中国组织工程研究 第18卷 第37期 2014–09–03出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research September 3, 2014 Vol.18, No.37
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5961
www.CRTER
恶劣捕捉
.org
黄宏宇，男，1989年生，广东省湛江市人，汉族，汕头大学医学院在读硕士，主要从事创伤骨科、骨组织工程方面的研究。
通讯作者：王大平，博士，教授，主任医师，博士生导师，深圳市第二人民医院，广东省深圳市 518035；深圳市组织工程实验室，广东省深圳市 518035无心磨床调机方法
doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.37.010 []
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)37-05961-06 稿件接受：2014-07-12
Huang Hong-yu, Studying for master’s degree, Shantou University Medical College, Shantou 515000, Guangdong Province
Corresponding author: Wang Da-ping, M.D., Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China
Accepted: 2014-07-12
黄宏宇1，刘国平2，段 莉2，
3，芳2，
3，熊建义2，
3，王大平2，
3(1汕头大学医学院，广东省汕头市 515000；2深圳市第二人民医院，
广东省深圳市 518035；3
深圳市组织工程实验室，广东省深圳市 518035)
文章亮点：
1 以软骨组织工程技术种子细胞为研究方向，选取人脐血为实验材料，利用密度梯度离心法分离出脐血单核细胞，并分别应用MesenGro 人间充质干细胞培养基和DMEM 培养基贴壁培养进行分离纯化脐血间充质干细胞，结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面，MesenGro 人间充质干细胞培养基均优于DMEM 培养基。 2 对两种培养方法进行比较，掌握了人脐血间充质干细胞体外培养的适宜条件和方法，为下一步诱导脐血间充质干细胞成软骨分化和动物实验打下基础，为软骨组织工程技术研究提供了一定的理论和实验支持。 关键词：
干细胞；脐带脐血干细胞；体外培养；脐血；间充质干细胞； MesenGro 人间充质干细胞培养基；DMEM 培养基；广东省自然科学基金 主题词：
胎血；间质干细胞；培养基；细胞，培养的 基金资助：
广东省自然科学基金项目(S2012010008129)；深圳市科创委深圳市重点实验室提升项目(ZDSY20120614154 551201)；深圳市科创委国际合作项目(GJHZ20130412153906739)；深圳市科创委科技研发资金研发项目(CXZZ20120614160234842)；深圳科创委技术攻关项目(JSGG20140519105550503)
摘要
背景：脐血中含丰富的间充质干细胞，可以作为组织工程中一种新的种子细胞来源。
目的：应用两种培养基体外培养、扩增、分离纯化脐血间充质干细胞，比较其生物学特性的差异。
方法：无菌条件下采取40份足月顺产的脐血，肝素抗凝。应用Ficoll 密度梯度离心法分离脐血单核细胞，随机分为两组，其中20份用MesenGro 人间充质干细胞培养基进行培养，20份用DMEM 培养基进行培养。对比两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量。选用生长情况良好的原代脐血间充质干细胞，用流式细胞仪检测间充质干细胞表面特异性标记表达情况。
结果与结论：M esenGro 组梭形的间充质干细胞平均出现时间、细胞集落平均出现时间、原代细胞平均培养时间、原代细胞平均数量为均优于DMEM 组(P < 0.01)。流式细胞仪检测显示，培养的细胞强
表达间充质干细胞表面标志CD73和CD105，阳性率99.1%，不表达造血干细胞表面标志CD45和CD34，阴性率99.3%。结果提示在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面，MesenGro 人间充质干细胞培养基均优于DMEM 培养基。选用MesenGro 人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。
黄宏宇，刘国平，段莉，芳，熊建义，王大平. 人脐血间充质干细胞培养方法的比较[J].中国组织工程研究，2014，18(37):5961-5966.
Comparison of methods for culturing the mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood
Huang Hong-yu 1, Liu Guo-ping 2, Duan Li 2, 3, Chen Yun-fang 2, 3, Xiong Jian-yi 2, 3, Wang Da-ping 2, 3
(1Shantou University Medical College, Shantou 515000, Guangdong Province, China; 2Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China; 3
Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen 518035, Guangdong Province, China)
Abstract
BACKGROUND: The umbilical cord blood is rich of mesenchymal stem cells, which can be used as a new source of seed cells in tissue engineering.
OBJECTIVE: To compare two methods for culturing, expanding and purifying the mesenchymal stem cells in vitro isolated from the human umbilical cord blood.
METHODS: The full-term birth cord blood of 40 cases was collected under sterile conditions with heparin
anticoagulation. Ficoll density gradient centrifugation was used to isolate the mononuclear cells from the umbilical cord blood. The cases were randomly divided into two groups according to the different culture media. Twenty cases of umbilical cord blood were cultured in MesenGro human mesenchymal stem cells culture medium (group A), and the remaining 20 cases of umbilical cord blood were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium
(group B). The occurrence time of fusiform mesenchymal stem cells and cell colony, culture time and the number of primary cells in the two groups were compared. Cells which grew well were selected t
o detect the surface markers by flow cytometry.
RESULTS AND CONCLUSION: The mean occurrence time of fusiform mesenchymal stem cells and cell colony, culture time and number of primary cells in group A were better than those in group B (P < 0.01). The strong expression of the surface markers of mesenchymal stem cells (CD73 and CD105) was found by flow cytometry, of which the positive rate was 99.1%. No expression of the surface markers of hematopoietic stem cells (CD45 and CD34) was seen, of which the negative rate was 99.3%. The number, morphology, growth rate and culture time of umbilical cord blood mesenchymal stem cells cultured in MesenGro human mesenchymal stem cells culture medium were better than those cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium. Cells cultured in MesenGro human mesenchymal stem cell culture medium can better express surface markers of mesenchymal stem cells.
Subject headings: fetal blood; mesenchymal stem cells; culture media; cells, cultured
Funding: the Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. S2012010008129; the Funds of Science and Technology Commission of Shenzhen Municipality, No. ZDSY20120614154551201, GJHZ20130412153906739,
CXZZ20120614160234842, JSGG20140519105550503
Huang HY, Liu GP, Duan L, Chen YF, Xiong JY, Wang DP. Comparison of methods for culturing the mesenchymal stem cells from human umbilical cord blood. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(37):5961-5966.
0 引言 Introduction
关节软骨是一层低摩擦、高弹性、高渗透性的软骨组
织，能够承受巨大的力学负荷，在关节活动中起重要作用，
主要由透明软骨组成。关节软骨极其脆弱且自身修复能力
低下，若未及时，75%可进行性地发展成为骨性关节
炎，严重影响生活质量。软骨缺损是骨科临床工作中面临
的难题，如创伤、肿瘤等原因会造成软骨缺损，应用组织
工程技术进行软骨缺损修复是近些年来的研究热点。
脐血中含有丰富的造血干细胞和间充质干细胞，可用
于细胞移植，多种疾病。脐血间充质干细胞来源充足，
作为骨髓间充质干细胞的替代来源，具有采集方便，免疫
原性低，发育阶段更原始、分化潜力更大等优点[1-14]。
本研究利用Ficoll-Paque密度梯度离心法分离脐血单
核细胞，并应用MesenGro人间充质干细胞培养基和DMEM培养基贴壁培养进行分离纯化脐血间充质干细胞，比较其生物学特性的差异。
1材料和方法Materials and methods
设计：细胞学对比观察实验。
时间及地点：实验于2014年2至5月在深圳市第二人民医院中心实验室完成。
材料：
脐血标本：采集自深圳市第二人民医院产科，征得家属和孕妇的同意，签署捐献脐血的同意书。产妇无急、慢性感染及血液系统疾患，新生儿为足月顺产，出生后无感染征象，采血量平均为50 mL。
实验方法：
脐血的采集：新生儿娩出后，立即剪断脐带，按顺序用生理盐水、碘伏、乙醇消毒脐静脉，注射器抽取5 mL肝素湿润管壁，针头刺入脐静脉并采集脐血50 mL，注入采血瓶，肝素抗凝，浓度20 U/mL，保存在4 ℃环境下，6 h 内对脐血进行处理。
Ficoll密度梯度离心法分离脐血单核细胞：在50 mL离心管中加入13 mL Ficoll-Paque单核细胞分离液，将肝素抗凝的脐血按3∶1的比例沿管壁缓慢滴入单核细胞分离液面之上，注意保持清楚的界面(图1)；将离心管置入离心机中，2 000 r/min，4 ℃，离心20 min。离心完成后，取出离心管，吸管插入界面层，吸取单核细胞，置入另一离心管中，生理盐水洗涤2次备用。
贴壁培养法分离纯化脐血间充质干细胞：为了探讨、比较不同培养基对脐血间充质干细胞培养、扩增、纯化的效果，作者将Ficoll密度梯度离心法分离得到的脐血单核细胞随机分为两组，20份用MesenGro人间充质干细胞培养基进行培养，20份用DMEM培养基进行培养。具体步骤如下：将准备好的细胞以1.0×106/cm2(T25培养瓶)的密度接种于MesenGro人间充质干细胞培养基/DMEM培养基中，MesenGro组按1∶24的比例加入MSCprime原代间充质干细胞添加液，加入体积分数为10%的胎
牛血清，按1∶100的比例加入青、链霉素，加入10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子，置入37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度的培养箱内培养，24 h后全量换液，弃掉未贴壁细胞，观察细人脐血间充质干细胞培养实验仪器和试剂：
试剂及仪器来源
Ficoll-Paque单核细胞分离液GE-Healthcare公司
MesenGro人间充质干细胞培养基、
MSCprime原代间充质干细胞添加液
StemRD公司
DMEM培养基、胎牛血清Gibco公司
碱性成纤维细胞生长因子Peprotech公司
Anti-CD73/FITC、Anti-CD105/FITC、
Anti-CD45/FITC、Anti-CD34/FITC
Sigma公司
PBS Hyclone公司
CO2细胞培养箱(型号：3111) 美国Thermo Fisher Scientific公司流式细胞仪(型号：Navios) 美国BeckmanCoulter公司
P.O. Box 10002, Shenyang 110180
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胞生长情况，每3 d 换液1次，待细胞长到90%融合时，用0.25%胰酶-EDTA 进行消化，显微镜下控制消化时间，按
1∶2的比例接种于培养瓶中进行传代培养。
脐血间充质干细胞的形态学观察：通过倒置生物显微镜每日观察细胞的生长情况和形态特征，并进行记录和拍照，并用细胞计数板进行细胞计数。
脐血间充质干细胞的表面标志检测：取生长良好的原
代脐血间充质干细胞，去掉培养液，PBS 洗涤2遍，加入0.25%胰酶-EDTA 进行消化，置入离心管中，将离心管置入离心机中，1 000 r/min ，4 ℃，离心5 min ，弃上清，
PBS 洗涤培养瓶，加入离心管中，再次将离心管置入离心机中，1 000 r/min ，4 ℃，离心5 min ，重复前两步操作直至培养瓶内无间充质干细胞，将得到的细胞制成细胞悬液，加入Anti-CD73/FITC 、Anti-CD105/FITC 、Anti-CD45/ FITC 、Anti-CD34/FITC ，室温孵育30 min ，Navios 流式细胞仪检测。
主要观察指标：梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、原代细胞培养时间和数量。
统计学分析：
计量数据用x
_
±s 表示，利用SPSS 21.0软件进行分析。对两组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、培养时间、原代细胞数量进行t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。
图2 接种14 d 后脐血间充质干细胞生长情况
Figure 2 Growing states of mesenchymal stem cells from the umbilical cord blood 14 days after cell seeding
图注：图中A 为采用MesenGro 培养基培养的脐血间充质干细胞，培养14 d 后可见大量的扁平梭形的间充质干细胞(×100)，破骨样细胞极少；B
为采用DMEM 培养基培养的脐血间充质干细胞，培养14 d 后可见较多的扁平梭形的间充质干细胞(×100)，但是仍有较多的破骨样细胞；C 为MesenGro 培养基培养14 d 后高倍镜下所见(×200)，间充质细胞数量多，破骨样细胞少；D 为DMEM 培养基培养14 d 后高倍镜下所见(×200)，间充质细胞数量少，仍有破骨样细胞存在。
图3 流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标志表达
Figure 3 Detecting the surface markers of mesenchymal stem cells from the umbilical cord blood by the flow cytometer
图注：扩增后的脐血间充质干细胞强表达间充质干细胞的表面相关抗原CD73、CD105，阳性率99.1%，不表达造血干细胞表面标志CD45、CD34，阴性率99.3%。
图1 Ficoll 密度梯度离心法分离脐血单核细胞
Figure 1 Ficoll density gradient centrifugation was used to isolate the mononuclear cells from the umbilical cord blood
图注：图中A 为离心前，上层为肝素抗凝的脐血，下层为Ficoll-Paque
单核细胞分离液；B 为离心后，明显分为3层，上层浅黄为血浆，中间白雾层为Ficoll-Paque 单核细胞分离液，单核细胞在血浆与白雾
层中间的界面层，最下层为红细胞。
相册内页
A
B
RBCs
Ficoll
Plasm
P .O. Box 10002, Shenyang 110180
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2 结果 Results
2.1 不同培养方法对脐血间充质干细胞的影响 MesenGro 组细胞接种于MesenGro 人间充质干细胞培养基后，漂浮于培养液中，多为圆形或不规则形，接种平均24 h 后出现贴壁细胞，更换培养基后细胞继续生长。接种平均7 d 后，细胞胞体逐渐长大，出现零散的成纤维样的扁平梭形的间充质干细胞，单个核，剩下部分为破骨样细胞，胞体大，呈圆形，多个核，以间充质干细胞居多。接种平均10 d 后，细胞迅速增殖，破骨样细胞逐渐减少，间充质干细胞呈片状生长，出现大量的扁平梭形的间充质干细胞。接种平均14 d 后，破骨样细胞进一步减少，扁平梭形细胞进一步增多(图2)。接种平均21 d 后，细胞生长达80%-90%贴壁，呈形态均一的扁平梭形的间充质干细胞，形态类似于骨髓间充质干细胞，较骨髓间充质干细胞稍小。DMEM 组接种于DMEM 培养基，梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、原代细胞培养时间、原代细胞数量与MesenGro 组相比差异有显著性意义(表1)。
2.2 脐血间充质干细胞的表面抗原特性 流式细胞仪检测结果显示(图3)：扩增后的脐血间充质干细胞强表达间充质干细胞的表面相关抗原CD73、CD105，阳性率99.1%，不表达造血干细胞表面标志CD45、CD34，阴性率99.3%，表明实验所培养的细胞是间充质干细胞而非造血干细胞。
3 讨论 Discussion
脐血间充质干细胞的含量明显少于骨髓间充质干细胞，仅占0.000 1%[15]3.1 脐血间充质干细胞分离缀花草坪
和培养方式的选择 间充质干细胞的分离方法主要有密度梯度离心联合贴壁培养法、羟乙基淀粉沉降法、免疫磁珠法和流式细胞分析法。密度梯度离心法简单易行，对细胞损伤小，可以很好地保持细
胞活性，应用较为广泛。免疫磁珠法和流式细胞分析法分离的间充质干细胞纯度较高，但分离过程较繁琐，且容易影响细胞活性，对样本要求较高，且费用高昂，故未得到广泛应用，因此，脐血间充质干细胞的培养是比较困难的，选择合适的培养方式对于脐血间充质干细胞体外培养成功与否起到关键作用，实验采用不同的培养方法体外培养脐血间充质干细胞，探讨脐血间充质干细胞合适的培养条件。
[16-34]。因此，本实验采用了Ficoll 密度梯度离心分离法。
赵春生等[35]采用密度梯度离心法(1 500 r/min 离心 15 min)结合直接贴壁法体外分离脐血间充质干细胞，加入含体积分数为10%人脐血血清、5 μg/L GM -CSF 、 15 μg/L 白细胞介素3的DMEM/F12培养基，调整细胞密度为1×1010 L -
1接种于人脐血血清包被过的塑料培养瓶中，
3 d 后首次换液，去除未贴壁细胞，以后每隔2
4 h 换液1次。当培养瓶中的细胞生长到80%融合时，胰酶-EDTA 混合液消化传代，上述方法可成功分
离出人脐血间充质干细胞，且培养周期较短，细胞纯度较高，贴壁细胞稳定表达间充质干细胞表面相关抗原。
如何选择合适的培养基和细胞因子，决定了脐血间充质干细胞培养的成功与否。马金本等[36]在未经处理的6孔板上，用添加有内皮细胞培养基的内皮细胞基础培养液可以培养出生长良好、增殖旺盛的间充质干细胞，应用纤维连接蛋白和25 cm 2细胞培养瓶培养的效果不佳。王利培等[37]将脐血单个核细胞以1×1011 L -
1高密度接种在体积分数为
5%低胎牛血清浓度的低糖DMEM 培养基中、胎牛血清包被培养瓶等条件下，可以在体外成功的培养出较纯化的脐血间充质干细胞，其培养成功率和间充质干细胞纯度较高。Lee 等[38]在含有体积分数为20%胎牛血清的IMDM 培养基中加入10 μg /L 的人碱性成纤维生长因子，100 U 青霉素， 1 000 U 链霉素，2 mmol/L L -谷氨酰胺，利用单细胞克隆的方法，培养出具有多向分化潜能的间充质干细胞。Bieback 等[2]利用DMEM 低糖培养基联合体积分数为10%胎牛血清，培养出了优质的间充质干细胞，对比骨髓间充质干细胞无明显差异。Peters 等[39]3.2 脐血间充质干细胞检测抗体的选择 要确定培养的细胞是否间充质干细胞，可以利用流式细胞仪检测其表面标志。目前的研究认为间充质干细胞的表面抗原没有特异性，既有上皮细胞的特征，又有内皮细胞的特征，但不表达造血干细胞的表面标志在
DMEM 培养基中加入人干细胞因子、白细胞介素6、FMS 样酪氨酸激酶3、表皮生长因子、纤维细胞生长因子β、肝细胞生长因子、制瘤素M 、巨核细胞生长发育因子等，最终培养出表达间充质干细胞表面相关抗原的间充质干细胞。本实验采用了两种不同的培养基进行培养，MesenGro 组选择了MesenGro 人间充质干细胞培养基，并加入其专用的MSCprime 原代间充质细胞添加液进行培养，经过观察发现，细胞增殖迅速，表现出良好的均质性和细胞形态。DMEM 组采用了DMEM 培养基复合体积分数为10%胎牛血清，结果发现细胞生长情况一般，贴壁细胞中梭形的间充质干细胞数量较少。
[40-45]。迟作华等[46]表1 不同培养方式对脐血间充质干细胞培养的影响
总结了间充质
Table 1 Effect of different methods on culturing umbilical cord blood mesenchymal stem cells (x _
±s ) 表注：MesenGro 组梭形的间充质干细胞出现时间、细胞集落出现时间、原代
培养时间、原代细胞数量优于DMEM 组，差异具有显著性意义(P < 0.01)。
项目
MesenGro 组 DMEM 组 t P 梭形间充质干细胞
stc2052出现时间(d) 6.75±0.97 10.45±1.50 8.22
< 0.01
细胞集落出现时间(d)
9.90±1.12 14.95±1.57 12.63 < 0.01 原代培养时间(d) 19.95±1.40 28.60±1.90 16.06 < 0.01 原代细胞数量
(8.15±0.35)×105
(6.34±0.63)×105
7.14
< 0.01
干细胞主要表面相关标志：CD13、CD44、CD51、CD54、CD29、CD49b、CD49e、CD73、CD90
、CD105、HLA-ABC、ASMA、CD166等，不表达造血细胞的表面标志：CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD38、CD133、CD135、CD117、糖蛋白A等，也不表达与人白细胞抗原(HLA)识别有关的的共刺激分子B7-1，B7-2及主要组织相容性复合物Ⅰ类分子如HLA-DR抗原等。本实验采用原代细胞，常规消化、洗涤后，加入CD73-FTIC、CD105-FTIC、CD45-FTIC、CD34-FITC，室温孵育30 min，流式细胞仪计数细胞，利用仪器自带软件进行分析，发现脐血间充质干细胞表达间充质干细胞表面标志CD73、CD105，不表达造血干细胞表面标志CD34、CD45，上述研究结果表明该细胞是间充质干细胞。
3.3 结论与展望 综上所述，在培养间充质干细胞的数量、形态、生长速度和培养时间诸方面，MesenGro人间充质干细胞培养基均优于DMEM培养基。选用MesenGro 人间充质干细胞培养基可以更纯、更快、更好地从脐血中培养出表达间充质干细胞表面标志的细胞。脐血间充质干细胞可作为软骨组织工程的一种新的种子细胞来源，相对来说具有来源丰富、免疫原性弱、对患者损伤小等优点，在细胞软骨缺损中起着越来越重要的作何用，并逐渐被人们所接受。脐血间充质干细胞移植为软骨缺损等疾病提供了一种新的方法，相关研究也在积极开展，相信不久的将来，存在的问题将一一解决，脐血间充质干细胞移植将解决软骨缺损难的问题，造福更多患者。
致谢：感谢深圳市第二人民医院骨科、再生医学科、产科的全体工作人员。
作者贡献：实验设计为第一作者和通讯作者；实验实施为第一作者、第四作者；实验评估为第三作者、通讯作者；资料收集为第一作者、第四作者；第一作者成文；第二作者、通讯作者审校；第一作者、通讯作者对文章负责。
利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。
伦理要求：脐血采集自深圳市第二人民医院产科，采血征得家属和孕妇的同意，签捐献脐血的同意书。实验方案获得医院伦理委员会批准。
学术术语：Ficoll密度梯度离心法-是利用不同颗粒之间存在沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带，根据血液中各成分比重的不同：红细胞>中性粒细胞>淋巴细胞>单核细胞>血浆(包括血小板)，用Ficoll-Paque单核细胞分离液(相对密度为1.077±0.001，介于中性粒细胞与淋巴细胞之间)将脐血细胞分成不同的层次。
作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。4 参考文献 References
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ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH5965
