ALyS505NK-KIT
【实验材料】
（1）ALyS505NK-A(1ml)、ALyS505NK-B(40ml)、ALyS505NK-C(1ml)、ALyS505NK-EX；（2）IL-2(Proleukin；18x106IU/vial重组人类IL-2)；
（3）灭活的自体血浆；
（4）悬浮培养专用细胞培养瓶(75cm2、175cm2)；
（5）一次性注射器50ml，洗细胞专用生理盐水或林格氏液；
（6）淋巴细胞分离液；
（7）其它细胞培养用设备。
【操作方法】
*所有的工作必须在无菌室中进行，请遵守无菌室工作规范，使用灭菌过的设备。 3d打印机制作1、培养瓶抗体包被
（1）在T-75cm2培养瓶中，加入8ml PBS和1ml ALyS505NK-A包被液；
（2）轻轻摇晃培养瓶，让混合液在培养瓶表面均匀分布；打捞沉船
（3）在室温下，放置30-40min或者4℃保存直到使用前取出，移除包被液；
（4）用10ml PBS清洗培养瓶一次，洗过的培养瓶要立即使用，注意清洗时，勿刮擦到已包被好的瓶底。
2、制备热灭活人类血浆、血液分离
（1）将40ml血液采集至50ml离心管，3000rpm、10min，取上层血浆移到新的离心管，56˚C、30min灭活，3000rpm离心10min，用吸管将上清液采集至灭菌过的试管，保存在冰箱中，直到使用前取出；
（2）余下的细胞加PBS若干量，稀释细胞至50ml，混合均匀，缓慢移入两个装有15ml淋巴分离液的离心管内；
（3）室温下(大约20℃)，1600rpm离心30min（缓慢加速，缓慢减速）；
（4）离心后，血液被分为4层，由血浆(少量)、血浆和分离液之间的单个核细胞(第2层)、Lymphoprep(第3层)和红细胞层(底层)构成。
3、制备PBMC
（1）用吸管将第2层单个核细胞收集至新的离心管中；
（2）加入30ml PBS稀释收集细胞，1200rpm离心5min，沉淀细胞；人体穴位模型
（3）移除上清液，40ml PBS重悬细胞，取样进行细胞计数，1200rpm离心5min，收集细胞。
4.NK细胞增殖诱导
4.1PBS清洗后单个核细胞加入40ml ALyS505NK-B培养基和2ml自体灭活血浆，使细胞密度>1x106cells/ml，重新悬浮PBMC；
4.2在抗体已附着的T-75cm2培养瓶中加入细胞悬浮液，细胞平铺培养瓶，在5%CO2培养箱37℃孵育。
5、培养基的配制
5.1活化培养基的配制
在500ml ALyS505NK-EX培养基内加入1ml ALyS505NK-C，均匀混合后放置2-8℃保存，备用；
5.2扩增培养基的配制
ALyS505NK-EX内加入IL-2（700IU/ml），均匀混合后放置2-8℃保存，备用。
6、细胞活化与扩增培养
6.13Days，将培养瓶中的细胞液移至50ml离心管中，取200-300µl细胞液进行细胞计数；离心管中的细胞1200rpm离心5min；移除上清液，收集细胞；
※注【1、培养瓶中若有贴壁细胞残留，可直接添加活化培养基20ml和自体灭活血浆1ml，在5%CO2光杆排线器
半透明纸
培养箱37℃孵育；2、D5、D7根据细胞生长的状况及颜添加活化培养基，直至D9天转移至细胞培养袋扩大培养。】
6.2根据细胞计数结果，添加活化培养基（约40ml），并添加10%的自体灭活血浆（约4ml），使细胞密度保持在1x106cells/ml，重悬至T-175cm2培养瓶中，在5%CO2培养箱37℃孵育；
6.35Days，取细胞培养物进行细胞计数，根据细胞数量、增殖生长、颜变化情况添加活化培养基（约100ml）和灭活自体血浆（约5ml），在5%CO2培养箱37℃孵育；
6.47Days，取细胞培养物进行细胞计数，根据细胞数量、增殖生长、颜变化情况添加活化培养基（约340ml）和灭活自体血浆（约5ml），分别置于2个细胞袋培养，在5%CO2培养箱37℃孵育；
6.59Days，取细胞培养物进行细胞计数，根据细胞数量、增殖生长、颜变化情况分别添加扩增培养基（约700-900ml）平均加入2个细胞袋中，在5%CO2培养箱37℃孵育；
注：【原来D0天培养瓶贴壁的细胞培养至9Days平均转入2个细胞袋中继续扩大培养】
6.611Days，取细胞培养物进行细胞计数，根据细胞数量、增殖生长、颜变化情况分别添加扩增培养基（约800-900ml）平均加入2个细胞袋中，在5%CO2培养箱37℃孵育；
6.713Days，取细胞培养物进行细胞计数，根据细胞数量、增殖生长、颜变化情况分别添加扩增培养基（约500ml）平均加入2个细胞袋中，在5%CO2培养箱37℃孵育。
【细胞检测】
培养到14/15Days取少量培养细胞进行细胞计数、细胞活性、细胞表型、细菌培养、真菌培养、支原体检测及内毒素检测。
【细胞收集】
（1）经过14/15Days的培养，将所有细胞悬浮液收集至无菌离心瓶中，1200rpm离心5min，沉淀细胞；
（2）用林格氏液清洗两次，并且重复离心；
（3）用含有1%人类血清白蛋白的林格氏液或生理盐水重新悬浮细胞。
【注意事项】
（1）非最后的确定版本，随着研究的进步，日后会继续更新；
（2）根据日本药事法执行管理咨询，培养基仅供研究使用；
（3）严禁将这个培养基直接注射至人体；
（4）培养基请在标签上标示的效期之前使用；
（5）培养基含有临床等级的人类血液蛋白，操作时请特别小心；夏桑菊对新型冠状病毒有效吗
（6）操作法中的培养基，不保证NK细胞可自行增殖，选择特定的体外NK细胞生长进剂是相当重要的；
（7）本操作法仅适用于ALyS505NK-KIT与ALyS505NK-EX培养基配合使用，其它培养基不适用；
（8）细胞培养袋的使用详细内容请参考其使用说明书。
【生产企业】
生产企业：日本细胞科学研究所
生产地址：日本国仙台市青叶区西花苑一丁目16番16号
电话：022-399-6608FAX：022-399-6638
中国公司：珠海贝索细胞科学技术有限公司
地址：珠海市吉大景园路1号517
电话：0756-33555050756-3358197
