IncRNA DSCR8在胃癌中的研究
吴现磊
(濮阳市油田总医院消化内科，河南濮阳457001)
摘要：目的探讨DSCR8在影响胃癌进程中的分子机制。方法IncBase数据库和Targetscan预测了DSCR8和miR-107之间的关系，并通过双荧光素酶和RIP实验验证了这一关系。FISH检测DSCR8在胃癌细胞中的定位。通过qRT-PCR检测胃癌细胞中DSCR8和miR-107的表达水平,CCK-8、克隆形成、Transwell实验检测胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。结果DSCR8在胃癌组织和细胞中上调，并定位在细胞质中。DSCR8低表达会抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外,DSCR8能够海绵吸附miR-107对胃癌细胞的发生发展产生影响。同时,miR-107表达下调会逆转DSCR8低表达对胃癌细胞发展的抑制作用。结论DSCR8作为ceRNA发挥作用，它通过吸附miR-107在胃癌的发展中发挥作用。 关键词：胃癌；DSCR8；miR-107；增殖；迁移；侵袭
中图分类号:R735.2文献标识码:A
文章编号：2095-4646(2021)01-0012-04开放科学(资源服务)标识码(OSID):苏州反光背心
DOI：10.ki.20954646.2021.01.0012
LncRNA DSCR8Promotes the Proliferation,Migration and
Invasion of Gastric Cancer Cells via Adsorbing MiR-107
WU Xian-Lei
(Department of Gastroenterology,Puyang Oilfield General Hospital,Puyang Henan457001,China)
ABSTRACT:Objective To explore the molecular mechanism of DSCR8in the process of gastriccancer. Methods The relationship between DSCR8and miR-107was predictedby IncBase database and Targetscan,and verified through dual luciferase experiments and RIP experiments.FISH detects the localization of DSCR8in gastric cancer cells.The expression levels of DSCR8and miR-107in gastric cancer cells were detected by qRT-PCR,and the proliferation, migration and invasion of gastric cancer cells were detected by CCK-8,clone formation,and Transwell experiments.Results DSCR8is up-regulated in gastric cancer tissues and cells,and localized in the cytoplasm.The low expression of DSCR8can inhibit the proliferation,migration and invasion of gastric cancer cells.In addition,DSCR8can sponge miR-107to affect the occurrence and development of gastric cancer cells.At the same time,down-regulation of miR-107expression will reverse the inhibitory effect of low expression of DSCR8on the development of gastric cancer cells.C
onclusion DSCR8acts as a ceRNA,which plays a carcinogenic effect in the development of gastric cancer by adsorbing miR-107.In general,our research clarified the mechanism of DSCR8in regulating the development of gastric cancer,and provided new ideas for the diagnosis and treatment of gastric cancer guided by IncRNA.
KEY WORDS:Gastric cancer；DSCR8；MiR-107；Proliferation；Migration；Invasion
胃癌(gastric cancer,GC)是全球第五大最常见的癌症和第三大癌症死亡原因,2018年新增病例超过100万，死亡人数约为78.3万人(相当于全球死亡人数中每12人就有1人死于GC)⑴。GC通常在晚期才被诊断出来，此时一般已经发生癌细胞远处转移，患者预后较差，而姑息化疗是主要的手段力。
在过去的几年中，研究GC的分子生物学取得了重要进展,GC相关的小分子被证明具有预后价值，其中长链非编码RNA(long noncodingRNA, IncRNA)似乎是诊断GC最有前途的工具之一⑶°研究表明⑷,IncRNA在癌症发展中起关键作用，作为促癌基因或抑癌基因参与了癌症发展中细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等各种生物学过程。例如,ARHGAP5-AS1是在耐化学性GC细胞中上调的IncRNA，其高表达与GC患者预后差有关⑸；过表达IncRNA HOXA11-AS在体内促进了GC细胞的增殖、细胞周期进展和转移，提示其在GC的发生
和进展中具有致癌特性⑹。尽管已经报道了参与GC发生和发展的几种hicRNA，但是大多数IncRNA 在GC中生物学功能和潜在机制仍有待阐明。
最近，研究⑺发现DSCR8在癌症中异常表达并起到促癌基因的作用。据报道⑻,DSCR8是肝细胞癌的致癌基因，通过充当miR485-5p海绵来激活Wnt/p-catenin通路，从而调节肝细胞癌的细胞生长和细胞周期;You等⑺研究发现在卵巢癌细胞中，YY1诱导的DSCR8通过浸润miR-3192-5p上调YY1，促进细
胞增殖、迁移、侵袭，抑制细胞凋亡。这表明DSCR8可能是癌症诊断和的潜在生物标志物和靶标，然而关于DSCR8在GC中的调控机制仍知之甚少。
在本研究中，我们研究了DSCR8在调节GC 细胞恶性表型中的生物学作用以及可能的分子机制，通过生信分析和细胞实验证实DSCR8与miR-107之间的调控关系。我们的研究有助于更好地了解DSCR8的致癌作用，为GC的诊断和提供潜在的靶点。
1材料与方法
1.1细胞来源
本研究中使用的细胞系信息见表1。人正常胃黏膜细胞GES-1和GC细胞系HGC-27、NCI-N87、KATO m.SNU-1均培养在补充有10%FBS 的RPMI-1640(GIBCO，货号31800022，添加NaHCO31.5g/L,glucose 2.5g/L,sodium pyruvate 0.11g/L)中，并置于37弋，含5%C02的条件下培养。
表1实验所用细胞系
魏糸ws费号产地
GES-1人正常詡Brt ITDU964
HGC-27GCtt TCHu22上海，申国
NCI-N87GCtt TCHul30上海，申国
KATODI GCtt TCHu229上海，申国
SNU-1GCtt TCHu230上海，申国1.2质粒构建和细胞转染
DSCR8的shRNA及相应的阴性对照由Sengong Biotech(中国上海)合成，miR-107inhibitor/ mimic及各自的阴性对照购自Gene Pharma(中国苏州)。根据制造商的说明书，用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)进行所有转染。转染48h后，收集细胞。
1.3qRT-PCR
使用TRIzol试剂(Invitrogen)从细胞中分离总RNA。通过Nanodrop ND-2000分光光度计(Ther-mo Scientific™，美国)评估RNA的数量和质量。为了评估DSCR8的表达分析，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Scientific™，美国)将2憾总RNA反转录为cDNA。对于miR-107的表达分析，使用miDETECT A Track™qRT-PCR试剂盒(广州日博生物有限公司冲国)将2憾总RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green PCR试剂盒(Takara Bio,Otsu,Japan)在StepOne实时PCR 系统(Thermo Fisher Scientific)上进行qRT-PCR。2-at方法用于计算通过GAPDH和U6标准化的相对基因表
达。弓I物序列在表2中列出。
表2qRT-PCR的引物序列
gene Forwward(5,-3,)Reverse(5'-3')
DSCR8CGTCTOCCACTCGHTC TTGGGTCCAGGCTCCTTC
GAPDH CCCATCACCATCTTCCAGGAG CTTCTCCATGGTGGTGAAGACG
miR-107TGTGTAGTAGTITGTrrATAGTG CCAACTCTACAACTACTAAATC
U6CTCGCITCGGCAGCACA AACGCTTCACGAAHTGCGT
1.4荧光原位杂交(FISH)
使用Ribobio合成的FISH探针进行FISH，并根据制造商的说明使用FISH试剂盒(RiboBio Co.，中国广州)进行操作。将盖玻片上的细胞用PBS洗涤并在室温下用4%多聚甲醛固定lOmin，然后在4弋下用含0.5%Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水(PBS)渗透细胞5min。在添加探针之前，将细胞在杂交混合物中预杂交30min o与DSCR8-Fish Probe Mix在37弋下孵育过夜后，细胞用4X 含0.l%Tween-20的柠檬酸
钠(SSC),2xSSC和1 X SSC于42弋洗涤5min，用4Z jb-diamidino-Z-phe-nylindole(D A PI)染10min o最后通过荧光显微镜观察图像。
1.5CCK-8分析
使用Cell Counting Kit-8试剂盒(Beyotime，中国上海)检测细胞增殖。将细胞以5x103个细胞/孔的细胞浓度接种到96孔板中。细胞分别孵育0、24、48、72、96h后，向每个孔中加入lO^L CCK-8溶液，并在37弋下再培养2h o用酶标仪测量每个孔在450nm(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)波长处的吸光度。
1.6克隆形成实验
转染后48h，将细胞(每孔1X103)接种到6孔板中，并用完全培养基培养2周直到明显的克隆形成。细胞集落用4%多聚甲醛固定30min，并
在室温下用0.5%结晶紫染30min o用无菌水清洗每个孔，去除残留的结晶紫。将细胞数超过50个的定义为克隆，计算每孔的克隆数。
1.7细胞迁移和侵袭实验
使用Transwell inserts（8（jiM pore size,Costar, Cambridge,MA,USA）进行迁移和侵袭测定。将细胞
接种到没有或预先涂有基质胶（BD,Franklin Lakes,USA）的顶室中分别进行迁移或侵袭分析，将600m L含10%FBS的培养基置于下腔室中。在37弋、5%C（）2的条件下孵育24h后，用棉签擦拭上室中未迁移或侵袭的细胞，并用甲醇固定迁移或侵袭的细胞，用0.5%结晶紫染并用PBS 洗涤。然后在显微镜下以200x的放大倍数计数。
1.8双荧光素酶实验
从人基因组DNA中扩增了DSCR8的3-UTR 序列。然后将这些序列分别亚克隆到PGL3荧光素酶报告载体（Promega,Madison,WI,USA）中。潜在的miR-107结合位点通过Quick-change定点诱变试剂盒（Agilent Technologies,Santa Clara,CA, USA）突变。将DSCR8模拟物的wt（mut）3-UTR 共转染到GC细胞中。转染48h后，通过Dual-Lu-cy Assay Kit（Progema,Madison,WI,USA）测量萤火虫和海肾荧光素酶的活性荧光素酶活性。
1.9RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）
使用Magna RIP kit（Millipore,Billerica,USA）进行RIP检测。用DSCR8和miR-107转染细胞，并将其重悬于裂解缓冲液中。将lOO^L全细胞提取物与Ago2抗体（Abeam,Cambridge,UK）或IgG （Abeam,Cambridge,UK）缀合的Protein G琼脂糖微珠在4弋孵育过夜。在室温下用DNA酶I和蛋白酶K处理免疫沉淀物20min o回收共沉淀的RNA，并进行qRT-PCR分析。
1.10统计学方法
使用SPSS22.0和GraphPad Prism8.0Software进行统计分析。所有测量数据均以（无土s）表示，两组间比较为Z检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1DSCR8在GC组织的表达
通过starBase数据库（starbase.sysu. /），我们发现DSCR8在GC组织中为高表达（图1A，封二）。进一步利用qRT-PCR检测DSCR8在GC细胞中的表达，结果显示，与GES-1纟田胞木目比，DSCR8在GC纟田胞系HGC-27.KATO IH、NCI-N87和SNU-1中的表达显著上调（图1B，封二）。接下来，我们选择HGC-27细胞和NCI-N87细胞进行实验。由于IncRNA的亚细胞定位与其生物学功能和潜在的分子机制密切相关⑼。因此，我们通过RNA-FISH检测DSCR8的亚细胞定位。结果表明，大多数阳性细胞主要定位于细胞质中，少数分布在细胞核中（图1C，封二）。
2.2敲低DSCR8抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭
为了评估DSCR8在GC中的生物学作用，我们通过将sh-DSCR8转染到HGC-27细胞和NCI-N87细胞中抑制DSCR8的表达（图2A，封二）。通过CCK-8和克隆形成实验验证细胞的增殖变化，结果表明敲
低DSCR8能抑制细胞的增殖和集落形成（图2B、2C，封二）。接着，我们通过Tran-swell检测DSCR8的抑制对细胞的迁移和侵袭的影响，结果发现,DSCR8敲低后的细胞的迁移和侵袭能力显著降低（图2D，封二）。因此，敲低DSCR8抑制GC细胞的增殖、迁移和侵袭。
2.3DSCR8充当miR-107的分子海绵
为了进一步验证DSCR8在GC中的调控机制，我们通过NCBI查询DSCR8和miR-107的核昔酸序列，然后在DNAMAN软件上进行结合位点分析，发现DSCR8和miR-107具有互补的结合位点（图3A，封二）。为了证实DSCR8充当了miR-107的分子海绵，我们首先将sh-DSCR8转染到HGC-27和NCI-N87细胞中，检查miR-107水平是否受sh-DSCR8影响。qRT-PCR结果显示，转染sh-DSCR8后,miR-107的表达显著上调（图3B，封二）O构建了DSCR8-Wt和DSCR8-mut报告载体并进行双荧光素酶实验，结果发现DSCR8-wt的荧光素酶活性显著下调，含有DSCR8-mut载体的细胞其萤光素酶活性则未受影响（图3C，封二）。RIP实验显示，使用Ago2抗体进行免疫沉淀后, miR-107和DSCR8在HGC-27和NCI-N87细胞中富集（图3D，封二），表明miR-107和DSCR8存在结合关系。因此，在GC中DSCR8与miR-107之间存在直接相互作用。
2.4miR-107逆转DSCR8对GC细胞增殖、迁移和侵袭产生的影响
为了研究DSCR8是否通过miR-107依赖性方式调节GC细胞的恶性表型，我们将sh-NC+
NC inhibitor A sh-DSCR8+NC inhibitor,sh-DSCR8+ miR-107inhibitor分别转染到HGC-27细胞和NCI-N87细胞中，并评估了细胞的增殖、迁移和侵袭。我们发现DSCR8的敲低能抑制HGC-27和NCI-N87细胞的增殖、迁移和侵袭，而miR-107inhibitor的转染可以逆转sh-DSCR8对HGC-27和NCI-N87细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用（图4A~ 4D，封三）。因此，抑制miR-107逆转了敲低DSCR8对GC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
3讨论
IncRNA是近年来出现的最大且具有显著多样性的RNA家族之一何。随着人类转录组测序的发展，已鉴定出一些与GC发展相关的IncRNA，例如IncRNA MEG3［11］A IncRNA AK023391［9\IncRNA HOXC-AS3［⑵等。除了特征明确的IncRNA，在控制GC进程中潜在的IncRNA及其相关调节机制仍然值得研究。在本研究中，我们基于基因表达谱分析鉴定出在GC中被上调的DSCR8，并通过qRT-PCR、CCK8、克隆形成和Transwell等一系列的细胞实验研究DSCR8表达量下调对GC细胞生物学功能产生的影响。我们发现DSCR8表达量的下调会对GC细胞的增殖、迁移和侵袭能力产生抑制作用，这与其在子宫癌［⑶、黑素瘤［⑷和肝癌⑻的功能一致。在这些癌症中,DSCR8可能是潜在的预后指标和靶点。总之,DSCR8在GC细胞中发挥了促癌基因的作用。
IncRNA在生物学上的作用和功能目前大部分尚不清楚。它们在microRNAs±的海绵功能最近几年被发
现后受到广泛研究。miRNAs是一类非编码RNA，通过作用于mRNA来调控细胞，在蛋白编码基因的转录后调控中发挥核心作用。IncRNA可 以作为miRNA海绵，降低其对mRNA的调控作用［⑸。由于DSCR8很可能作为ceRNAs发挥作用，因此，在本研究中，我们进行了生物信息学分析、双荧光素酶实验以及RIP分析，确定了DSCR8与在GC中显著低表达的miR-107存在靶向结合位点, DSCR8是miR-107的分子海绵。已有研究表明⑻，DSCR8能够靶向miR485-5p/Wnt/catenin轴调控肝癌进程。同时，我们也在GC细胞中通过CCK8、克隆形成、Transwell等实验验证了低表达miR-107对DSCR8所发挥功能的抑制作用。因此，我们认为DSCR8海绵吸附miR-107促进了GC的发展。
总之，我们确定DSCR8在GC中作为一种癌基因在中起重要作用。我们的研究首次证实了DSCR8通过吸附miR-107促进GC的发展。该调控网络可能为阐明GC的肿瘤发生提供线索，并可能为开发GC的新型诊断和方法提供理论依据。参考文献：
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(收稿日期：2020-10-28)
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DSCR8A ： D$CR 酗表迦|U，馳箱秫表示iE 常屛，业需秫表秫解本；B ： qRT-PCRM!D$CR8在人瑞胃觥魏利GC 觥糸朋表也C：皿$臓黠魏系申D$CR8緘他仰〈0.05； »*
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»h-DSCR8*h-MC »h-DSCR8
墨
uosowquJnN
NCI-Na7
A ： qRT-PCR 胡隸sh-DSCR8后GC 瞬中D$CR8附表JU 平；
B ： CCK-8號湖鱗敝』SCR8后G
无人驾驶小车C 魏的觀飙;C ：克辭减翹號鱗sh-D$CR8 mumAH-,
D ： TmnsweT 】號湖解潮h-D$CR8£GC 细躺时械翹力仰〈0.闿
B2啟低皿删制GC 魏的黠、辻齡驟，OOt
AAUGCUGCU
I I I I I I I I I
2UACGACGA
B
zw&jul 一 o uolsssdxe
OAjFs D
NCI-N87
A ： IncBdse 教耕中预測曲DSCR8和miR-107的乳向结合序列；
B ：转變sh-DSCR8后HGC-27细胞和NCI-N87毓申miR-107的表达水平；
桶装水管理系统C ：双英光素酶实验 測定監证HGC-27细胞和NCI-N87细胞tmiR-107和DSCR8之间的现向结合关系；
D ：通过RIP 检測miR-107和DSCR8在Ago2免赛汎淀申曲富集（*p 〈0.05； **p 〈0.01）
挤出机螺杆B3 DSCR8tSmiR-107W
静态管理
子赭
