加保护剂cbl、未添加保护剂cbl(v27p，g191p)与添加保护剂cbl(v27p，g191p)放置在37℃破坏7天、14天，4℃放置1个月、2个月后再进行活性检测，与-20℃放置未添加保护剂cbl、未添加保护剂cbl(v27p，g191p)与添加保护剂cbl(v27p，g191p)进行对比，结果如表4所示。
[0107]
结果表明进行突变的cbl热稳定性明显优于未进行改造过的cbl，同时在缓冲体系中添加一定比例的保护剂如：甘油、edta、pei、tween-80能有效提高稳定性。
[0108]
表4 cbl热稳定性检测结果
[0109][0110]
[0111]
(3)精密性质控品检测
[0112]
检测精密性质控品，结果如下表5所示，精密性偏差均在2％以内，优于对照。
[0113]
表5 精密性质控品检测结果
[0114]
精密性质控品对照cblcblcbl(v27p,g191p)j8.648.848.66j8.948.618.99j8.768.758.71j8.828.938.78j8.489.038.87平均值8.738.838.80stdve0.180.160.13cv2.01％1.83％1.49％
[0115]
(4)临床样本检测
[0116]
检测临床样本，与对照的偏差在2％以内，结果见表6。
[0117]
表6 临床检测结果
[0118][0119][0120]
(5)线性质控品检测
[0121]
检测2.5μmol/l、10.67μmol/l、27μmol/l、43.33μmol/l、51.5μmol/l线性质控品，线性指标符合要求，线性范围能达到2.5～51.5μmol/l；相关系数r2＝0.9998，检测结果如图2所示。
[0122]
(6)产品热稳定性
[0123]
将未添加保护剂cbl、未添加保护剂cbl(v27p，g191p)与添加保护剂cbl(v27p，g191p)配制成hcy检测试剂盒后进行37℃、7天加速破坏，及4℃进行30天开封稳定性检测校准品、质控品，比较平均降幅，结果如表7所示。
[0124]
表7 cbl配制成hcy检测试剂盒成品后热稳定性结果
[0125][0126]
结果表明进行突变的cbl应用到hcy检测试剂盒中后热稳定性及开封稳定性明显优于未进行改造过的cbl，同时在缓冲体系中添加一定比例的保护剂如：50％甘油、5mm edta、0.5％pei、0.5％tween-80能有效提高试剂盒稳定性。
[0127]
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

1.一种突变胱硫醚β裂解酶，其氨基酸序列如seq id no.5所示。2.根据权利要求1所述的突变胱硫醚β裂解酶，其特征在于，由氨基酸序列如seq id no：1所示、核苷酸序列如seq id no：2所示的胱硫醚β裂解酶突变获得，突变位点为v27p，g191p。3.一种编码权利要求1所述的突变胱硫醚β裂解酶的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no：10所示。4.一种包括权利要求3所述基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体所用的表达载体为pet24a。6.一种含有权利要求3所述基因的重组工程菌。7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌采用的宿主细胞包含大肠杆菌rosetta。8.一种制备权利要求1所述突变胱硫醚β裂解酶的发酵纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：扩大培养权利要求6所述的重组工程菌，加入诱导剂的同时加入辅酶磷酸吡哆醛继续培养，培养结束后离心收集菌沉淀，菌沉淀经高压均质机破碎、镍离子亲和柱纯化获得重组蛋白：突变胱硫醚β裂解酶。9.权利要求1所述突变胱硫醚β裂解酶的缓冲液体系，其特征在于，含有以下保护剂的一种或多种组分：甘油，edta，pei，tween-80；所述保护剂中甘油的体积百分比为15％-50％；和/或，所述保护剂中pei的体积百分比为0.1％-1.0％；和/或，所述保护剂中tween-80的体积百分比为0.1％-1％；和/或，所述保护剂中edta添加量为2mm～5mm。10.权利要求1所述的突变胱硫醚β裂解酶在同型半胱氨酸检测试剂盒中的应用。

技术总结

本发明属于基因工程及生化检测技术领域，具体涉及一种突变胱硫醚β裂解酶及其制备方法和应用，突变胱硫醚β裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，由氨基酸序列如SEQ IDNo：1所示、核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的胱硫醚β裂解酶突变获得，突变位点为V27P，G191P，应用于同型半胱氨酸检测试剂盒中。本发明制备的突变胱硫醚β裂解酶具有酶活高、热稳定性优的优势，将该活性高、稳定性优的突变CBL应用到Hcy检测试剂中，能够很好的通过热稳定性、准确性验证，制得的同型半胱氨酸检测试剂盒具有活性高、投料量少、稳定性好等优点。稳定性好等优点。