ʌ文章编号ɔ１００６－６２３３(２０２３)０１－００１３－０６
ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在非小细胞肺癌中的表达及调控 ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路对癌细胞生物学行为的影响
刘桂霞ꎬ㊀邓科兰ꎬ㊀厉银平
(湖北省孝感市中心医院呼吸与危重症医学科ꎬ㊀湖北㊀孝感㊀４３２０９９)
ʌ摘㊀要ɔ目的：探讨长链非编码ＲＮＡ(ｌｎｃＲＮＡ)ＭＮＸ１－ＡＳ１(ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１)在非小细胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)中的生物学功能及可能的作用机制ꎮ方法：选取２０１７年６月至２０１９年３月期间在本院进行手术的７５例ＮＳＣＬＣ患者癌组织及癌旁组织标本ꎬＲＴ－ｑＰＣＲ法检测标本ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达水平ꎬ分析ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＮＳＣＬＣ临床病理特征及预后的相关性ꎻ体外培养ＮＳＣＬＣ细胞系ＰＣ－９细胞ꎬ分别转染ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１(ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组)㊁ｓｉ－ＮＣ(ｓｉ－ＮＣ组)ꎬＭＴＴ法及ＥｄＵ实验检测各组ＰＣ－９细胞增殖ꎻＴｒａｎｓｗｅｌｌ小室法检测细胞迁移与侵袭ꎻＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验检测ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路相关蛋白表达ꎮ结果:ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ癌组织与细胞系中表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎮｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＴＮＭ分 期和淋巴转移有关(Ｐ<０.０５)ꎬＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１高表达组患者３年累积生存率显著低于低表达组ꎬ差异有统计学意义(４２.１１％ｖｓ８１.０８％ꎬχ２＝１１.１３２ꎬＰ＝０.００１)ꎻ与ｓｉ－ＮＣ组比较ꎬｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组ＰＣ－９细胞的增殖㊁迁移与侵袭能力以及ｐ－ＰＩ３Ｋ㊁ｐ－
ＡＫＴ㊁ｐ－ｍＴＯＲ蛋白表达水平显著降低(Ｐ<０.０５)ꎮ结论:ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ中表达水平升高ꎬ可能通过激活ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路影响ＮＳＣＬＣ细胞的增殖㊁迁移㊁侵袭ꎬ促进ＮＳＣＬＣ的发生发展ꎮʌ关键词ɔ㊀非小细胞肺癌ꎻ㊀长链非编码ＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ꎻ㊀ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路ꎻ㊀迁㊀移ꎻ㊀侵㊀
袭
ʌ文献标识码ɔ㊀Ａ㊀㊀㊀㊀㊀ʌｄｏｉɔ１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００６－６２３３.２０２３.０１.００３
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ｉｎＮｏｎ－ＳｍａｌｌＣｅｌｌＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ
ａｎｄｔｈｅＥｆｆｅｃｔｏｆＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＰＩ３Ｋ/ＡＫＴＰａｔｈｗａｙｏｎ
ｔｈｅＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＢｅｈａｖｉｏｒｏｆＣａｎｃｅｒＣｅｌｌｓ
ＬＩＵＧｕｉｘｉａꎬＤＥＮＧＫｅｌａｎꎬＬＩＹｉｎｐｉｎｇ
(ＸｉａｏｇａｎＣｅｎｔｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌꎬＨｕｂｅｉＸｉａｏｇａｎ４３２０９９ꎬＣｈｉｎａ)
ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ:Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｏｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ(ｌｎｃＲＮＡ)ＭＮＸ１－ＡＳ１(ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１)ｉｎｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ(ＮＳＣＬＣ).Ｍｅｔｈｏｄｓ:Ｔｈｅｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅａｎｄａｄｊａｃｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓａｍｐｌｅｓｏｆ７５ＮＳＣＬＣｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｕｎｄｅｒｗｅｎｔｓｕｒｇｉｃａｌｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｏｕｒｈｏｓｐｉｔａｌｆｒｏｍＪｕｎｅ２０１７ｔｏＭａｒｃｈ２０１９ｗｅｒｅｔａｋｅｎ.ＲＴ－ｑＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ｉｎｔｈｅｓａｍｐｌｅｓꎬｔｈｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ａｎｄｔｈｅｃｌｉｎｉｃｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｉｓｏｆＮＳＣＬＣｗａｓａｎａｌ
ｙｚｅｄꎻｔｈｅＮＳＣＬＣｃｅｌｌｌｉｎｅＰＣ－９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１(ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１ｇｒｏｕｐ)ａｎｄｓｉ－ＮＣ(ｓｉ－ＮＣｇｒｏｕｐ)ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＰＣ－９ｃｅｌｌｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴａｓｓａｙａｎｄＥｄＵａｓ￣ｓａｙꎻＴｒａｎｓｗｅｌｌｃｈａｍｂｅｒａｓｓａｙｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎꎻＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙｗａｓｐｅｒ￣ｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｐａｔｈｗａｙ－ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ:Ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｌｎ￣ｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＮＳＣＬＣｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｌｉｎｅｓ(Ｐ<０.０５).ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ｗａｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＴＮＭｓｔａｇｅａｎｄｌｙｍｐｈａｔｉｃｍｅｔａｓｔａｓｉｓ(Ｐ<０.０５)ꎬＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒｓｕｒ￣
大理石晶面机ｖｉｖａｌａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ３－ｙｅａｒｃｕｍｕｌａｔｉｖｅｓｕｒｖｉｖａｌｒａｔｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｉｎｔｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐｏｆｌｎ￣ｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ｗａｓｏｂｖｉｏｕｓｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｌｏｗｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｒｏｕｐ(４２.１１％ｖｓ８１.０８％ꎬχ２＝１１.
３１ ʌ基金项目ɔ２０２０年度孝感市自然科学计划项目ꎬ(编号:ＸＧＫＪ２０２００１０００８)ʌ通讯作者ɔ厉银平
１３２ꎬＰ＝０.００１)ꎻｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｉ－ＮＣｇｒｏｕｐꎬｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆＰＣ－９ｃｅｌｌｓｉｎｔｈｅｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｐ－ＰＩ３Ｋꎬｐ－ＡＫＴａｎｄｐ－ｍＴＯＲｗｅｒｅｏｂ￣ｖｉｏｕｓｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ:ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ｉｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎＮＳＣＬＣꎬｗｈｉｃｈｍａｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆＮＳＣＬＣｃｅｌｌｓｂｙａｃｔｉｖａｔｉｎｇｔｈｅＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｐａｔｈｗａｙꎬａｎｄｐｒｏｍｏｔｅｔｈｅｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＮＳＣＬＣ.
ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀Ｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒꎻ㊀Ｌｏｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１ꎻ㊀ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴｐａｔｈ￣ｗａｙꎻ㊀Ｍｉｇｒａｔｉｏｎꎻ㊀Ｉｎｖａｓｉｏｎ
㊀㊀肺癌是发病率与死亡率较高的肿瘤之一ꎬ非小细胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)是肺癌的主要类型ꎬ约占所有
肺癌的８０％ꎮ目前ꎬＮＳＣＬＣ手段包括手术㊁化疗㊁靶向㊁免疫等ꎬ多数患者确诊时已至晚期或发生转移ꎬ５年生存率较低ꎮ因此ꎬ研究ＮＳＣＬＣ的发病机制ꎬ探索新的靶点ꎬ对于改善预后具有重要意义[１]ꎮ长链非编码ＲＮＡ(ｌｏｎｇｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡｓꎬｌｎｃＲ￣ＮＡｓ)在肿瘤发生㊁细胞生长和转录调控等多种生理活性中发挥重要作用ꎬｌｎｃＲＮＡｓ的异常表达与肿瘤㊁心血管疾病㊁神经系统疾病等多种疾病密切相关[２]ꎮｌｎ￣ｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１是位于第７号染体上的ｌｎｃＲＮＡꎬ据报道显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在卵巢癌㊁宫颈癌等多种肿瘤中表达水平升高ꎬ通过调节肿瘤细胞的增殖㊁迁移㊁侵袭及上皮间质转化(ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎꎬＥＭＴ)等过程ꎬ促进肿瘤进展[３]ꎮ研究显示[４]ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ组织中表达水平升高ꎬ与肿瘤分化程度㊁ＴＮＭ分期及淋巴结转移及预后相关ꎬ但ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ中的生物学功能尚不清楚ꎮ本研究分析ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ组织中的表达ꎬ探讨ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ细胞中的生物学功能及可能的作用机制ꎬ以期为ＮＳＣＬＣ的诊治提供思路ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀材料：选取２０１７年６月至２０１９年３月期间在本院进行手术的７５例ＮＳＣＬＣ患者的癌组织及癌旁正常组织ꎬ－８０ħ保存ꎬ该研究得到本院伦理委员会的批准ꎮ人支气管上皮细胞(Ｂ
ＥＡＳ－２Ｂ)及ＮＳＣＬＣ细胞系(Ｈ１２９９㊁Ｈ２１７０㊁Ａ５４９㊁ＰＣ－９)购于中国科学院细胞库ꎻ胎牛血清㊁ＲＰＭＩ１６４０购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎻ携带干扰ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达质粒(ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１)㊁其阴性对照质粒(ｓｉ－ＮＣ)及引物购自上海吉玛制药技术有限公司ꎻＭＴＴ试剂盒购自北京索莱宝公司ꎻＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ及ｍｉＳｃｒｉｐｔＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ购自德国ＱｉａｇｅｎꎻＥＣＬ试剂㊁ＴＲＩｚｏｌ试剂㊁Ｌｉｐｏ６０００转染试剂(Ｃ０５２６)㊁兔抗人ｐ－ＰＩ３Ｋ㊁ＰＩ３Ｋ㊁ｐ－ＡＫＴ㊁ＡＫＴ㊁ｐ－ｍＴＯＲ㊁ｍＴＯＲ)抗体购于碧云天生物技术有限公司ꎮ１.２㊀方㊀法
１.２.１㊀细胞培养及分组：将ＢＥＡＳ－２Ｂ㊁Ｈ１２９９㊁Ｈ２１７０㊁Ａ５４９㊁ＰＣ－９细胞接种于ＲＰＭＩ１６４０培养基中(含有１０％胎牛血清及双抗)进行传代培养ꎬ待细胞融合至７０％左右时ꎬ胰酶消化收集细胞ꎬ用于后续实验ꎮ按照随机数字表法将ＰＣ－９细胞分为对照组(Ｃｏｎｔｒｏｌ)㊁ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组㊁ｓｉ－ＮＣ组ꎬ使用Ｌｉｐｏ６０００转染试剂对ＰＣ－９细胞进行转染ꎬ对照组不做转染处理ꎬ转染４８ｈ后ｑＲＴ－ＰＣＲ检测转染效率ꎮ
１.２.２㊀ＲＴ－ｑＰＣＲ检测ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１：采用ＲＴ－ｑＰＣＲ检测ＮＳＣＬＣ癌组织㊁癌旁正常组织及细胞中ｌｎ￣ｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达ꎬＴｒｉｚｏｌ试剂提取总ＲＮＡꎬ使用ＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴＫｉｔ合成ｃＤＮＡ后ꎬ以ＧＡＰＤＨ为内参ꎬ进行ＰＣＲ扩增ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１上游引物(５ᶄ－３ᶄ):ＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＡＧＴＧＧＡＴＡ
Ｃꎬ下游引物(５ᶄ－３ᶄ):ＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣꎻＧＡＰＤＨ上游引物(５ᶄ－３ᶄ):ＡＧＴＣＣＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＡꎬ下游引物(５ᶄ－３ᶄ):ＧＡＧＴＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＡＣＣＡＡꎬ采用２－әәＣｔ法分别计算ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达量ꎮ
１.２.３㊀ＭＴＴ实验：转染后的各组ＰＣ－９细胞以２ˑ１０３/孔接种于９６孔板中ꎬ每组设置６个复孔ꎬ分别于２４㊁４８㊁７２ｈ时每孔加入５ｍｇ/ｍＬ的ＭＴＴ液２０μＬꎬ孵育４ｈ后ꎬ加入１５０μＬ的ＤＭＳＯ溶液终止反应ꎬ检测吸光度值Ａ４９０ｎｍꎬ绘制生长曲线ꎮ
１.２.４㊀ＥｄＵ实验：取对数生长期的各组ＰＣ－９细胞以４ˑ１０４/孔接种于９６孔板中ꎬ每孔加入１００μＬ的ＥｄＵ染液(使用培养液稀释浓度为５０μＭ)孵育２ｈꎬ４％甲醛溶液室温固定３０ｍｉｎꎬ再加入０.５％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００透化１０ｍｉｎꎬＨｏｅｃｈｅｓｔ复染细胞核ꎬ荧光显微镜下观察并拍照ꎮ
１.２.５㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室检测细胞迁移与侵袭：用无血清培养液ＰＣ－９细胞悬液ꎬ调整浓度为４ˑ１０５个/ｍＬꎬ上室加入２００μＬ细胞悬液ꎬ下室加６００μＬ完全培养基ꎬ培养箱孵育２４ｈꎬ多聚甲醇固定ꎬ结晶紫染ꎬ显微镜观察细胞迁移数ꎮ侵袭实验使用Ｍａｔｒｉｇｅｌ基质胶包被Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室ꎬ其余同迁移实验ꎮ
４１
１.２.６㊀Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验：收集各组细胞ꎬ加入适量ＲＩ￣ＰＡ裂解ꎬＢＣＡ法检测蛋白浓度ꎬ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后转至ＰＶＤＦ膜上ꎬ室温封闭２ｈꎬ分别加入ｐ－ＰＩ３Ｋ(１ʒ１５００稀释)㊁ＰＩ３Ｋ(１ʒ１０００稀释)㊁ｐ－ＡＫＴ(１ʒ１０００稀释)㊁ＡＫＴ(１ʒ１５００稀释)㊁ｐ－ｍＴＯＲ(１ʒ１０００稀释)㊁ｍＴＯＲ(１ʒ１０００稀释)和ＧＡＰＤＨ(１ʒ１０００稀释)抗体ꎬ４ħ过夜后ꎬ加二抗(１ʒ１０００)孵育２ｈꎬＥＣＬ试剂显影ꎬ分析条带蛋白相对表达ꎮ
１.３㊀统计学分析：每组实验设置６个复孔ꎬ实验数据符合正态分布用平均数ʃ标准差表示ꎬＳＰＳＳ２５.０㊁ＧｒａｐｈＰａｄ８.０软件进行统计分析ꎬ两组间比较采取独立样本ｔ检验ꎬ计量资料用ｎ(％)表示ꎬ组间比较采用卡方检验ꎬ当Ｐ<０.０５时ꎬ差异有统计学意义ꎮ
２㊀结果
２.１㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ中表达：与癌旁组织比较ꎬＮＳＣＬＣ组织中ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达水平显著升高(Ｐ<０.０５)ꎬ见表１ꎮ
表１㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ中表达( ｘʃｓ)
组别例数ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１癌旁组织７５１.０５ʃ０.１２ＮＳＣＬＣ组织７５２.３６ʃ０.４５ｔ２４.３６０
Ｐ０.０００２.２㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＮＳＣＬＣ临床病理特征的关系：根据ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ组织中
表达水平中位值ꎬ将ＮＳＣＬＣ患者分为ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１高表达组(ȡ２.３６)３８例和ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１低表达组(<２.３６)３７例ꎬ分析发现ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＴＮＭ分期和淋巴转移有关(Ｐ<０.０５)ꎬ见表２ꎮ
防火拉链表２㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＮＳＣＬＣ临床病理特征的关系ｎ(％)
组别例数高表达(ｎ＝３８)低表达(ｎ＝３７)χ２Ｐ性别１.７０７０.１９１男５０２８(５６.００)２２(４４.００)
女２５１０(４０.００)１５(６０.００)
年龄１.１２５０.２８９<６０３３１９(５７.５８)１４(４２.４２)
煤矿井下防爆电机ȡ６０４２１９(４５.２４)２３(５４.７６)
病理类型０.３８４０.５３５鳞癌２９１６(５５.１７)１３(４４.８３)
腺癌４６２２(４７.８３)２４(５２.１７)
肿瘤分化程度２.２４３０.１３４低中分化３９２３(５８.９７)１６(４１.０３)
高分化３６１５(４１.６７)２１(５８.３３)
ＴＮＭ分期８.４１７０.００４Ⅰ＋Ⅱ４０１４(３５.００)２６(６５.００)
Ⅲ＋Ⅳ３５２４(６８.５７)１１(３１.４３)
淋巴结转移７.０８３０.００８有４２２７(６４.２９)１５(３５.７１)
无３３１１(３３.３３)２２(６６.６７)
５１
２.３㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１与ＮＳＣＬＣ患者预后相关性:Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１高表达组患者３年累积生存率为４２.１１％(１６/３８)ꎬ显著低于低表达组的８１.０８％(３０/３７)ꎬ差异有统计学意义(χ２＝１１.１３２ꎬＰ＝０.００１)ꎬ见图１
ꎮ
图１㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达水平与ＮＳＣＬＣ患者预后关
系
２.４㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ细胞系中表达：与ＢＥＡＳ－２Ｂ比较ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在Ｈ１２９９㊁Ｈ２１７０㊁Ａ５４９㊁ＰＣ－９细胞中表达水平升高(Ｐ<０.０５)ꎬ见表３ꎬ在ＰＣ－９细胞中表达水平最高ꎬ选择ＰＣ－９细胞进行后续实验ꎮ
表３㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ细胞系中表达( ｘʃｓ
ꎬｎ＝６)组别ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１
ＢＥＡＳ－２Ｂ１.０１ʃ０.１３Ｈ１２９９２.３４ʃ０.４３∗Ｈ２１７０２.１５ʃ０.３７∗Ａ５４９
１.８７ʃ０.３２∗ＰＣ－９３.２３ʃ０.５１∗
㊀㊀注:ＢＥＡＳ－２Ｂ相比ꎬ
∗Ｐ<０.０５
图２㊀各组ＰＣ－９细胞生长曲线
注：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎻ与ｓｉ－ＮＣ比较ꎬ∗Ｐ<０.０５
２.５㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１对ＰＣ－９增殖的影响：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组和ｓｉ－ＮＣ组比较ꎬｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组ＰＣ－９细胞增殖活性显著降低(Ｐ<０.０５)ꎬＥｄＵ染结果显示ꎬｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组ＥｄＵ阳性细胞数较Ｃｏｎｔｒｏｌ组和ｓｉ－ＮＣ
组减少ꎬ见图２㊁３ꎬ表明抑制ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达显著抑制ＰＣ－９细胞增殖
ꎮ
图３㊀ＥｄＵ实验检测细胞增殖(ˑ４０)
２.６㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１对ＰＣ－９细胞迁移与侵袭的
影响：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组和ｓｉ－ＮＣ组比较ꎬｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组ＰＣ－９细胞迁移与侵袭数显著降低(Ｐ<０.０５)ꎬ表明抑制ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达可显著抑制ＰＣ－９细胞迁移与侵袭ꎮ见图４㊁表４
ꎮ
图４㊀各组ＰＣ－９细胞迁与移侵袭图片(ˑ１００)
表４㊀各组细胞迁移与侵袭数比较( ｘʃｓꎬｎ＝６)组别ＰＣ－９细胞迁移数ＰＣ－９细胞侵袭数Ｃｏｎｔｒｏｌ组１４６.１２ʃ６.７２１３５.３２ʃ５.７１ｓｉ－ＮＣ组１４２.２３ʃ７.２３１３３.２７ʃ５.４５ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组
机械钻孔桩６８.５５ʃ５.６３＃∗
５７.５８ʃ４.６３＃∗
圣诞灯㊀㊀注：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎻ与ｓｉ－ＮＣ比较ꎬ∗Ｐ<０.０５
２.７㊀ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１对ＰＣ－９细胞ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通
路蛋白表达的影响：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组和ｓｉ－ＮＣ组比较ꎬｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组ＰＣ－９细胞ｐ－ＰＩ３Ｋ㊁ｐ－ＡＫＴ㊁ｐ－ｍＴＯＲ
６１
蛋白表达水平显著降低(Ｐ<０.０５)ꎬ表明抑制ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达可显著抑制ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路的激活ꎬ见图５㊁表５
ꎮ
图５㊀ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测各组ＰＣ－９细胞蛋白表达Ａ:Ｃｏｎｔｒｏｌ组ꎻＢ:ｓｉ－ＮＣ组ꎻＣ:ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组
表５㊀各组细胞ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路相关蛋白表达比较( ｘʃｓꎬｎ＝６)组别ｐ－ＰＩ３Ｋ/ＰＩ３Ｋｐ－ＡＫＴ/ＡＫＴｐ－ｍＴＯＲ/ｍＴＯＲＣｏｎｔｒｏｌ组０.６３ʃ０.０６０.７４ʃ０.０８０.９３ʃ０.０６ｓｉ－ＮＣ组０.６５ʃ０.０７
０.７６ʃ０.０９
０.９０ʃ０.０５ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１组
０.３１ʃ０.０５＃∗０.２５ʃ０.０３＃∗
０.４２ʃ０.０６＃∗
㊀㊀注：与Ｃｏｎｔｒｏｌ组比较ꎬ＃Ｐ<０.０５ꎻ与ｓｉ－ＮＣ比较ꎬ∗Ｐ<０.０５
３㊀讨㊀论
ＮＳＣＬＣ是一种死亡率极高的恶性肿瘤ꎬ其早期诊
断困难ꎬ晚期患者治愈率很低ꎬ恶性程度高且易转移与复发ꎬ患者生存率较低[５]ꎮＮＳＣＬＣ的发生发展涉及多基因参与调控的过程ꎬ从基因水平研究ＮＳＣＬＣ的发生发展机制越来越广泛ꎬ研究显示ꎬ多种ｌｎｃＲＮＡꎬ如ｌｎ￣ｃＲＮＡＺＥＢ２－ＡＳ１㊁ＬｎｃＲＮＡＡＮＣＲ等在ＮＳＣＬＣ中异常表达ꎬ与ＮＳＣＬＣ发生发展密切相关[６]ꎮ
ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１基因位于７号染体ꎬ可以转录产生９９２ｂｐ的ＬｎｃＲＮＡꎬ既往研究显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在结直肠癌㊁卵巢癌㊁胃癌㊁肝癌㊁三阴乳腺癌等多种肿瘤中表达异常ꎬ与肿瘤的发生发展密切相关ꎬ可能是肿瘤潜在靶点[７ꎬ８]ꎮ本研究结果显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ癌组织与细胞系中表达水平升高ꎬ提示ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＮＳＣＬＣ发生有关ꎬ通过分析临床病理特征显示ｌｎ￣ｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达与ＴＮＭ分期和淋巴结转移有关ꎬ提示ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１与ＮＳＣＬＣ的发生发展相关ꎮＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ生存分析显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达水平越高ꎬ患者预后较差ꎬ总生存率显著降低ꎬ与
报道结果类似[９]ꎮ淋巴结转移是肿瘤的一种恶性行为ꎬ研究显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１参与调节肿瘤的侵袭与转移ꎬ如Ｗａｎｇ等[１０]研究表明ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１通过ｍｉＲ－２１８－５ｐ调节ＲＡＢ１Ａ的表达ꎬ促进膀胱癌细胞的增殖㊁迁移㊁侵袭和上皮间质转化ꎬ促进膀胱癌的生长和转移ꎬ体内实验表明ꎬ降低ＭＮＸ１－ＡＳ１的表达可抑制肿瘤的生长和转移ꎮＬｉｕ等[
１１]研究结果显示ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１通过靶向抑制ｍｉＲ－５２７表达ꎬ上调ＢＲＡＦ表达促进肺癌细胞增殖㊁迁移与侵袭ꎮ本研结果显示ꎬ在ＰＣ－９细胞转染ｓｉ－ＭＮＸ１－ＡＳ１后ꎬＰＣ－９细胞增殖活性㊁迁移与侵袭能力显著下降ꎬ表明ｌｎ￣ｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１参与ＮＳＣＬＣ的发生与转移ꎬ与Ｌｉｕ
等[１１]人报道结果类似ꎬ提示ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１可能
是ＮＳＣＬＣ的标志物ꎮ
ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路在ＮＳＣＬＣ的发生发展中发挥重
要作用ꎬＡＫＴ的活化可激活ｍＴＯＲꎬ使ｍＴＯＲ的磷酸化水平提高ꎬ从而介导细胞增殖㊁凋亡与能量代谢ꎬＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ通路的激活与ＮＳＣＬＣ细胞迁移㊁侵袭和耐药密切相关[１２]ꎮ多项报道显示ꎬｌｎｃＲＮＡ可通过影响ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ信号通路ꎬ影响ＮＳＣＬＣ细胞的生长㊁转移和耐药ꎬ从而参与ＮＳＣＬＣ的发生发
卷钉展[１３]ꎮ研究显示ꎬ在ＮＳＣＬＣ中ꎬ敲低ｌｎｃＲＮＡＲＯＲ１－ＡＳ１表达可抑制ＰＩ３Ｋ/Ａｋｔ/ｍＴＯＲ通路的激活ꎬ抑制ＮＳＣＬＣ细胞的活力和侵袭能力ꎬ并抑制异种移植ＮＳＣＬＣ肿瘤的生长[１４]ꎮ在乳腺癌细胞中ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１通过激活ＡＫＴ/ｍＴＯＲ途径促进乳腺
癌细胞的增殖㊁迁移和侵袭及上皮间质转化[１５]ꎮ本实验结果显示ꎬＰＣ－９细胞中抑制ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１表达后ꎬｐ－ＰＩ３Ｋ㊁ｐ－ＡＫＴ㊁ｐ－ｍＴＯＲ蛋白表达水平显著降低ꎬ表明ｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１可通过影响ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ/ｍＴＯＲ途径而调控ＮＳＣＬＣ细胞的增殖㊁迁移㊁侵袭ꎬ参与ＮＳＣＬＣ的发生发展ꎮ
综上所述ꎬｌｎｃＲＮＡＭＮＸ１－ＡＳ１在ＮＳＣＬＣ中表达水平升高ꎬ通过激活ＰＩ３Ｋ/ＡＫＴ通路影响ＮＳＣＬＣ细胞的增殖㊁迁移㊁侵袭ꎬ促进ＮＳＣＬＣ的发生发展ꎬ但其具体作用机制尚仍需结合动物模型做进一步研究ꎮ
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