可影响
水稻粒形的
基因glw7.1及其应用
技术领域
1.本发明涉及水稻分子育种领域，涉及ghd7基因及其等位型glw7.1基因在增加水稻产量和改善
稻米品质上的应用。
背景技术：
2.水稻是世界上最重要的粮食作物之一。长期以来，提高水稻产量以保证粮食安全一直是水稻育种的主要目标。随着人们生活水平的提高，具有优良外观品质和蒸煮食味品质的稻米越来越受到消费者的青睐。水稻粒形性状包括粒长、粒宽和粒厚，能够直接决定水稻粒重从而间接影响水稻产量。此外，粒形也属于稻米品质性状，能够影响稻米垩白和精米率，决定其作为商品的流通价值。因此，发掘新的水稻粒形调控基因，能够为培育更优质高产水稻提供更好的理论基础和解决方案。
技术实现要素：
3.本发明的发明人通过考察以金23b为轮回亲本，cr071为供体亲本的金23b/cr071 bc3f1体粒长和粒宽表型，结合体内覆盖全基因组的多态性标记，利用遗传连锁作图检测到10个控制水稻粒形的qtl，其中位于第7染体上的gl7位点具有最高的显著性。后续高世代近等基因系体qtl效应验证结果显示，gl7位点能够同时增加水稻粒长、粒宽和千粒重，故我们将将这一位点正式更名为glw7.1(grain length,width and weight 7.1)
4.我们通过筛选重组单株，考察重组单株当代和后代表型将控制粒长和粒宽性状的glw7.1位点精细定位到68kb区段。比较测序结果显示cr071相对于金23b存在一个53kb的大片段插入，而候选基因正好位于插入片段中。我们通过转基因互补实验将glw7.1基因导入到不含glw7.1基因的近等基因系材料中，结果显示互补材料粒长和粒宽表型显著增加；通过基因编辑技术对glw7.1基因进行敲除，结果显示功能丧失突变体粒长和粒宽表型显著降低。此外，近等基因系田间农艺性状考察结果显示，glw7.1基因能够通过增加水稻粒长和粒宽从而直接增加谷粒千粒重，进而间接增加水稻产量；稻米外观品质和蒸煮食味品质考察结果显示，glw7.1基因能够降低稻米垩白同时提高稻米食味值。
5.基于以上研究，本发明提供了ghd7基因在改变水稻粒形中的应用。
6.在一个具体实施方案中，所述水稻粒形为水稻籽粒的粒长和/或粒宽。
7.本发明还提供了一种可影响水稻粒形和提高水稻产量的ghd7基因等位型，所述ghd7基因等位型编码的蛋白序列为seq id no:2，或seq id no:2不影响cct结构域的变体。
8.在一个具体实施方案中，所述ghd7基因等位型的核酸序列为seq id no:1，或seq id no:1不影响cct结构域的变体。
9.本发明还提供了一种改变水稻粒形的育种方法，包括改变生产所述水稻籽粒的水稻中ghd7基因等位型的步骤。
10.在一个具体实施方案中，起始水稻
品系不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因，用具有含有正常cct结构域的ghd7基因的水稻品系与所述起始水稻杂交，将含有
正常cct结构域的ghd7基因导入到起始水稻品系中；或者，
11.起始水稻品系含有正常cct结构域的ghd7基因，用不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因的水稻杂交，用含有正常cct结构域的ghd7基因的水稻品系与起始水稻杂交，使起始水稻品系中的不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因。
12.在一个具体实施方案中，起始水稻品系不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因，向起始水稻品系中插入含有正常cct结构域的ghd7基因表达框；或者，
13.起始水稻品系含有正常cct结构域的ghd7基因，用突变或敲除的方法使起始水稻品系中不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因。
14.本发明提供了一种新的粒形基因可同时增加水稻产量并改良稻米品质性状，为水稻育种提供了新的方法和路径。
附图说明
15.图1为bc3f1体粒形qtl初定位结果；
16.图2为glw7.1近等基因系体在两年重复田间实验中水稻粒长(a和d)、粒宽(b和e)和千粒重(c和f)的统计图；
17.图3为glw7.1近等基因系以及双亲粒长(a)、粒宽(b)和株型(c)照片；
18.图4为glw7.1基因的图位克隆，其中，a为精细定位；b为重组单株后代测验；
19.图5为glw7.1基因候选区段的比较测序分析，其中，a为双亲在候选区段内的预测基因；b为候选基因结构图；c为候选基因等位型对应的蛋白序列。
20.图6为glw7.1基因转基因功能验证，其中，a为基因编辑后突变体基因型；b为基因编辑后突变体蛋白c端氨基酸序列；c为转基因家系和对照家系粒长照片；d为转基因家系和对照家系粒长统计图；e为转基因家系和对照家系粒宽照片；f为转基因家系和对照家系粒宽统计图；
21.图7为glw7.1近等基因系间粒长(a)、粒宽(b)、长宽比(c)、千粒重(d)、株高(e)、有效分蘖数(f)、每穗实粒数(g)和单株产量(h)的统计图；
22.图8为glw7.1近等基因系间稻米外观品质照片(a)，垩白粒率(b)、直链淀粉含量(c)、胶稠度(d)和食味值(e)统计图。
具体实施方式
23.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
24.1、样品来源
25.本发明使用的遗传体来源于两个亲本材料，金23b和cr071。金23b(jin23b，j23b)是不育系金23a的保持系，是一种细长粒籼稻品种，用作后期体构建的轮回亲本。cr071由湖北省恩施农科院提供，也是一种细长型籼稻品种，用作glw7.1基因的供体亲本。早期初定位bc3f1体正常生长于夏季湖北省恩施市咸丰县实验田间。
26.用于glw7.1两年粒形效应遗传分析的随机体分别分离于bc4f1和bc5f2世代杂合基因型glw7.1/glw7.1材料，后者同时用于重组单株筛选。用于后代测验的材料处于bc5f4世代。本研究大部分实验中涉及到的近等基因系材料(含glw7.1等位型的nil-j和含glw7.1等
位型nil-c)分离于bc5fn(n≥6)世代杂合基因型植株。互补家系nil-j-com家系通过以nil-j充当受体的转基因互补实验获得。突变体家系nil-c-a通过crispr-cas9系统对nil-c材料进行基因编辑获得。转基因表型收集于t1代。所有材料正常生长于夏季武汉华中农业大学试验田中，种植密度16cm
×
26cm。
27.成熟收获后的稻谷晾干后室温储藏至少三个月，然后用于实验。
28.2、粒形性状的连锁分析和glw7.1的精细定位
29.利用覆盖全基因组的157个多态性ssr标记对bc3f1体进行基因型鉴定。考察体粒长和粒宽表型后，利用mapmaker/exp3.0中的kosambi函数构建遗传连锁图谱；winqtlcart 2.5中的复合区间作图法进行连锁分析；利用r/qtl软件包对winqtlcart的输出结果进行连锁作图(图1)。遗传连锁作图共检测到10个控制水稻粒形的数量遗传位点(qtl)，其中位于第7染体上的gl7位点具有最高的显著性。
30.为了验证gl7的遗传效应，我们在2015年和2017年分别利用bc4f2和bc5f3世代近等基因系体，对粒长、粒宽及千粒重表型进行了考察。两年遗传效应考察结果显示，glw7.1等位型材料(nil-c)和glw7.1等位型材料(nil-j)相比，具有更长、更宽因而更重的水稻谷粒(图2和图3)。因此，我们将这一位点正式更名为glw7.1(grain length,width and weight 7.1)用于后续研究。同时我们也发现，杂合glw7.1/glw7.1等位型材料(nil-h)表现出和nil-c相似的表型，表明glw7.1是一个同时增加粒长、粒宽和千粒重的显性位点。
31.在glw7.1的精细定位过程中，我们利用杂合glw7.1/glw7.1近等基因系材料(nil-h)发展了一个包含30,000个单株的bc5f3随机体，用于筛选重组单株。我们随后利用重组单株的当代表型进行连锁分析，将glw7.1定位到标记lg18和k5之间(图4a)。我们挑选候选区间lg18和k5内的重组单株后代分离家系种植于武汉田间(每个家系种植48苗)，鉴定家系后代基因型收获纯合后代种子并考察粒形性状进行后代测验(progeny test)。通过8个重要的重组单株家系的后代测验，我们将glw7.1的粒长和粒宽候选基因同时定位到标记k17和k19之间(图4b)。至此，我们将同时控制粒长和粒宽性状的glw7.1精细定位于k17和k19之间约68kb区段。
32.3、glw7.1的候选区段比较测序分析
33.双亲比较测序显示，j23b相对于cr071在标记k17到k19候选区间内存在一个53kb的大片段缺失(候选区间在j23b中68kb，在cr071中121kb)，其中j23b 68kb候选区段内存在3个预测orf(orf1、orf2和orf4)，而对应的cr071 121kb候选区段内存在4个预测orf(orf1、orf2、orf3和orf4)(图5a)。为了进一步确认glw7.1的候选基因，我们比较了双亲共有的3个orf(orf1、orf2和orf4)的基因组序列，包括启动子区和蛋白编码区序列，但并没检测到任何变异。因此，我们认为，存在于j23b约53kb缺失片段中的orf3(loc_os07g15770)(编码一个cct motif家族蛋白ghd7，蛋白氨基酸序列如seq id no:2所示)，很可能就是glw7.1的候选基因(图5b)。我们随后比较了明恢63、日本晴和cr071中ghd7区段的基因组序列。和已报道的明恢63携带的ghd7-1等位型不同，cr071携带的等位基因因为编码蛋白含有3个氨基酸替换被归类为ghd7-3，而日本晴携带的等位基因因为编码蛋白含有4个氨基酸替换被归类为ghd7-2。j23b和珍汕97因为完全缺失了该基因所在片段被归类为ghd7-0(图5c)。
34.4、glw7.1的遗传转化与功能验证
35.为了确定ghd7-3等位型ghd7就是glw7.1的候选基因，我们在nil-c遗传背景下利
用crispr-cas9系统对该等位型进行了基因编辑，用于构建glw7.1基因敲除材料。我们将ghd7基因第2外显子中的序列(c.512tggccaatgttggggagagc)设计为sgrna的靶标位点，以期获得临近cct结构域的氨基酸突变(图6a)。敲除实验得到了3个等位突变型，分别命名为a1、a4和a8。缺失3bp碱基的等位突变型a4包含一个(an
→
d)的氨基酸变异但仍然保留了cct结构域。相对而言，包含1bp插入的等位突变型a1和20bp缺失的等位突变型a8都导致了cct结构域缺失的移码突变(图6b)。和预期结果一致，同在nil-c的背景下，等位突变型a1和a8产生了比a4粒形更小的种子(图6c-f)。我们同时也利用glw7.1自身启动子驱动自身cdna，在nil-j背景下，构建了glw7.1互补材料(nil-j-com家系)。如图6c-f所示，互补材料com1、com2和com3相对于转基因阴性材料nil-j-neg产生了粒形更大的种子。这些结果表明，ghd7-3就是glw7.1的功能基因。
36.5、表型考察
37.测定方法如下：
38.1)粒形的测定：
39.粒长的测定：从单株后代种子随机挑选饱满谷粒10粒，按照首尾相连，既不重叠也不留隙方式摆成一行，用游标卡尺量取数值。重复3次求其平均值即为谷粒长度。
40.粒宽的测定：从单株后代种子随机挑选饱满谷粒10粒，按照肩并着肩，既不重叠也不留隙方式摆成一行，用游标卡尺量取数值。重复3次求其平均值即为谷粒宽度。
41.2)产量相关性状的测定：
42.株高的测定：种子成熟后，利用测量尺杆量取地面到主穗顶端的距离，即为单株高度。
43.单株分蘖数的测定：种子成熟后，人工记录结实超过10个谷粒的有效穗数，即为单株有效分蘖数。
44.每穗实粒数的测定：种子成熟后，收获全部有效穗，单株脱粒后，利用数字化考种机得到单株总粒数，单株总粒数/有效穗数即为每穗实粒数。
45.单株产量的测定：种子成熟后，收获全部有效穗，单株脱粒后，利用数字化考种机得到单株谷粒重量，即为单株产量。
46.3)品质相关性状的测定：
47.垩白粒率的测定：随机选取200粒糙米，放置在底部打光的玻璃板上，正常的米粒是通透的，而有垩白的米粒有阴影，记录有阴影的米粒数目，重复3次。有垩白的米粒数目占总200粒的百分比即为糙米垩白粒率。
48.直链淀粉含量的测定：精米粉直链淀粉含量的测定参考国标ny/t2639-2014并做了简单的调整，具体步骤如下：首先，在干燥的15ml玻璃管中依次加入10
±
0.5mg的精米粉、0.1ml 95％的乙醇和0.9ml 1m的氢氧化钠，依次混匀后拧上盖子，沸水浴10min后冷却至室温，加入9ml单蒸水稀释；然后，将0.5ml稀释液加入一个新的15ml玻璃管，依次加入9.25ml单蒸水、0.2ml 1m乙酸和0.15ml 0.2％碘-碘化钾溶液，拧上盖子，上下颠倒充分混匀后静置20min；最后，将0.2ml上述混合液和四个直链淀粉含量的标准样品(0.4％，10.6％，16.2％和26.5％)的相同处理混合液分别加入透明的elisa平板，利用tecan infinite m200型多功能酶标仪在620nm波长处测定吸光度，根据标准样品的吸光度和直链淀粉含量的线性方程计算出每个样品的直链淀粉含量。每个单株样品重复测量3次，其平均值即为最
终的直链淀粉含量。
49.胶稠度的测定：称取通过200目筛的精米粉试样4份，每份100mg(按含水量12％计)于试管中。加入0.2ml 0.025％百里香酚蓝溶液(0.125g溶于95％乙醇中)，并轻轻摇动试管，使米粉充分分散，再加2.0ml 0.2m koh溶液，并摇动试管，置于涡旋振荡器上使米粉充分混合均匀，紧接着迅速把试管放入沸水浴中(最好是边震边放)，用玻璃弹子球盖好试管口，加热8min，控制试管内米胶溶液面在加热过程中维持在试管高度的三分之一至二分之一(在煮的时间段内要注意使用电吹风对锅中的试管吹冷风降温，防止管内米胶溶液溢出)。取出试管，拿去玻璃弹子球，室温静置冷却5min后，再将试管放在0℃左右冰水浴中冷却20min取出(控制好时间)。立即水平放置在铺有坐标纸(坐标纸上方最好铺上一大块透明玻璃)，事先调好水平的操作台上，在室温25
±
2℃下静置1h，即时测量米胶在试管内流动的长度(mm)，双试验结果允许差不超过7mm，取其平均值，即为检验结果。
50.食味值的测定：准备150g以上的精米，使用米粒食味计测定颗粒状态下的食味品质。每个样品设置10个生物学重复。
51.6、glw7.1影响水稻产量和稻米品质
52.我们在2021年武汉田间考察了nil材料(nil-j和nil-c)的产量相关性状。与nil-j材料相比，nil-c材料在粒长上增加了约8％(图7a)，粒宽上增加了约5％(图7b)，导致在长宽比上增加了2％(图7c)，千粒重上增加了22％(图7d)。此外，nil-c材料表现出比nil-j材料更高的株高表型(高出约33cm)(图3c和图7e)，更多的每穗粒数(多出约80％)(图7g)，但在有效分蘖数上两者没有显著差异(图7f)。最终，千粒重和谷粒数目的增加导致nil-c材料相对于nil-j材料具有更高的单株产量(增加约114％)(图7h)。
53.我们同时考察了近等基因系间部分稻米品质性状。结果显示nil-c材料的稻米相比于nil-j材料，具有更低的垩白粒率和更高的食味值，同时伴随着较高的直链淀粉含量和胶稠度(图8)。这些结果表明，来源于cr071的glw7.1基因可以同时提高水稻产量并改善稻米品质。
54.在本发明中，我们通过图位克隆，分离鉴定到一个调控水稻粒形性状的全新qtl glw7.1，并且验证到其是编码cct motif家族蛋白的ghd7的一种强等位型ghd7-3。前期报道显示，ghd7主要作为水稻抽穗期的主要调节因子，能够通过增加穗粒数提高水稻产量。本发明发现，glw7.1或ghd7-3不仅可以增加了水稻粒数，还可以增加了水稻粒重，具体表现为粒长和粒宽的增加(图7)。另一方面，glw7.1对不仅降低了稻米垩白度，同时还改善稻米蒸煮食味品质(图8)。因此，我们认为可同时增加水稻产量并改良稻米品质性状glw7.1或ghd7-3在优质高产水稻品种培育和改良方面具有极大的应用价值。
55.基于上述实验，我们可以将glw7.1基因通过传统杂交或者转基因的方法，导入到不含glw7.1基因的水稻品系中，用来提高该水稻品系产量并改善其外观品质和蒸煮食味品质。
56.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.ghd7基因在改变水稻粒形中的应用。2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述水稻粒形为水稻籽粒的粒长和/或粒宽。3.可影响水稻粒形和提高水稻产量的ghd7基因等位型，其特征在于，所述ghd7基因等位型编码的蛋白序列为seq id no:2，或seq id no:2不影响cct结构域的变体。4.根据权利要求3所述的ghd7基因等位型，其特征在于，所述ghd7基因等位型的核酸序列为seq id no:1，或seq id no:1不影响cct结构域的变体。5.一种改变水稻粒形的育种方法，其特征在于，包括改变生产所述水稻籽粒的水稻中ghd7基因等位型的步骤。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，起始水稻品系不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因，用具有含有正常cct结构域的ghd7基因的水稻品系与所述起始水稻杂交，将含有正常cct结构域的ghd7基因导入到起始水稻品系中；或者，起始水稻品系含有正常cct结构域的ghd7基因，用不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因的水稻杂交，用含有正常cct结构域的ghd7基因的水稻品系与起始水稻杂交，使起始水稻品系中的不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，起始水稻品系不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因，向起始水稻品系中插入含有正常cct结构域的ghd7基因表达框；或者，起始水稻品系含有正常cct结构域的ghd7基因，用突变或敲除的方法使起始水稻品系中不含正常cct结构域的ghd7基因或不含ghd7基因。
技术总结
本发明涉及Ghd7基因在改变水稻粒形中的应用，以及一个可改变水稻粒形的Ghd7基因等位型GLW7.1，所述GLW7.1基因编码区序列如SEQ ID NO:1所示，具体地，本发明首次揭示了Ghd7基因的等位型GLW7.1可增大谷粒形状，从而增加谷粒千粒重；同时GLW7.1降低稻米垩白并增加食味值。还涉及一种增加水稻产量和改善稻米品质的水稻育种方法，包括对生产所述稻米的稻种导入GLW7.1基因的步骤。本发明提供了一种新的基因可增加水稻产量并改善稻米品质，为水稻育种提供了新的方法和路径。供了新的方法和路径。供了新的方法和路径。
技术研发人员：
何予卿 刘荣家 高冠军
受保护的技术使用者：
华中农业大学
技术研发日：
2022.08.03
技术公布日：
2023/2/27
