•328 •中国糖尿病杂志2021 年5 月第29 卷第5 期Chin J Diabetes，M a y2021，Vol. 29, No. 5
•糖尿病分子生物学和遗传学•长链非编码RNA在成人隐匿性自身免疫性
张鹏玉燕艳付希英程妍宁利倒李沫杨茂光沈鸿王丽娟张秀娟蔡寒青
【摘要】目的探讨长链非编码R N A(LncRN A)在L A D A和T2D M中的表达，并预测LncRNA 作用的靶向基因，为L A D A和T2D M的诊断及鉴别诊断提供基因表达谱。方法选取2017年7月
至2018年6月于吉林大学第二医院内分泌科就诊的D M患者或正常糖耐量（N G T)人，分为T2DM 组、L A D A组及N G T组，每组各4例。采用髙通量测序检测，挑选表达差异有统计学意义的LncRNA 构建基因表达谱。结果与N G T组比较，T2D M组LncRNA 68763个表达上调，28523个表达下调；
L A D A组LncRNA 68748个表达上调，28538个表达下调。各组LncRNA表达差异显著。在有统计学意
义的数据中选取2个差异倍数最髙的LncRNA (LncRNA ENST00000602845-NCBP2、LncRNA
ENST00000364558-HECTD4)进一步分析，并通过G O、K E G G通路分析预测L ncR N A的靶基因功
能。结论LADA、T2D M患者LncR N A表达谱与N G T人存在明显差异，可能通过多种机制参与
发病。
【关键词】长链非编码R N A;N C B P2;H E C T D4；成人隐匿性自身免疫性糖尿病；糖尿病，2型
doi ： 10. 3969/j. issn. 1006-6187. 2021.05. 002
A study of LncRNA in latent autoimmune diabetes in adults and type 2 diabetes mellitus ZHANG
Pengyu，Y A N Y an，F U X iying，et al. Department o f E ndocrinology，The Second Hospital o f J ilin University，
Changchun 130041，China
Corresponding author ：CAI Hanqing, Email ：********************
【Abstract】Objective To evaluate the LncRNA expression in type 2 diabetes mellitus (T2DM)
and latent autoimmune diabetes in adults (LA D A) and to predict the LncRNA target genes, in order to
generate their expression profiles for the diagnosis as well as differential diagnosis of T2DM and LADA.
Methods DM patients and normal glucose tolerance (N G T) subjects in Endocrinology Department in The
Second Hospital of Jilin University from July 2017 to June 2018 were enrolled in this study. All the partici
pants were divided into three groups ：T2DM group (w = 4), LADA group (w = 4) and NGT group (w = 4).
LncRNA with significant differential expression was detected by high~throughput sequencing and then selected
to construct LncRNA gene expression profiles. Results A total of 68763 LncRNA were up-regulated and
28523 were down-regulated in T2DM group compared with NGT group. A total of 68748 LncRNAs were up
-regulated and 28538 were down-regulated in LADA group compared with NGT group. The expression of
LncRNAs was significantly different among the three groups. Two significantly changed LncRNAs were
obtained (LncRNA ENST00000602845-NCBP2 and LncRNA ENST00000364558-H EC TD4) and the
target gene of LncRNA was predicted by gene ontology (G O) analysis and pathway analysis in Kyoto Ency
clopedia of Genes and Genomes (K EG G). Conclusion LncRNA expression profiles were significantly
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different in LADA and T2DM patients compared with NGT subjects, and may be involved in the pathogene-
基金项目：国家科技支撑计划课题-中国成人自身免疫糖尿病诊断与优化研究（2015BAI12B13)；吉林省卫生健委-环状RN A在2型糖尿病及LAD A中的作用研究（2018J047)
作者单位：130041长春，吉林大学第二医院内分泌科
通信作者：蔡寒青，Email:caihanqingl6@163. com
中国糖尿病杂志2021 年5 月第29 卷第5 期Chin J Diabetes，M a y2021，Vol. 29，No. 5•329•
sis of diabetes through multiple mechanisms.
[Key words] LncRNA ； NCBP2 ； HECTD4 ；Latent autoimmune diabetes in adult ； Diabetes mellitus,
type 2 ； Expression spectrum
LADA是T1DM分型中的一种，成人起病，一
种或多种IA A阳性，自身免疫破坏过程较T1DM 缓慢，易与T2DM混淆。早期干预可延缓胰岛p 细胞功能衰竭，尽早发现并诊断LADA非常重 要[1]。长链非编码RNA(LncRNA)与DM发病密 切相关。本研究
通过探讨LncRNA在LADA和T2DM患者中的表达差异，并预测其靶基因及功 能，旨在为临床早期诊断LADA提供依据。
对象与方法
一、研究对象
选取2017年7月至2018年6月于吉林大学 第二医院内分泌科就诊的DM患者，年龄30〜55 岁，均符合1999年WHO糖尿病诊断标准。分为 D M自身抗体阴性患者的T2DM组，DM诊断后 至少6个月不依赖In s、发病年龄>30岁、GADAb65A或酪氨酸磷酸酶抗体(IA2A)阳性患 者的LADA组[2]，同期我院体检健康人为NGT 组，每组各4例。排除标准：GDM患者；特殊类型 DM患者;DKA、高渗性昏迷、乳酸性酸中毒患者；恶性肿瘤患者；肝肾功能障碍患者；其他临床急慢 性炎症性疾病患者；自身免疫性疾病患者；未经治 疗的高血压病患者；其他内分泌疾病患者。本研 究经吉林大学第二医院伦理委员会审核批准，所 有研究对象均签署知情同意书。
二、研究方法
所有患者检测GADA、ICA-IgG、锌转运体8抗体、IAA和IA-2Ab。采集所有研究对象静脉血离 心获取总 RNA，采用 Ribo-Zero rRNA Removal Kits (Illumina，美国）方法移除总R N A中的 rRNAs。应用
TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kitailumina，美国）预处理RNA以建立测序 所需文库，使用BioAnalyzer 2100仪器（Agilent Technologies，美国）对文库进行质控和定量。使用 Hisat2软件（v2.0.4)，将高质量reads与人类参考 基因组（UCSC HG19)比对后，在gtf基因注释文 件指导下，应用Cuffdiff软件(v2.2.1)获取转录本 水平LncRNA和基因水平mRNA的值[3]，构建LncRNA基因表达谱。筛取变化倍数>2.0, /<0. 05,FPKM>0. 1 的LncRNA，选择变化倍数 最大的4个上调、5个下调的LncRNA，实时定量 PCR(qRT-PCR)验证各组血样（表1)，引物设计 软件为Primer5(表2)，管家基因GAPDH作为正 常参考，使用PrimeScript RT K i t试剂盒(#RR037A;Takara，Osaka，Japan)将总 RNA反向 转录成cDNA，将所有cDNA样品配置RT-PCR 反应体系，PCR反应程序为95°C，10 min;40个 PCR循环（95°C, 10 s;60°C, 60 s)。测试 3 个独立 样本，2 —AACT法测定IncRNA相对表达量。LncRNA表达与临近蛋白质编码基因内显著相 关，许多LncRNA充当cis调控因子，根据差异表 达LncRNA临近位点的关系，推测相关靶基因，分 析GCKKEGG通路。
表1显著上调与下调表达的LncRNA
Tab 1Significantly up-regulated and down-regulated expressions in the LncRNA
转录id Transcript, id
变化
Regulation
折叠变化
Fold change
P
铅酸蓄电池组装染体位置
Chr
方向
Strand
起始位置
Start
终末位置
End
ENST00000364558上调Up 3.355350.0144512+112597991112819896 ENST00000608916上调Up 2.510160.03675X—1112940511141204 ENST00000565382下调Down负无穷 Negative infinity0.0000516+8413533984150440 ENST00000602845下调Down-2. 627670.026753+196662272196669464 ENST00000424044下调Down负无穷 Negative infinity0.006351—213031596213072705 ENST00000432511下调Down负无穷 Negative infinity0.030301-203274663203278729
表2 qR T-PC R验证LncRNA差异表达弓丨物
Tab 2 The primers for verifying LncRNA expression by qRT-PCR
电伴热带温控基因Gene 引物类型
Primers
基因序列
Gene order
ENST00000364558Forward ATCTGTCACCCCATTGATCG
Reverse AGACCGGTCCTCCTCTATCG ENST00000424044Forward TGCTGATGTGCCCACTAAAG
Reverse CCATCATAGCCCGTCTCAGT ENST00000432511Forward AGACGGTTCCCCTTTCTGAT
Reverse TCTACCGAGTGCCTGTGATG ENST00000602845Forward TTTCCTCTGCAAGTGGGACT
Reverse CATGCCTATCAACCAGCTCA ENST00000608916Forward TGGTTATGCCTGGAGACCTT
Reverse ACCCAGCTTCAAACATCTGG ENST00000565382Forward TGTCATGGACTCGTGGAGAG
Reverse GCCATCTTAACGAGCTACCG GAPDH Forward GTGGATCAGCAAGCAGGAGT
Reverse AAAGCCATGCCAATCTCATC
三、统计学处理
采用Cuffdiff软件v2.2.1计算FPKM值作为 筛选数据依据。采用SPSS22. 0软件进行统计学 分析。T2DM/N G T组差异LncRNA数据标准差 为 0.051352, P=0.003839; LADA/NGT 组差异 LncRNA数据
标准差为2.249265,P=0. 000779707。
结果
一、 各组LncRNA差异表达
与NGT组比较,T2DM组LncRNA68763个表 达上调，28523个下调（图1A：聚类图；1C：火山 图；1E：散点图）；LADA组LncRNA68748个表达 上调，28538个下调（图1B：聚类图；1D：火山图；1F：散点图）。
二、 差异表达的LncRNA验证
验证T2DM、N G T组LncRNA，其中ENST00000364558 上调倍数为25.633, ENST00000608916 上调倍数为 6.045, ENST00000565382下调倍数为3.258，以上调组 中ENST00000364558表达最显著（图2A)；验证 LADA与NGT组 LncRNA，其中ENST00000424044 下调倍数为18.888, ENST00000432511 下调倍数为 6.045, ENST00000602845下调倍数为27.183，以上调组 中ENST00000602845表达最显著（图2B)。
三、差异表达的LncRNA靶基因G O和KEGG信号通路分析结果
T2DM/N G T组上调LncRNA靶基因G O和KEGG信号通路分析结果见图3。LADA/NGT 组下调LncRNA靶基因G O和KEGG信号通路 分析结果见图4。
20
10
-10
-20
L n c R N A 转录 I D
■ ENST00000364558
i ENST00000608916 l ENST00000565382
■ ENST00000424044■ ENST00000432511■ ENST0CX)00602845
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I I 茗2?虿虿
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E F
S 10
NG
Fig 1
Changes in the expression profiles of LncRNA
A B
05050505
遥控机器人-
112233------图2 qRT-PCR 验证前面所选取丁2DM /NGT 组、LADA/NG 丁组差异表达的LncRNA
Fig 2
Several differently expressed LncRNA verified by qRT-PCR
A B C
标准差（SD) = 0. 051352, P = 0. 003839
A ：细胞蛋白分解过程 Cellular protein catabolic metabolism;B：内质网-髙尔基体中间隔室膜 Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate com- partment membrane;C : WW 域结合 WW domain b i n d i n g 卩卜啉和叶绿素代谢通路，RIG-1 样受体信号通路 porphyrin and chlorophyll metabo- lism, RIG-1-like receptor signaling pathway
图3 T2DM 组上调LncRNA 靶基因的G O 及KEGG 信号通路
Fig 3 GO and KEGG signaling pathways analysis of the up-regulated expressing LncRNA
A B C
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SD = 2. 249265, P =0. 000779707
A ：活化 T 细胞调节 Regulation of activated T cell;
B ：质膜整体组分 Integral component of plasma membrane. ; C: RNA 帽结合 RNA cap binding; D ：金黄葡萄球菌感染，RNA 降解 Staphylococcus aureus infection,RNA degradation
图4 LADA 组下调LncRNA 靶基因的G O 分析及信号通路分析
Fig 4
GO and KEGG signaling pathways for the down-regulated expressing LncRNA targets in LADA group
