第47卷第2期2021年3月吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.47No.2
Mar.2021
DOI：10.13481/j.1671⁃587Ⅹ·20210218
lncRNA CCAT1表达的影响
王景，刘晶，魏旭静，杜亚飞，房桂英，李林
（河北医科大学第一医院妇产科，河北石家庄050000）
［摘要］目的
目的：探讨冬凌草甲素对子宫内膜癌HEC-1B细胞增殖、迁移和侵袭的影响，阐明其可能机制。方法
方法：取对数生长期的子宫内膜癌HEC-1B细胞分为对照组（DMSO培养液）、阳性对照组（2.5mg·L－1顺铂）、低剂量（10μmol·L－1）冬凌草甲素组、中剂量（20μmol·L－1）冬凌草甲素组和高剂量（40μmol·L－1）冬凌草甲素组。采用MTT法检测细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡率，细胞划痕实验检测细胞迁移能力，Transwell小室实验检测HEC-1B细胞侵袭能力，实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）法检测各组HEC-1B细胞中长链非编码RNA（lncRNA）结肠癌相关转录因子1（CCAT1）表达水平。结果 结果：与对照组比较，阳性对照组和低、中及高剂量冬凌草甲素组HEC-1B细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；细胞划痕愈合率和穿膜细胞数均明显降低（P<0.05）；
HEC-1B细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低（P<0.05）。与低剂量冬凌草甲素组比较，中和高剂量冬凌草甲素组HEC-1B细胞凋亡率明显升高（P<0.05），细胞划痕愈合率和穿膜细胞数均明显降低（P<0.05），HEC-1B细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低（P<0.05）。与中剂量冬凌草甲素组比较，高剂量冬凌草甲素组HEC-1B细胞凋亡率明显升高（P<0.05），细胞划痕愈合率和穿膜细胞数均明显降低（P<0.05），HEC-1B细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低（P<0.05）。
结论
结论：冬凌草甲素可以抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，促进子宫内膜癌HEC-1B细胞凋亡，其作用机
制可能与下调lncRNA CCAT1表达水平有关。
［关键词］冬凌草甲素；lncRNA CCAT1；子宫内膜癌；细胞迁移；细胞侵袭
［中图分类号］R737.33［文献标志码］A
Effects of oridonin on proliferation,migration,invasion and
expression of lncRNA CCAT1of endometrial
carcinoma HEC-1B cells
WANG Jing,LIU Jing,WEI Xujing,DU Yafei,FANG Guiying,LI Lin
（Department of Gynaecology and Obstetrics，First Hospital，Hebei Medical University，
Shijiazhuang050000，China）
ABSTRACT Objective：To investigate the effects of oridonin on the proliferation，migration and invasion of endometrial cancer HEC-1B cells，and to elucidate its possible mechanism.Methods：The endometrial cancer HEC-1B cells in logarithmic growth phase were divided into control group（
DMSO），positive control [文章编号]1671⁃587Ⅹ(2021)02⁃0384⁃06
[收稿日期]2020⁃09⁃12
[基金项目]河北省卫健委医学科学研究项目（20190431）
[作者简介]王景（1988－），女，河北省定州市人，主治医师，医学硕士，主要从事妇产科疾病基础和临床方面的研究。
[通信作者]李林，副主任医师（E-mail：******************）
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王景，等.冬凌草甲素对子宫内膜癌HEC⁃1B细胞增殖、迁移、侵袭及lncRNA CCAT1表达……group（2.5mg·L－1cisplatin），low dose（10μmol·L－1）of oridonin group，medium dose（20μmol·L－1）of oridonin group and high dose（40μmol·L－1）of oridonin group.MTT assay was used to detect the inhibitory rates of proliferation of cells.Flow cytometry was used to determine the apoptotic rates of HEC-1B cells.Cell scratch test was used to detect the cell migration ability.Transwell chamber assay was used to detect the invasion ability of HEC-1B cells.Real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）was used to detect the expression levels of lncRNA CCAT1in the cell
s.Results：Compared with control group，the apoptotic rates of HEC-1B cells in positive control group，low，medium and high doses of oridonin groups were significantly increased（P<0.05），the scratch healing rates and the number of transmembrane cells were significantly reduced（P<0.05），and the expression levels of lncRNA CCAT1in the HEC-1B cells were significantly decreased（P<0.05）.Compared with low dose of oridonin group，the apoptotic rates of HEC-1B cells in medium and high doses of oridonin groups were significantly increased （P<0.05），the scratch healing rates and the number of transmembrane cells were significantly reduced （P<0.05），and the expression levels of lncRNA CCAT1in the HEC-1B cells were significantly decreased（P<0.05）.Compared with medium dose of oridonin group，the apoptotic rate of HEC-1B cells in high dose of oridonin group was significantly increased（P<0.05），the scratch healing rate and the number of transmembrane cells were significantly reduced（P<0.05），and the expression level of lncRNA CCAT1in the HEC-1B cells was significantly decreased（P<0.05）.Conclusion：Oridonin can inhibit the proliferation，migration，and invasion and promote the apoptosis of endometrial cancer HEC-1B cells，and its mechanism may be related to down-regulating the expression level of lncRNA CCAT1.
KEYWORDS oridonin；lncRNA CCAT1；endometrial cancer；cell migration；cell invasion
子宫内膜癌是女性常见恶性肿瘤之一，近年来在世界范围内发病率呈上升趋势，具有病程发展迅速及平均生存时间短等特点，严重威胁女性健康。目前，对于子宫内膜癌的，主要通过放疗和化疗等手段诱导子宫内膜癌细胞凋亡，以达到延长患者生存期的目的［1-3］。发掘有效抗癌的新活性成分，一直以来都是子宫内膜癌研究的热点，冬凌草甲素是中药冬凌草的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗肿瘤等药理作用［4-5］。研究［6］表明：冬凌草甲素具有抑制癌细胞迁移和侵袭的作用。子宫内膜癌的发生和发展是一个由多基因、多因素介导的复杂过程［7］。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类调控型大分子RNA，在细胞发育、X染体沉默和调控转录等机体生命活动过程中发挥着重要作用。研究［8-9］发现：lncRNA在多种肿瘤中发生表达紊乱，如乳腺癌和食管癌等。其中，结肠癌相关转录因子1（colon cancer associated transcriptor1，CCAT1）是近年来发现的在结肠癌组织中异常表达的lncRNA，其相对表达水平与结肠癌细胞增殖和转移关系密切。目前国内外关于lncRNA CCAT1在子宫内膜癌细胞中表达的研究甚少。本研究通过观察冬凌草甲素对子宫内膜癌细胞中lncRNA CCAT1表达和癌细胞迁移
及侵袭能力的影响，探讨冬凌草甲素对子宫内膜癌的作用及其机制，为临床研究提供实验依据。
披肩按摩器1材料与方法
1.1细胞株
细胞株、、主要试剂和仪器子宫内膜癌HEC-1B 细胞株购自中国科学院上海细胞库。冬凌草甲素购于上海麦克林生化科技有限公司，二甲基亚砜（DMSO）和DMEM培养基购于美国Sigma公司，胰蛋白酶和胎牛血清购于中国碧云天生物试剂公司，lncRNA CCAT1由广州锐博生物科技有限公司合成，RNA提取试剂盒购于美国Mobio公司，逆转录cDNA试剂盒购于美国Invitrogen公司。全自动凝胶成像系统购于英国Syngene公司，Thermo ABI2720PCR仪购于美国赛默飞世尔科技公司，Bio-Rad550酶标仪购于美国Bio-Rad公司。
1.2细胞培养采用含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基培养子宫内膜癌HEC-1B细胞，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每3d以
0.25%胰蛋白酶消化传代1次。
1.3MTT法检测细胞增殖抑制率取对数生长期的HEC-1B细胞，配成3×105mL－1细胞悬液，100μL接种于96孔细胞培养板，放入培养箱中培养24h，细胞贴壁后，弃去培养液。设对照组、阳性对照组，低、中和高剂量冬凌草甲素组，每组设
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置6个复孔，阳性对照组加入2.5mg·L－1的顺铂，低、中和高剂量冬凌草甲素组分别加入10、20和40μmol·L－1冬凌草甲素50μL孵育48h，对照组只加入DMEM培养液培养48h。48h后向每孔加入10μL新配制的5g·L－1MTT，轻轻摇匀，孵育4h，弃去上清，每孔再加入200μL DMSO，低速振荡30min，使其完全溶解，酶标仪检测波长490nm处各孔的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝（1－实验组A值/对照组A值）×100%，其中实验组包括低、中和高剂量冬凌草甲素组和阳性对照组。
1.4流式细胞术检测细胞凋亡率取对数生长期的HEC-1B细胞，配成单细胞悬液，100μL接种于6孔细胞培养板培养，设对照组和低、中及高剂量冬凌草甲素组，阳性对照组加入
2.5mg·L－1顺铂，低、中和高剂量冬凌草甲素组分别加入20、40和50μmol·L－1冬凌草甲素50μL培养48h，弃去培养液，PBS缓冲液清洗，离心收集细胞，PBS缓冲液清洗，调整细胞密度为5×105mL－1，加入200μL
Binding Buffer液，加入200μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI，摇匀，室温下避光放置20min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.5细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率取对数生长期的HEC-1B细胞，配成3×105mL－1细胞悬液，接种于培养板，每孔100μL，培养12h。倒置显微镜下观察细胞，待80%细胞融合时，弃去培养液，加入
含2%血清的DMEM培养液，继续培养24h。待细胞单层贴壁长满时，采用移液头垂直划痕，PBS缓冲液冲洗。设对照组，阳性对照组，低、中和高剂量冬凌草甲素组，每组设置3个复孔。阳性对照组加入
2.5mg·L－1的顺铂，低、中和高剂量冬凌草甲素组分别加入20、40和50μmol·L－1冬凌草甲素50μL培养24h，对照组只加入DMEM培养液。于倒置显微镜下观察0和24h时间点划痕愈合程度，计算细胞划痕愈合率，以上实验至少重复３次。细胞划痕愈合率=（0h 划痕宽度－24h划痕宽度）/0h划痕宽度×100%。
1.6Transwell小室实验检测细胞侵袭能力取对数生长期的HEC-1B细胞，配成3×105mL－1细胞悬液，取100μL加入Transwell上室，设对照组，阳性对照组，低，中和高剂量冬凌草甲素组，每组设置3个复孔。阳性对照组加入
2.5mg·L－1的顺铂，低、中和高剂量冬凌草甲素组分别加入20、40和50μmol·L－1冬凌草甲素50μL，对照组只加入DMEM培养液。下室加入含FBS的完全培养基。培养24h，上室内肿瘤细胞向下室聚集。24h 后，取出培养板，去上室内的细胞，下室细胞用甲醇固定，采用0.1%结晶紫染，冲洗封片，显微镜下对下室细胞进行计数，记为穿膜细胞数，每组取5个视野，以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。1.7实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reac
tion，RT-qPCR）法检测细胞中lncRNA CCAT1表达水平设对照组，阳性对照组，低、中和高剂量冬凌草甲素组。阳性对照组加入2.5mg·L－1顺铂，低、中和高剂量冬凌草甲素组分别加入20、40和50μmol·L－1冬凌草甲素50μL培养细胞，取贴壁细胞，分别采用0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，于1000r·min－1离心5min，去上清液，PBS缓冲液洗涤，离心，弃去上清液，加入细胞裂解液50μL，混匀，按照试剂盒说明书提取总RNA；采用逆转录酶试剂盒逆转录cDNA；以cDNA为模板进行扩增。lncRNA CCAT1引物序列：上游引物5'-GCCGTGTTAAGCATTGCGA-A-3'，下游引物5'-AGAGTAGTGCCTGGCCTA-GA-3'。反应条件：94℃、5min变性，35个循环；94℃、1min变性；55℃、1min退火；72℃、1min延伸；72℃、7min充分延伸；120V、30min。采用2-ΔΔCt法计算lncRNA CCAT1相对表达水平。
1.8统计学分析采用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。各组细胞增殖抑制率、凋亡率、划痕愈合率、穿膜细胞数和lncRNA CCAT1表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1各组HEC-1B细胞增殖抑制率与低剂量冬凌草甲素组比较，中和高剂量冬凌草甲素组HEC-1B细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05）；与中剂量冬凌草甲素组比较，高剂量冬凌草甲素组HEC-1B细胞增殖抑制率明显升高（P<0.05），且呈剂量依赖性。见表1。
步步紧2.2各组HEC-1B细胞凋亡率与对照组比较，阳性对照组和低、中及高剂量冬凌草甲素组HEC-1B细胞凋亡率明显升高（P<0.05）；与低剂
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财务报销管理系统王景，等.冬凌草甲素对子宫内膜癌HEC⁃1B 细胞增殖、迁移、侵袭及lncRNA CCAT1表达……
量冬凌草甲素组比较，中和高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞凋亡率明显升高（P <0.05）；与中剂量冬凌草甲素组比较，高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞凋亡率明显升高（P <0.05），且呈剂量依赖性。见表1。2.3
各组HEC -1B 细胞划痕愈合率
与对照组比怎么自制纳米胶带
较，阳性对照组和低、中及高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞划痕愈合率均明显降低（P <0.05）；与低剂量冬凌草甲素组比较，中和高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞划痕愈合率明显降低（P <0.05）；与中剂量冬凌草甲素组比较，高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞划痕愈合率明显降低（P <0.05），且呈剂量依赖性。见图1和表2。2.4
各组HEC -1B 细胞穿膜细胞数
与对照组比
较，阳性对照组和低、中及高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞穿膜细胞数均明显降低（P <0.05）；与低剂量冬凌草甲素组比较，中和高剂量冬凌草甲
素组HEC -1B 细胞穿膜细胞数明显降低（P <0.05）；与中剂量冬凌草甲素组比较，高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞穿膜细胞数明显降低（P <0.05），且呈剂量依赖性。见图2和表2。
2.5各组HEC -1B 细胞中lncRNA CCAT1表达水平
与对照组比较，低、中和高剂量冬凌草甲素组
HEC -1B 细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低（P <0.05）；与低剂量冬凌草甲素组比较，中和高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低（P <0.05）；与中剂量冬凌草甲素组比较，高剂量冬凌草甲素组HEC -1B 细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低（P <
0.05）。见表3。3
讨
论
lncRNA 是一种非编码RNA 转录因子，由200多个核苷酸组成，是一种重要的肿瘤调节因子［10］。lncRNA 的功能十分广泛，对激活或抑制转录、修饰与沉默染体等多个过程都具有调控作用。研究［11-12］表明：lncRNA 可作为竞争性内源RNA 调
表1
各组细胞增殖抑制率和凋亡率
Tab Tab..1
Inhibitory rates of proliferation and apoptotic rates of
cells in various groups
(n =6,x ±s ，η/%）
Group Control Positive control Oridonin(μmol ·L －1)Low dose Medium dose High dose
Inhibitory rate of proliferation
—51.20±4.1718.41±2.1732.01±3.56△45.24±3.82△#
Apoptotic rate 4.57±0.3854.71±3.44*35.46±1.05*40.55±3.10*△44.82±2.31*△#
*
P <0.05compared with control group ；△
P <0.05compared with
low dose of oridonin group ；#P <0.05compared with medium dose of oridonin group.“—”：No
data.
A ：Control group ；
B ：Positive control group ；
C ：Low dose of oridonin group ；
D ：Medium dose of oridonin group ；
E ：High dose of oridonin group.
图1
各组HEC -1B 细胞迁移能力
Fig.1
Migration abilities of HEC -1B cells in various groups
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吉林大学学报（医学版）控miRNAs 的转录表达，如PVT1和XIST 等，具有调控细胞增殖和凋亡的作
用。lncRNA CCAT1在正常细胞损伤时表达上调，其异常表达可通过调节miRNAs 的下游作用靶点MYC 蛋白的激活促进胃癌和肝癌等癌细胞增殖和迁移［13-16］。冬凌草甲素是香茶菜属植物冬凌草的一种活性物质，具有抗氧化、抗炎和抗菌等广泛的药理作用［17-19］。冬凌草甲素能够通过诱导表观遗传学改变，调控肿瘤关键分子和相关信号通路，有效调节、抑制肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，具有抗肿瘤作用［20-21］。
本研究结果显示：低、中和高剂量冬凌草甲素组细胞增殖抑制率明显提高，细胞凋亡率明显升高，划痕愈合率明显降低，侵袭细胞数明显减少，说明不同剂量冬凌草甲素可抑制HEC -1B 细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制其迁移和侵袭能力，具有剂量依赖性。采用不同剂量冬凌草甲素干预子宫内膜癌HEC -1B 细胞后，癌细胞中lncRNA CCAT1表达水平明显降低，说明冬凌草甲素能够下调lncRNA CCAT1表达水平。lncRNA CCAT1位于染体8q24.21cMyc 基因增强子区域，cMyc 能够
表2
各组细胞划痕愈合率和穿膜细胞数
Tab Tab..2
Scatch healing rates and number of transmembrane
cells in various groups
（n =3,x ±s ）
Group Control Positive control Oridonin(μmol ·L －1)Low dose Medium dose High dose
Scatch healing rate
（η/%）84.3±7.734.8±5.3*66.4±7.1*51.6±6.1*△37.3±5.2*△#
Number of trans⁃membrane cells(n )196±2558±16*121±10*99±15*△74±11*△#
*
P <0.05compared with control group ；△
P <0.05compared with
low dose of oridonin group ；#P <0.05compared with medium dose of oridonin
group.
A ：Control group ；
B ：Positive control group ；
C ：Low dose of oridonin group ；
D ：Medium dose of oridonin group ；
E ：High dose of oridonin group.
图2
各组HEC -1B 细胞侵袭能力（结晶紫结晶紫，，×400）
Fig.2
Invasion abilities of HEC -1B cells in various groups （Crystal violet,×400）
表3各组HEC -1B 细胞中lncRNA CCAT1表达水平Tab Tab..3
CCAT Expression levels of lncRNA CCAT11in HEC -1B
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cells in various groups
（n =3,x ±s ）
Group Control Positive control Oridonin(μmol ·L －1)Low dose Medium dose High dose
lncRNA CCAT11.13±0.240.96±0.150.66±0.13*0.47±0.08△*0.32±0.10*△#
*
P <0.05compared with control group ；△
P <0.05compared with
low dose of oridonin group ；#P <0.05compared with medium dose of oridonin group.
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