中华内分泌外科杂志2021年2月第15卷第2期Chin J EndocrSurg，April 2021，Vol. 15,No.2— 171—
•论著•LncRNA HCG18 调控 miR-185-5p/AGER
轴影响糖尿病肾病内质网应激和自噬
高婵1陈琦1严佳胜2王鸣1费晓1赵宁1
1浙江大学附属杭州市第一人民医院腎内科 310006;2浙江中医药大学附属第一医院泌尿
外科 310006
通信作者：起宁，Email:*******************，电话：135****0090
【摘要】目的本研究旨在探讨L n c R N A H C G18调控m i R-185-5p/A G E R轴对糖尿病肾病（diabetic nephropathy, D N)内质网应激和自噬的影响。方法收集D N患者肾脏组织，建立高糖（high glU C〇Se，H G)诱导
的足细胞损伤模型。检测D N患者肾组织与D N细胞模型中H C G18的表达。确定H C G18在细胞中的 定位表
达。证实H C G18与m i R-185-5p、m i R-185-5p与晚期糖基化终产物特异性受体（a d v a n c e d glycosylation end-
product specific receptor，A G E R)的调控关系。q R T-P C R和 western blot 检测内质网应激相关因子（C H O P、
X B P1)及自噬相关因子(B e d i n-l、p62)的表达。结果相对于非D N患者，D N患者肾组织中H C G18高表达(P<
〇.〇5)。相对于正常糖(normal gluc〇S e，N G)组，H G模型中内质网应激相关因子(C H0P、X B P1)的m R N A和蛋白 表达增加而自噬相关因子B e c l i n-1的m R N A和蛋白表达被抑制，p62的m R N A和蛋白表达增强（均P<0.05)。
H C G18通过调控m i R-185-5p/A G E R轴发挥生物学作用。敲低H C G18能减轻内质网应激，激活自噬并减少足
细胞损伤，该作用被m i R-185-5p抑制剂部分逆转。结论H C G18调控m i R-185-5p/A G E R信号轴并通过调控
内质网应激和自噬促进D N的发生。
【关键词】L n c R N A H C G18;m i R-185-5p；晚期糖基化终末产物特异性受体；糖尿病肾病；内质
网应激；足细胞
基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（2019K Y129)
D01：10.3760/l 15807-20201213-00391
LncRNA HCG18 affects endoplasmic reticulum stress and autophagy in diabetic nephropathy via regulat
ing miR-185-5p/AGER axis Gao Chan1, Chen Qi1, Yan Jiasheng2, Wang Ming1, Fei Xiao1, Zhao Ning1
'Department of Nephrology, Hangzhou First People's Hospital Affiliated to Zhejiang University, Hangzhou
310006, China; 2Department of Urology Surgery, the First Affiliated Hospital o f Zhejiang University of Traditional
Chinese Medicine, Hangzhou 310006, China
Corresponding author: Zhao Ning, Email:*******************，Tel:135****0090
【Abstract】Objective T o explore the effects of L n c R N A H C G18o n e n d oplasmic reticulum stress a n d
autophagy via regulating m i R-185-5p/A G E R axis in diabetic nephropathy (D N) . Methods T h e kidney tissues of
patients with D N w e r e collected a n d the podocyte injury m o d e l i nduced by high glucose (H G)w a s established.
T h e expression of H C G18in renal tissue in D N patients a n d cell m o d e l w a s detected. T h e localization a n d e x
pression of H C G18 in cells w e r e determined. T h e regulatory relationship b e t w e e n H C G18a n d m i R-185-5p, m i R-
185-5p a n d A G E R w a s testified. Q R T-P C R a n d western blot wer e u sed to detect the expression of endoplasmic
reticulum stress related factors (C H O P,X B P1)a n d autophagy related factors (Beclin-1, p62). Results C o m p a r e d
with n o n-D N patients, H C G18 w a s overexpressed in renal tissue of D N patients(P<0.05). C o m p a r e d with normal glu
cose (N G) group, m R N A a n d protein expression of endoplasmic reticulum stress related factors (C H O P,X B P1)
w e r e overexpressed but m R N A a n d protein expression of autophag>r related factors Beclin-1wer e inhibited, p62
m R N A a n d protein expression w e r e increased (all P<0.05). H C G18regulated the m i R-185-5p/A G E R axis a n d
played a biological role. K n o c k i n g d o w n of H C G18 reduced e ndoplasmic reticulum stress, activated a utophagy a n d
reduced podocyte injury, but this effect can b e partially reversed by m i R-185-5p inhibitors. Conclusion H C G18
regulates the m i R-185-5p/A G E R signal axis a n d promotes D N progression through regulating endoplasmic reticu
l u m stress a n d autophagy.
【Key words】L n c R N A H C G18; miR-185-5p;A G E R X;Diabetic nephropathy; E n d o p l a s m i c reticu
l u m stress; Podocyte
Fund program: Zhejiang M edical a n d Health Science a n d Techn o l o g y P r o g r a m(2019K Y129)
D O I：10.3760/l 15807-20201213-00391
蚊帐 不锈钢 落地-172—中华内分泌外科杂志2021年2月第15卷第2期Chin J EndocrSurg,April 2021,Vol. 15,No.2
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，D N)是糖尿 病最常见的微血管并发症之一，约有30%左右的糖 尿病患者伴有D N，故到D N的分子标志物，深人 了解D N的发病机制刻不容缓叱长链非编码R N A (long non-co【丨ing RN A,L n c R N A)是一类不具有蛋白 质编码功能的、长度在200个核苷酸以上的RNA, 具有多种生物学功能，最常见的是充当微小RNA(mi cro RNA, miRNA)的竞争性内源 RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)，抑制 microRNA 的表达。已有研究发现LnrRNA H C G18通过海绵化miR- 146a-5P调控巨噬细胞募集与高钙化来延缓髓核细 胞的生长[2]。巨噬细胞介导的炎症反应是D N发病 的重要原因，人类白细胞抗原复合体18(leucocyteanti gen complex group 1民H C G18)可调控 miR-146i/TRAF6 轴，通过促进M l巨噬细胞极化来促进糖尿病周围 神经病变pi。但H C G18对于D N的作用机制还未明 确。miR-185-5P被证实是H C G18的下游靶点，以往 研究发现miR-185可被circRNA H I P K3吸附，从而 抑制miR-185在D N中的保护作用叱另外本研究 证实晚期糖基化终产物特异性受体(advanced g l y_ cosylation end-product specific receptor^AGER)是miR- 185-5p的下游靶基因，A G E K也被称为R A G E，且 研究发现R A G E信号转导在D N的发病机制中发 挥着重要作用|5)。在此基础上，本研究将对HCG18 吸附miR-185-5p调控A G E R这一分子通路在D N 发病中的作用进行探究。
1材料和方法
1.1细胞和临床标本收集
人肾足细胞购自北京北纳联创生物技术研究 院。临床标本来源于2019年10月至2020年1月于浙江大学附属杭州市第一人民医院就诊的40例 D N患者，其中男19例，女21例，年龄范围49〜67 岁。纳人标准:①符合糖尿病肾病的诊断标准，A C R 在 30~300 pg/(g.Cr)，肾小球过滤率在 30~59 ml min/ 1.73 m2;②自愿纳入本研究且血肌酐低于265 (xmol/L。排除标准:①合并有发热、肿瘤、贫血、妊娠等不利 于尿蛋白准确测定者；②排除原发性肾炎、肾病综 合征及高血压肾病等造成肾脏损害的患者。2018 年7月至2020年2月于本院行肾肿瘤切除术患者 的正常肾组织10例作为对照组，正常肾组织的切除 遵守距离肿瘤原发灶至少3 c m以上的原则，收集到 的标本在-80尤下保存备用。本研究经本院医学伦 理委员会批准（批号：256132YJ)，所有患者对研究 内容均知晓并签署知情同意书。
1.2试剂与仪器
McCoy’s 5a完全培养基购自武汉普诺赛公司。胎牛血清（f e t a l bovine serum ,FBS)、青链霉素混合 液、葡萄糖、E C L超敏发光液购自北京索莱宝公司。TRlzol试剂、放射免疫沉淀裂解液、聚偏二氟乙烯 膜购自美国 Thermo Fisher 公司。First-Strand cD NA Synthesis SuperMix 试剂盒、Tip Green qPCR Super- M i x试剂盒购自北京全式金公司。引物购自南京金 斯瑞公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂 盒购自上海翊圣公司。荧光原位杂交试剂盒购自广 州伯信公司。活性氧（reactive oxygen species，R0S) 检测试剂盒、B C A蛋白浓度检测试剂盒购自上海碧 云天公司。
QuantStudio 5实时荣光定量P C R系统购自美 国 Thermo Fisher 公司。Novocyte Advanteon 流式细 胞仪系统购自美国安捷伦公司。
1.3实验方法
夺刀器1.3.1细胞培养与转染人肾足细胞置于90% McCoy’s 5a完全培养基，添加10% F B S、100个单位 青链霉素混合培养液，在37丈、含有5% (：02的培 养箱中培养。当细胞密度达到70%，加入5 m M葡萄糖，在培养箱中放置1周。再添加33.3 m M葡萄 糖继续培养1周以建立高糖(high glucose,HG)诱导 的足细胞损伤模型。将足细胞分为如下组：正常糖 (normal glucose，N G)组、si-NC 组（转染 HCG18 阴性对照质粒）、si-HCG18 (转染si-HCG18质粒）、s i-HCG18+miR-NC(转染 si-HCG18 质粒和 miR-185-5p inhibitor 阴性对照）、si-HCGl8+miR-185 inhibitor (转染 si-HCG18 质粒和 miR-185-5p inhibitor)、s i-A G E R(转染 si-AGER 质粒）、si-AGER+miR-NC(转 染 si-AGER 质粒和 miR-185-5p inhibitor 阴性对 照）、si-AGER+miR-l 85-5p inhibitor (转染 si-AGER质 粒和 miR-185-5p inhibitor)。使用 Lipofectamine 3000 转染试剂按照说明书的要求将以上质粒和序列转 染到细胞中，48 h后做后续研究。
1.3.2 qRT-PCR检测相关因子mRNA表达TR-lzol试剂用于从组织和足细胞中提取总只熟。^!^- Strand c D N A Synthesis SuperMix 试剂盒用于合成c D N A〇Tip Green qPCR SuperMix 试剂盒用于定量 R N
A，结合QuantStudio 5实时荧光定量P C R系统 进行检测。以上操作步骤均按照试剂盒说明书进 行。U6作为miR-185-5p的内参，其他基因的内参 使用G A P D H。相对表达量使用2_MC•进行计算。所 需引物序列见表1。
1.3.3 FISH检测HCG18的亚细胞定位将细胞制成爬片常规包埋固定。加人通透液孵育lOmin, P B S清洗3次。滴加蛋白酶K工作液孵育，15min后
中华内分泌外科杂志2021年2月第15卷第2期 Chin J EndocrSurg，April 2021，Vol. 15,No.2
个人飞行器
—173—
DN(-)
DN(+)
(〇)
D N (-) D N (+) 0
注：与D N (-)组相比，a P<0.05。D N 为糖尿病肾病，D N (-)为非D N 患者肾组织，D N (+)为D N 患者肾组织
图1 D N 患者中内质网应激、自噬相关因子与H C G 18的检测、A :q R T -P C R 检测D N 患者组织中C H O P 的表达；B :q R T -P C R 检测D N 患者
组织中X B P 1的表达；C :q R T -P C R 检测D N 患者组织中B e d i n -1的表达；D :q R T -P C R 检测D N 患者组织中P 62的表达；E :q R T -P C R 检测D N 患 者组织中H C G 18的表达。
使用P B S 清洗2次。对细胞爬片进行再固定并使用 梯度乙醇脱水。在细胞爬片上滴加预杂交液盖膜孵
育。30m m 后滴加杂交反应液，73 1下孵育，5min 后转移到53 °€的杂交液中过夜孵育。D A P I 避光染 核，P B S 清洗2次，暗室中晾干。在荧光显微镜下拍 照观察。
1.3.4双荧光素酶报告实验验证靶向关系将含
有miR-185-5p 序列的H C G 18、A G E R 的野生型片 段或突变型片段进行扩增，克隆到P G L 3报告载体 上。足细胞接种到24孔板，使用Lipofectamine 3000 转染试剂将报告载体分别与miR-185-5p mimic 或 阴性对照miR-NC 共转染到足细胞中。
1.3.5 Western blot 检测相关因子蛋白表达放 射免疫沉淀裂解液裂解样本，提取总蛋白，检测总 蛋白的浓度。蛋白电泳后转移到聚偏二氟乙烯膜， 室温下孵育1 h。加入稀释后的一抗（1:1 000)CHOP、 X B P 1、Beclin-l、P62、G A P D H 过夜孵育。TBST 洗涤 后加人二抗IgG，孵育1 h 后加入E C L 超敏发光液 使蛋白信号可视化。以G A P D H 为内参检测蛋白灰度。
1.4统计学分析
用 SPSS 23_0 进行数据分析，GraphPad Prism 9.0软件进行图表绘制。结果以3次实验后的均值±
电源外壳标准差(x )进行表示。两组间或多组间的差异分 析则使用Student’s «检验与单因素方差分析法来 完成。P<0.05为差异有统计学意义。
2
结果
2.1 qRT -PCR 检测D N 和非D N 患者肾组织中相 关因子mRNA 表达情况
q R T -P C R 实验发现D N 患者肾组织中，内质网
应激相关因子C H 0P 、X B P 1的m R N A 和蛋白表达 升高（均P<0_05)(图1 A ~B )，自噬相关因子Beclin- 1表达下降，而P62表达上调(均P<0.05)(图1C~D), 且H C G 18在D N 患者肾组织中的表达较正常肾组 织明显升高(P<〇.〇5)(图1E)。
2.2 qRT-PCR 与 western blot 检测 NG 和 HG 细 胞模型中内质网应激和自噬相关因子的表达
在体外H G 诱导的人肾足细胞损伤模型中，
表1 q R T -P C R 引物序列表
基因名称
引物序列（5’-3’）
上游
下游
H C G 18A G T C C C G T A A G T C G G C A G G T T G C A A C G G G C C C T T A G m i R -185-5p G G G T C C A C C A A T G C A T G C A A A A G C T T T G C G A C T G C A T G G G A G E R G C C C G T A A A G T T T G C A A A C G G G T C A A C G T G A A A A C T T T G A C H O P G G G A A A C T T T G T A C G G G G T T T C C C A G T C G G A C T G X B P 1T T T C G A C G T G A T G T C A A A C C T T T A G T G G C A A A T G C A T Beclin-1C C T A G C T C C C A T G C A T G C C G T A A A G T C T T C G G G A T G p 62
G T T T C C A A A G T C G A A C G T G
A A C G T A A C G G T C G A T G C T G
©
*
胡撇友 &M I .E 1!.
會
⑧
基
.0W ^.O
.5
2.L L
0.
懈友毋wax
l
r ^-f -x ^o c l o u H
备
A
T
：一均懈
友
&M0H
C
J
— 174—中华内分泌外科杂志2021年2月第15卷第2期 Chin J EndocrSurg,April 2021,V 〇1.15，N 〇.2
qRT-PCR 与 western Wot 检测结果显示 C H 0P 、XBP1
的m R N A 和蛋白表达在细胞模型中较对照组明显 升高（均P<0.05)(图2A ~D )。自噬相关因子检测结 果显示，较N G 组，H G 组细胞模型中Beclin-1的 m R N A 与蛋白表达降低CP<0.05)(图2E~F)，而p6
2 表达水平升高(P<〇.〇5)(图2G 〜H )。
2.3 miR -185-5p 和HCG 18的靶向关系验证
通过 LncRNASNP2 (bioinfo_life./lncRNASNP/#! /)网站发现 miR-185-5p 可能是 H C G 18的下游靶基因（图3A)。双荧光素酶报告实 验发现H C G 18-W T 与miR-185-5p mimic共转染细 胞中的荧光素酶活性较对照组显著降低(P<0.05), 而 H C G 18-M U T 与 miR-185-5p mimic 共转染组中 的荧光素酶活性无明显变化(办〇.〇5)(图3B)。FISH 实验证实H C G 18在细胞质中有表达（图3C)D qRT- P C R 实验发现在D N 患者的肾组织与H G 细胞模 型中，miR-185-5p的表达显著降低（均P<〇.〇5)(图 3D 〜E )。且miR-185-5p与H C G 18的表达呈负相关 (P>0.05)(图3F)，敲低H C G 18可显著提高miR- 185-5p 的表达（朽0.05)(图 3G )。
2.4 qRT-PCR 与 western blot 检测 HG 细胞模型 中内质网应激和自噬相关因子的表达
进一步验证H C G 18是否通过调控miR-185-5p 参与D N 的内质网应激与足细胞损伤过程，首先在 H G 细胞模型中敲低H C G 18的表达，结果发现较si-NC 组，si-HCG18 组细胞中 C H 0P 、XBP1 的 m R N A 和 蛋白表达明显下降（均P<〇.〇5)(图4A ~B )。此外， 相较 si-NC 组，si-HCG18 组 Beclin-1 的 m R N A 与蛋
白表达升高，p 62的m R N A 与蛋白表达降低（均P< 0.05)(图 4C ~D )。在加人 miR-185-5p inhibitor 后， si-HCG18的作用被部分挽救，这说明m iR-185-5P
inhibitor部分拮抗了 si-HCG18的作用，H C G 18通 过调控miR-185-5p对足细胞的内质网应激和足细 胞损伤产生促进作用。
2.5双荧光素酶报告实验和qRT-PCR 验证AGER 和miR -185-Sp 的靶向关系
通过 Targetscan (ht tjx//www .t a r g e t s c a r L 〇r g V e r t _72/) 网站发现A G E R 可能是miR-185-5p的下游靶点 (图5A )，双荧光素酶报告实验证实二者存在相互 作用关系（图5B)。q R T -P C R 实验表明敲低H C G 18 可以抑制A G E R 的m R N A 表达，加入miR-185-5p inhibitor 后，A G E R 的表达上调 （均 P<0.05)( 图 5C)。 2.6 qRT-PCR 与 western blot 检测 HG 细胞模型 中内质网应激和自噬相关因子的表达
敲低A G E R 的表达可以抑制C H 0P 、X B P 1的 m R N A 与蛋白的表达，促进Beclin-1表达同时也抑 制p 62的表达，说明敲低A G E R 能够抑制内质网应 激并诱导足细胞自噬。与si-AGER+miR-NC组相 比，si-AGER+miR-185-5p inhibitor 组中 C H O P 、XBP1 的m R N A 与蛋白表达上调，Beclin-1表达被抑制同 时p 62的表达被促进（均P<0.05)(图6A ~D )。该实 验结果说明敲低A G E R 对足细胞的作用可被miR- 185-5p inhibitor 部分括抗。
3
讨论
LncRNA H C G 18在很多疾病中都有研究，比如
注：与N G 组相比,《P<0.05。N G 组为正常糖组，H G 组为高糖组
图2 ^^细胞模型中内质网应激相关因子、自噬相关因子检测。人、8:9[«'101^与《1(^(!〇11)1〇1检测140细胞模型中（：}10?的表达；(：,0:
q R T -P C R 与 western blot 检测 H G 细胞模型中 X B P 1 的表达；E 、F :q R T -P C R 与 western blot 检测 HG 细胞模型中 Beclin-1 的表达；G 、H :q R T -P C R
与western blot 检测H G 细胞模型中p 62
的表达
中华内分泌外科杂志2021年2月第15卷第2期 Chin J Endocr Surg，April 2021，Vol. 15,No.2
— 175—
miR-185-5p:3，GACAGGGGGUCCGGACAUGGUC
: I I I I I I I I 5,HCG18:
5，
• I I I I I I I I A TA CTG G CA CTA TCTG TA CCA T
3,
注：与s i -N C 组相比，a P <0.05；与Si -H C G 18+m i R -N C 组相比，b P<0.05: H G 为高糖，N G 组为正常组，si-NC 组为转染H C G 18阴性对照质粒，miR-
N C 组为 miR-185-5p inhibitor 阴性对照
验证码自动输入图4 H G 细胞模型中内质网应激相关因子、自噬相关因子检测。A :q R T -P C R 与western blot 检测H
孕妇袜
G 细胞模型中C H O P 的表达;B :q R T -P C R 与western blot 检测H G 细胞模型中X B P 1的表达；C :q R T -P C R 与western blot 检测H G 细胞模型中Beclin-1的表达；D :q R T -P C R 与western blot 检 测H G 细胞模型中P62的表达
| min—1S (.
| m iH - l85-5p n
-
■L
H(：(；I8-WT H C C I8-M IT (R)
NG HC r e 18 20 22 24 26 28 免、 si-N C si-H C C l 8 ^
注：与N G 组相比，a P<0.05；与miR-NC 组相比，b P<0.05；与si-NC 组相比/P<0.05。N G 组为正常组，si-NC 组为转染HCG18阴性对照质粒，
miR-NC 组为 miR-185-5p inhibitor 阴性对照
图3 HCG18与miR-185-5p 的靶向关系验证。A:HCG18与miR-185-5p 的特异性结合序列；B ：相对荧光素酶活性检测；C :FIS H 实验结果
(x400);D :qRT-PC R 检测D N 患者组织中miR-185-5p 的表达；E:qRT-PCR 检测H G 细胞模型中HCG18的表达；F:H C G 18与miR-185-5p 表达
的相关性分析;G ：敲减HCG18对miR-185-5p 表达的影响
5
'
o
5
1.
1.0.
5
!
§
|
2.5I 2.0I I .5I I .O I 0.5I ^怎
沒碼友
s v \H e d c H
w'
s
5t «i *<i
3c
v \h e
.
c !i .
m
h
