提提热㊃生物信息学㊃d o i:10.3969/j.i s s n.1671-8348.2022.16.029
朱丹荣1,4，盛伟松1，孙玥1，刘志峰2，季国忠3ә，李楠4
(1.南京医科大学第二附属医院儿童内镜中心210003;2.南京医科大学附属儿童医院儿科消化210004;
3.南京医科大学第二附属医院消化医学中心210003;
4.南京医科大学附属
伊犁哈萨克自治州友谊医院儿科消化，新疆835000)
[摘要]目的探讨长非编码R N A(l n c R N A)在儿童肠息肉的差异表达㊂方法以3例配对儿童正常肠黏膜和肠息肉，外加4例儿童肠息肉开展相关组织的l n c R N A测序研究㊂随后分别在60例儿童肠息肉组织及正常肠黏膜组织标本运用R T-q P C R验证6个差异表达l n c R N A基因㊂结果通过测序发现存在1307+738条差异表达的m R N A，共598条明显表达差异的l n c R N A，其中上调472条，下调126条㊂R T-q P C R验证了M I R4435-2H G㊁S H3P X D2A-A S1㊁L n c00668㊁M I R194-2H G㊁A C245060.6㊁B X890604.2等共6个基因㊂结论差异表达的l n c R N A可能参与了儿童肠息肉的发病过程，这一现象拓展了对儿童肠息肉的认识，为临床诊治及预后判断提供了新的思路㊂ [关键词]肠息肉；儿童；长非编码R N A；测序
[中图法分类号] R725.7[文献标识码] A[文章编号]1671-8348(2022)16-2847-06
D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f l o n g-s t r a n d e d n o n-c o d i n g R N A
i n c h i l d h o o d i n t e s t i n a l p o l y p s*
Z HU D a n r o n g1,4,S H E N G W e i s o n g1,S U N Y u e1,L I U Z h i f e n g2,J I G u o z h o n g3ә,L I n a n4 (1.P e d i a t r i c E n d o s c o p y C e n t e r,S e c o n d A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g, J i a n g s u210003,C h i n a;2.D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c G a s t r o e n t e r o l o g y,A f f i l i a t e d C h i l d r e n s H o s p i t a l o f N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g,J i a n g s u210004,C h i n a;3.D i g e s t i v e M e d i c i n e C e n t e r,
S e c o n d A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,N a n j i n g,J i a n g s u210003,C h i n a;
4.D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c G a s t r o e n t e r o l o g y,A f f i l i a t e d I l i P r e f e c t u r e F r i e n d s h i p H o s p i t a l,
N a n j i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y,Y i l i,X i n j i a n g835000,C h i n a)
[A b s t r a c t]O b j e c t i v e T o e x p l o r e t h e d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f l o n g-s t r a n d e d n o n-c o d i n g R N A i n c h i l d i n t e s t i n a l p o l y p s.M e t h o d s T h e l n c R N A s e q u e n c i n g s t u d y o f t h e r e l e v a n t t i s s u e s w a s c a r r i e d o u t i n3m a t c h e d c h i l d r e n w i t h n o r m a l i n t e s t i n a l m u c o s a a n d i n t e s t i n a l p o l y p s p l u s4c h i l d r e n w i t h i n t e s t i n a l p o l y p s.S i x d i f f e r-e n t i a l l y e x p r e s s e d l n c R N A g e n e s w e r e s u b s e q u e n t l y v a l i d a t e d r e s p e c t i v e l y b y R T-q P C R i n60c h i l d r e n s i n t e s-t i n a l p o l y p t i s s u e a n d n o r m a l i n t e s t i n a l m u c o s a t i s s u e s p e c i m e n s.R e s u l t s T h e1307+738d i f f e r e n t i a l l y e x-p r e s s e d m R N A s w e r e f o u n d b y s e q u e n c i n g,a n d t h e r e w e r e a t o t a l o f598s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d l n c R N A s,i n w h i c h472w e r e u p-r e g u l a t e d a n d126w e r e d o w n-r e g u l a t e d.A n d R T-q P C R v e r i f i e d a t o t a l o f6 g e n e s,i n c l u d i n g M I R4435-2H G,S H3P X D2A-A S1,L n c00668,M I R194-2H G,A C245060.6,B X890604.2.C o n-
c l u s i o n D i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e
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e i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o
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g n o s i s,t r e a t m e n t a n d p r o g n o s i s j u d g m e n t.
[K e y w o r d s]i n t e s t i n a l p o l y p s;c h i l d r e n;l o n g-s t r a n d e d n o n-c o d i n g R N A;s e q u e n c i n g
结肠息肉为一种儿童消化系统常见疾病，是导致儿童下消化道出血的主要病因[1]㊂绝大部分为良性病变，但也有文献报道导致恶变可能[2]㊂儿童肠息肉会导致免疫力降低，贫血，甚至可引起外科急腹症如肠套叠等㊂当前文献对于儿童肠息肉的病理和报道较多，但对其发病机制暂无明确报道[3]㊂
7482
重庆医学2022年8月第51卷第16期
*基金项目：江苏省南京市卫生科技发展基金项目(Y K K18184)；新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州应用研究及公益性医疗卫生项目(Y Z2021B004)㊂作者简介：朱丹荣(1985-)，副主任医师，博士，主要从事儿童消化系统疾病研究㊂ә通信作者,E-m a i l:j g z@n j m u.e d u.
c n㊂
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K E L L E H E R等[4]认为结直肠息肉的产生与基因变化有关㊂目前，肠镜仍是诊治儿童肠息肉的 金标准 [5]，但由于肠镜是一种侵入性操作，且需要麻醉的配合，患儿家长的顾虑使肠镜的广泛和及时应用受到一定限制，因此很多时候儿童肠息肉并不能得到最及时的诊治㊂
随着现代细胞分子生物学的快速发展，人们在分子水平上对许多疾病的发生㊁发展及其相关机制展开了研究，催生出许多疾病的分子靶向的新兴理念，这一领域的进步使得许多疾病的诊治手段增加，且疗效得到提升[6]㊂所以，在分子水平层面深入研究儿童肠息肉发生㊁发展的作用机制，出其特异性的特征性分子可能为儿童肠息肉的临床诊治提供新的方向和方法㊂
本研究采集儿童肠息肉组织及正常肠黏膜组织(息肉病理检查证实为幼年性息肉)，因儿童的特殊性及
实验经费的限制，以3例配对正常肠黏膜和肠息肉，外加4例儿童肠息肉(共7例息肉)开展了儿童肠息肉组织的长非编码R N A(l n c R N A)测序研究，随后分别在60例儿童肠息肉组织及配对的正常肠黏膜组织标本中运用R T-q P C R验证了6个差异表达l n-c R N A基因㊂
1材料与方法
1.1材料来源
选取3例配对正常肠黏膜和肠息肉，外加4例儿童肠息肉，共7例肠息肉，所有标本均获取患儿的家属书面同意并且通过南京医科大学第二附属医院伦理委员会批准(2018K Y087)㊂儿童肠息肉组织及正常肠黏膜组织均来自诊断为儿童肠息肉的患儿并经病理检查证实为幼年性息肉㊂儿童肠息肉组织标本来自离体肠息肉组织，正常肠黏膜组织标本取自正常肠管组织或离息肉5c m以上肠组织㊂本研究获得研究对象的家属的知情并同意参与㊂
1.2方法
1.2.1标本处理
病理诊断为幼年性息肉的患儿在肠镜检查中收集所需标本，息肉标本取材黄豆粒大小，正常肠黏膜组织采取活检钳夹取3块组织，用磷酸盐缓冲液洗3次，登记编号，将编号后的样品分别置于液氮中低温
保存㊂整个采集及处理时间均为自标本组织离体10 m i n内(X i r o u3编号因质检原因舍去)㊂
1.2.2资料收集
收集样本的编号㊁来源部位㊁年龄㊁性别㊁体重指数(B M I)等基本资料，见表1㊂肠息肉和正常肠黏膜样本性别㊁年龄㊁B M I比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2㊂
1.2.3总R N A提取
R N A的抽提使用AM B I O N试剂盒(试剂货号AM1561，试剂批号1409128)㊂1.2.3.1制备组织匀浆
取2m L离心管(附带螺旋盖子)，将研磨珠(直径1mm)放入离心管，位置放至离心管1m L处㊂将实验标本组织切成小块置入2m L离心管中(带研磨珠)，加入T R I z o l试剂(即用型细胞和组织总R N A提取试剂)直到离心管顶部㊂旋转拧紧离心管螺旋盖，仔细检查螺旋盖和离心管结合部，保证没有研磨珠夹杂其中，用密封圈密封离心管的管口以便能尽可能减少制备组织匀浆过程中气体溶胶的生成㊂于均质器内对称的置入离心管后盖上均质器上盖，机器运行3m i n㊂
表1基本资料
标本编号来源部位年龄(岁)性别B M I(k g/m2) X i r o u1直肠5女21.2
X i r o u2直肠2男18.5
X i r o u4乙状结肠3女19.2
X i r o u5降结肠4女22.3
X i r o u6乙状结肠7男23.5
X i r o u7乙状结肠5男21.9
X i r o u8直肠6男19.6
N i a n m o1降结肠4女22.3
N i a n m o2乙状结肠7男23.5
N i a n m o3乙状结肠5男21.9
表2两组样本一般资料比较
项目
肠息肉
(n=7)
肠黏膜
(n=3)t/χ2P 年龄(xʃs，岁)4.57ʃ1.715.33ʃ1.53-0.660.528性别[n(%)]0.080.667男4(57.1)2(66.7)
女3(42.9)1(33.3)
B M I(xʃs,k g/m2)20.89ʃ1.8322.57ʃ0.83-1.490.176
1.2.3.2相位分离
完成制备标本组织匀浆后样品在15~30ħ环境中孵育5m i n以便保证核蛋白复合体充分裂解㊂然后将氯仿(与T r i z o l比例为5ʒ1)注入离心管中，与T r i z o l试剂的比例为5ʒ1，充分摇匀，孵育3m i n，放入离心管中进行离心，温度选择4ħ，时间为12~15 m i n㊂
1.2.3.3 R N A沉淀
转移含有标本R N A的上层无液体至新的离心管中，首先沉淀标本R N A，然后加入异丙醇试剂㊂T r
i z o l试剂和异丙醇试剂按照2ʒ1的比例配置，加入完成以后相同的温度条件以12000r/m i n离心12~ 15m i n，弃上清液㊂
1.2.3.4 R N A清洗
以75%乙醇冲洗R N A沉淀，配置乙醇与T r i z o l
抛丸处理8482重庆医学2022年8月第51卷第16期
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试剂，比例1.5ʒ1.0，以7500r/m i n离心4~5m i n㊂1.2.3.5 R N A再溶解
取70μL的去R N a s e液，风干R N A沉淀物10 m i n，将沉淀物放入去R N a s e液中㊂用微量加样器反复抽吸吹打，最后标本R N A孵育10m i n，温度为50ħ㊂
1.2.4总R N A的纯化和R N A质检
使用Q I A G E N R N e a s y@M i n i K i t纯化样品总R N A㊂利用A g i l e n t B i o a n a l y z e r2100检测R N A完整性㊂采用T h e r m o S c i e n t i f i c生产的N n a o D r o p N D-2000检测，具体操作步
骤:(1)开机运行N n a o D r o p N D-2000(T h e r m o S c i e n t i f i c)超微量分光光度计，清洁N n a o D r o p N D-2000检测头和检测孔(用洁净擦镜纸)，反复用超纯水滴滴入检测孔，对合检测头检测孔;(2)吸出超纯水(作为空白对照组)，用微量加样器吸取1μL R N A样本溶液，留置于检测孔，点击 测量 键，读取R N A样本的吸光度值㊂
1.2.5c D N A的构建
(1)配置反应溶液,200n g总R N A(5n g p o l y A+ R N A)2.5μL,S p i k e M i x2μL，随机引物0.8μL，总量为5.3μL㊂(2)将反应溶液按要求配置好，在65ħ的环境下静置10m i n，随后冰浴5m i n，将5ˑF i r s t缓冲液预热5m i n(80ħ)㊂(3)配置c D N A合成体系㊂(4)P C R,40ħ2m i n,70ħ15m i n，冰浴5m i n㊂1.2.6高通量测序
测序工作由上海美吉生物有限公司完成㊂
1.2.7 R T-q P C R
每个R T-q P C R(20μL)体系中含2ˑq P C R M a s-t e r M i x10μL，正向引物(10μm o l/L)0.2μL，反向引物(10μm o l/L)0.2μL,c D N A2μL,R O X染料0.4μL，以及d d H2O至20μL㊂反应条件：扩增曲线95ħ5m i n;95ħ5s,60ħ31s；熔解曲线95ħ15 s,60ħ30s,95ħ15s，共40个循环㊂以G A P D H 为内参，应用2-ΔΔC t法，计算目的基因相对表达量，引物序列见表3㊂
1.2.8生物信息学分析
微型水轮发电机采用D a v i d数据库进行基因本体(G O)分析，用京都基因与基因线百科全书(K E G G)数据库进行P a t h w a y分析㊂
1.3统计学处理
采用S P S S20.0进行统计分析，计量资料以xʃs 表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1相关分析、聚类热及火山
样本间均无显著相关性，差异无统计学意义(P> 0.05)；两组样本直接基因表达量存在显著差异，有多个差异基因显著上调或下调，见图1㊂
2.2 G O及K E G G分析
差异基因主要富集在信号传导㊁免疫系统㊁内分泌系统㊁消化系统及癌症等相关通路上㊂
2.3差异表达的l n c R N A s验证
测序发现存在1307+738条差异表达的m R-N A，共598条明显表达差异的l n c R N A，其中上调472条，下调126条㊂R T-q P C R验证了M I R4435-2H G㊁S H3P X D2A-A S1㊁L n c00668㊁M I R194-2H G㊁A C245060.6㊁B X890604.2等共6个基因㊂查阅文献挑选出3条在肠息肉组织中表达上调的，且3条在肠息肉组织表达下调的l n c R N A s分布为M I R4435-2H G㊁S H3P X D2A-A S1㊁L I N C00668㊁M I R194-2H G㊁A C245060.6㊁B X890604.2,6条l n c R N A s筛选标准为:(1)差异表达倍数>2,(2)P<0.05,(3)已知基因名(g e n e s y m b o l)的l n c R N A,(4)生物学信息软件预测有顺式作用(C i s)调控的靶基因㊂应用R T-q P C R 方法进行验证，两组标本各基因相对表达量比较见表4㊁图2㊂
表3引物序列
目的基因引物5'-3'
M I R4435-2H G(252b p)正向T G G G A A T G G A G G G A A A T A
反向C G G G C A A C A G G T A G A G G T S H3P X D2A-A S1(146b p)正向C C A A C A A G C T C C C A G A T G A T G
反向G G T T T G A A T G C A G C C T C C T A G L I N C00668(107b p)正向A A G T G G C G G T G
T T T G T C C
反向T C T G G G C T C T G T G C T T G G M I R194-2H G(271b p)正向A C T G G C A T A G G G T G A A A G G
反向G G G C A G G T C T T G A G G A G T A C245060.6(159b p)正向T T A T T G C G G C A C T A T T C A
反向A C T T C A T C C G T G T C C C T A B X890604.2(235b p)正向A A A G T G G C A T G T G C G G T A G
反向A G C C C A G A A G T T C G A G A C G A P D H(108b p)正向A A G G T G A A G G T C G G A G T C A
反向A A T G A A G G G G T C A T T G A T G 9482
重庆医学2022年8月第51卷第16期
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A ：聚类热图;
B :
火山图㊂图1 样本基因表达量差异分析
表4 两组标本中差异表达的l n c R N A s 比较(x ʃs )
序号
肠息肉(n =7
)肠黏膜(n =3
)M I R 4435-2H G
2.743900179ʃ0.902903509
0.834668500ʃ0.254711564
S H 3P X D 2A -A S 13.462744612ʃ1.047878009
0.544004817ʃ0.147641481
L I N C 006681.043974155ʃ0.647631009
0.237590000ʃ0.025866000
M I R 194-2H G单板层积材
3.472597041ʃ0.558710228
22.885918950ʃ1.542177625
A C 245060.6
4.798237444ʃ0.248677333
8.268892894ʃ0.392714000
B X 890604.2
6.942781854ʃ1.199037123
27.001011560ʃ8.17324879
3
A ：两组标本M I R 4435-2H G 相对表达量比较;
B ：两组标本S H 3P X D 2A -A S 1相对表达量比较;
电磁感应采暖炉
C ：两组标本L I N C 00668相对表达量比较;
D :
两组标本M I R 194-2H G 相对表达量比较;E ：两组A C 245060.6相对表达量比较;F ：两组标本B X 890604.2相对表达量比较,a :P <0.05㊂
图2 两组标本各基因相对表达量比较
3 讨 论
随着基因组学和转录组测序技术的迅速发展发
现只有不足2%左右的基因具有编码功能，大多数基
因转录出来的产物是非编码R N A (n o n -c o d i n g R
N A ,0582重庆医学2022年8月第51卷第16期
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n c R N A)[7]㊂当前l n c R N A的发现主要来源于微阵列技术㊁第2代高通量转录组测序技术㊁单细胞测序技术等㊂如今，随着大型l n c R N A文库的建立，以及新一代高通量测序技术的全方位应用和芯片技术的改良发展，必将继续有大量l n c R N A被筛选鉴定出来[8]㊂
随着研究的深入，越来越多的数据表明，人类许多疾病的发生㊁发展均与l n c R N A表达异常密切相关，如l n c R N A在许多恶性肿瘤中的表达都与在正常组织中有很大差异㊂肺腺癌相关转录本1是第一个在肺癌中被研究的l n c R N A，其在肺癌中具有很高的表达特异性，被认为是非小细胞肺癌，尤其是肺腺癌早期转移阶段的特异性标志物[9]㊂据文献报道，胃癌中存在许多上调的异常表达的l n c R N A，如C C A T1㊁HU L C㊁H19等[10],Y A R A N I等[11]在一项克罗恩病(C D)㊁溃疡性结肠炎(U C)及正常结肠对照组织中的测序发现与正常对照组比较,C D K N2B-A S1l n c R N A 在C D患者中表达下调了4.9倍(P=0.041)，而在U C中下调了12倍(P=0.0009)㊂这项发现在其他研究中也得到了证实[12]㊂有学者通过定量逆转录聚合酶链反应分析发现，急性心肌梗死患者全血中锌指结构反义转录本1水平(0.74ʃ0.07)显著低于非心肌梗死患者和健康志愿者，故将其称为心脏特异性或心脏相关的l n c R N A[13]㊂
目前，尚未见l n c R N A与儿童肠息肉的文献报道，本研究利用高通量测序技术对3对儿童肠息肉组织及配对的正常肠黏膜组织，加4例儿童肠息肉，共计10例标本进行检测和生物学分析发现了1307+ 738条差异表达的m R N A(肠息肉组织和正常肠黏膜组织差异表达2倍以上)，而l n c R N A差异表达明显
者598条，其中上调472条，下调126条㊂进一步筛选出在每个样本中均有表达且差异最明显的l n-c R N A，为此挑选了M I R4435-2H G㊁S H3P X D2A-
A S1㊁L I N C00668㊁M I R194-2H G㊁A C245060.6㊁
B X890604.2进行验证，结果表明测序结果准确，为后续研究l n c R N A在儿童肠息肉中的生物学功能奠定了基础㊂G O和K E G G分析提示差异表达的l n c R N A 主要涉及信号传导㊁免疫系统㊁内分泌系统㊁消化系统及癌症等相关过程，提示其可能与儿童肠息肉的生物特征有关㊂
l n c R N A M I R4435-2H G也称为A K001796和l n c00978，编码在人类染体2Q13上㊂作为一种癌基因,M I R4435-2H G最初的特征是参与了肺癌细胞生长抑制[14]㊂随后研究发现M I R4435-2H G的表达与乳腺癌患者的不良预后呈正相关[15]㊂另一方面，最近研究表明M I R4435-2H G可促进胃癌(G a s t r i c C a n c e r,G C)生长，并提示其可作为G C诊断标记物的相关性[16-17]㊂作者已在体外实验中对于l n c R N A M I R4435-2H G进行了相关细胞株的进一步研究㊂
S H3P X D2A-A S1在大肠癌中发挥致癌作用已有文献报道[18]，但对其在大肠癌中的作用和机制研究的文献报道甚少见㊂因此,G U O等[19]研究了S H3P X D2A-A S1对大肠癌细胞增殖㊁迁移㊁侵袭㊁凋亡以及肿瘤生长的影响，其利用m i R D B和m i R T a r-B a s e数据库筛选出m i R-330-5p和U B A2，构建了S H3P X D2A-A S1/m i R-330-5p/U B A2C E R N A调控网络，并检测了S H3P X D2A-A S1/m
i R-330-5p/U B A2网络在大肠癌细胞生长和存活中的作用，认为S H3P X D2A-A S1可作为大肠癌的潜在生物标志物㊂
已有研究证明l n c00668是几种癌症的致癌基因，如非小细胞肺癌[20]和胃癌[21]㊂此外，有学者发现l n c00668在肿瘤组织样品和癌细胞系中显著升高, l n c00668通过与m i R-532-5p结合促进原发性肝细胞癌的发生[22]㊂
最新的高通量测序的转录组分析显示,l n-c R N A M I R194-2H G在膀胱癌中被下调[23]㊂X U 等[24]评估了在肝癌组织和肝癌细胞系中不经常研究的l n c R N A M I R194-2H G的表达，并研究了其作用和分子机制㊂认为M I R194-2H G通过激活W n t/β-联蛋白信号通路在H e p G2和H u h7细胞中发挥致癌作用㊂此外，其还证明了M I R194-2H G与m i R-1207-5p/T C F19轴相互作用，从而消除了m i R-1207-5p对T C F19的抑制作用，表明M I R194-2H G可能是肝癌的新型诊断标记物或靶标㊂
本研究的局限性是由于儿童的特殊性，初始所得测序样本量较小，存在一定的研究偏倚，数据只能作为初步参考，后期将继续扩大样本量进行研究㊂但本研究所揭示的l n c R N A在儿童肠息肉中的差异表达可能为儿童肠息肉的发病机制研究带来新的思路，并可能为疾病诊治提供新的线索和潜在的干预靶标㊂
参考文献
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重庆医学2022年8月第51卷第16期
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