.i s s n .1671-8348.2021.02.003网络首发 h t t p
s ://k n s .c n k i .n e t /k c m s /d e t a i l /50.1097.r .20201229.1613.015.h t m l (2020-12-30)L n c R N A H 19调控R u n x 2表达对非创伤性 股骨头坏死的影响
*
宋 强1，王振海2，李敬武3，穆胜凯4
(1.沈阳市骨科医院研究所创伤科 110044;2.联勤部保障部队第967医院骨科，辽宁大连116011;
3.中国医科大学附属第一医院疼痛科，沈阳110003;
4.沈阳市骨科医院脊柱科 110044
) [摘要] 目的 探讨长链非编码R N A H 19(l n c R N A H 19)对非创伤性股骨头坏死(N O N F H )
发生㊁发展的影响及其机制㊂方法 收集42例N O N F H 患者和30例健康志愿者的血清标本，采用实时荧光定量P C R (R T -P C R )检测血清l n c R N A H 19和R u n t 相关转录因子2(R u n x 2)表达水平；培养人骨髓间充质干细胞(h M -S C -B M )，将重组人骨形态发生蛋白-2(B M P -2)加入培养基中，诱导h M S C -B M 成骨分化，并检测l n c R N A H 19 表达水平；将l n c R N A H 19的小干扰R N A (s i R N A )导入细胞中，检测沉默l n c R N A H 19对R u n x 2表达的影响;
C C K -8增殖实验评估l n c R N A H 19和R u n x 2对细胞增殖能力的影响㊂结果 与健康志愿者相比,N O N F H 患
者血清l n c R N A H 19和R u n x 2表达水平明显下降(P <0.05);B M P -2诱导的h M S C -B M 中l n c R N A H 19表达
水平明显增高(P <0.05)㊂l n c R N A H 19可以影响R u n x 2在h M S C -B M 中的表达，抑制l n c R N A H 19的表达
后,R u n x 2表达随之下降；抑制l n c R N A H 19表达后，细胞增殖能力减弱，在此基础上过表达R u n x 2,
细胞增殖能力恢复㊂结论 L n c R N A H 19可能通过调控R u n x 2表达参与N O N F H 的发生㊁
发展㊂[关键词] 股骨头坏死;R N A ，长链非编码;R u n t 相关转录因子2；间充质干细胞[中图法分类号] R 681.8
[文献标识码] A
[文章编号] 1671-8348(2021)02-0193-05
E f f e c t o f L n c R N A H 19i n n o n -t r a u m a t i c o s t e o n e c r o s i s
o f f e m o r a l h e a d b y u p r e g u l a t i n g R
u n x 2*
S O N G Q i a n g 1,WA N G Z h e n h a i 2,L I J i n g w u 3,MU S h e n g
k a i 4
(1.D e p a r t m e n t o f T r a u m a t o l o g y ,O r t h o p e d i c H o s p i t a l o f S h e n y a n g C i t y ,S h e n y a n g ,L i a o n i n g 110044,C h i n a ;2.D e p a r t m e n t o f O r t h o p e d i c s ,t h e 967
H o s p i t a l o f J o i n t S u p p o r t U n i t o f P L A ,D a l i a n ,L i a o n i n g 116011,C h i n a ;3.D e p a r t m e n t o f P
a i n T r e a t m e n t ,T h e F i r s t H o s p i t a l o f C h i n a M e d i c a l U n i v e r s i t y ,S h e n y a n g ,L i a o n i n g 110003,C h i n a ;4.D e p a r t m e n t o f
S p i n e T r e a t m e n t ,O r t h o p e d i c H o s p i t a l o f S h e n y a n g C i t y ,S h e n y a n g ,L i a o n i n g 1
10044,C h i n a ) [A b s t r a c t ] O b j
e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e e
f f e c t o f l o n
棉花采摘机g n o n -c o d i n g R N A H 19(l n c R N A H 19)o n t
h e o c c u r r e n c e a n d d e v e l o p m e n t o f n o n -t r a u m a t
i c f e m o r a l h e a d n e c r o s i s (N O N F H ).M e t h o d s S e r u m s a m p
l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m 42N O N F H p a t i e n t s a n d 30h e a l t h y v o l u n t e e r s .R T -P C R w a s u s e d t o d e t e c t t h e e x p
r e s s i o n l e v e l s o f H 19a n d R U N X f a m i l y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 2(R u n x 2)i n s e r u m.O s t e o g
e n i c d i
f f e r e n t i a t i o n o f h u m a n b o n e m a r r o w m e s e n c h y m a l s t e m c e l l s (h M S C -B M )w a s i n d u c e d b y r e c o m b i n a n t h u m a n b o n e m o r p h o g
e n e t i c p r o t e i n -2(B M P -2)a n d l n c R N A H 19e x p r e s s i o n w a s d e t e c t e d .S m a l l i n t e r
f e r i n
g R N A (s i R N A )o f l n c R N A H 19w a s i n t r o d u c e d i n t o c e l l s ,t
h e e f f e c t o f s
i l e n c i n g l n c R N A H 19o n R u n x 2e x p
r e s s i o n w a s d e t e c t e d .C C K -8w a s u s e d t o e v a l u a t e t h e e f f e c t s o f l n c R N A H 19a n d R u n x 2o n c e l l p r o l i f e r a t i o n .R e s u l t s C o m p a r e d w i t h h e a l t h y v o l u n t e e r s ,t h e e x p
r e s s i o n s o f l n c R N A H 19a n d R u n x 2i n s e r u m o f N O N F H p a t i e n t s d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y (P <0.05).A f t e r i n d u c e d b y B M P -2,t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f l n c R N A H 19i n h M S C -B M s i g
n i f i -c a n t l y i n c r e a s e d (P <0.05).l n c R N A H 19a f f e c t e d R u n x 2p r o t e i n e x p
r e s s i o n i n h M S C -B M.A f t e r l n c R N A H 19e x p r e s s i o n w a s i n h i b i t e d ,R u n x 2p r o t e i n e x p r e s s i o n d e c r e a s e d .A f t e r l n c R N A H 19e x p r e s s i o n w a s i n h i b i -t e d ,c e l l p r o l i f e r a t i o n w a s r e d u c e d ,a n d t h e n r e s t o r e d a f t e r R u n x 2o v e r e x p
r e s s i o n .C o n c l u s i o n L n c R N A H 19m a y b e i n v o l v e d i n t h e o c c u r r e n c e a n d d e v e l o p m e n t o f N O N F H b y r e g u l a t i n g R u n x 2p r o t e i n e x p
r e s s i o n .3
91重庆医学2021年1月第50卷第2期*
基金项目：辽宁省自然科学基金(201601114)㊂ 作者简介：宋强(1980 )
，主治医师，硕士，主要从事骨科疾病的基础和临床研究㊂
[K e y w o r d s]f e m u r h e a d n e c r o s i s;R N A,l o n g n o n c o d i n g;R U N X f a m i l y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r2;m e s e n c h y-m a l s t e m c e l l s
骨质破坏性疾病多由凝血和纤溶系统紊乱或血液供应不足引起，股骨头坏死(o s t e o n e c r o s i s o f t h e f e m o r a l h e a d,O N F H)作为其中之一的致残疾病，通
常出现进行性的股骨头塌陷和继发性关节炎，对患者生存质量产生巨大影响，需行全髋关节置换术[1]㊂O N F H可分为创伤性和非创伤性(n o n-t r a u m a t i c o s-t e o n e c r o s i s o f f e m o r a l h e a d,N O N F H)两种亚型, N O N F H常出现在30~50岁的患者，多出现在类固醇皮质激素炎性疾病后[2]㊂有研究指出,N O N-F H同人类免疫缺陷病毒感染㊁自身免疫性疾病㊁酗酒㊁使用糖皮质激素及凝血障碍有关[3]㊂也有研究显示，间充质干细胞(M S C s)成骨分化能力的改变导致骨坏死和骨再生失衡，是N O N F H发病的关键因素㊂各因素诱导M S C s向脂肪细胞分化，使细胞增殖和分化能力下降，导致机体自身修复能力降低,O N F H加重㊂但到目前为止,N O N F H发病的具体分子机制仍不清楚[4]㊂
近年来，随着人类基因组计划的完成和高通量测序技术的进步，研究人员已逐渐将研究中心放在非编码R N A(n o n-c o d i n g R N A,n c R N A)的生物学功能上㊂n c R N A s在调控基因表达中起着至关重要的作用[5]㊂其中，长度超过200个核苷酸的长链非编码R N A s(l o n g n o n c o d i n g R N A s,l n c R N A s)广泛参与生物体的生命过程，包括表观遗传学㊁转录和转录后调控等[6]㊂L n c R N A s作为 脚手架 介导蛋白质间的相互作用[7-8]；作为 引导员 促进蛋白质和基因的启动子结合；作为 信号 调节邻近基因的转录；作为 诱饵 与微R N A(m i R N A)或蛋白质竞争性结合，影响m R N A的转录[9]㊂但目前有关l n c R N A s参与N O N-F H发生㊁发展的研究并不多见㊂R u n t相关转录因子2(R U N X f a m i l y t r a n s c r i p t i o n f a c t o r2,R u n x2)的表达是M S C s向成骨细胞谱系分化的充分且必要条件，是成骨细胞分化的标志[10]㊂R u n x2高表达促进成骨细胞分化，而R u n x2表达水平下调可能促进N O N F H 的进展[11-12]㊂因此，本研究分析N O N F H患者l n-c R N A H19表达情况，并分析其可能的机制，为N O N F H的诊断和提供新思路㊂
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本采集
选取2014年1月至2018年12月在本院的42例N O N F H患者(N O N F H组)，男25例，女17例；年
龄30~69岁，平均(49.2ʃ8.3)岁；病程1~11年，平均(5.7ʃ2.5)年㊂同时选取年龄㊁性别分布相近的30名健康志愿者作为对照组，排除高血压㊁糖尿病㊁凝血和纤溶系统紊乱㊁心脑血管疾病及其他慢性疾病㊂对照组男17例，女13例；年龄28~72岁，平均(48.3ʃ6.6)岁㊂本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书㊂入院当天所有受试者抽取全血20m L，室温静置90m i n,1250ˑg室温离心20m i n，制备血清标本㊂
1.1.2主要仪器与试剂
用于H19基因敲降的小干扰R N A(s i-R N A)慢病毒㊁对照病毒及R u n x2过表达质粒均购自上海吉凯基因化学技术公司㊂实时荧光定量P C R(R T-P C R)仪购自瑞士R o c h e公司,P C R引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；鼠抗人R u n x2抗体(1ʒ200)㊁兔抗人G A P D H抗体(1ʒ1000)及二抗(1ʒ2000)均购自美国B o s t e r公司㊂人骨髓间充质干细胞(h M S C-B M)购自美国S c i e n C e l l研究实验室㊂1.2方法
1.2.1细胞培养
h M S C-B M培养于含10%胎牛血清和1%抗生素-抗真菌溶液(美国I n v i t r o g e n公司)的高糖D M E M 培养基,37ħ㊁50m L/L C O2培养，当细胞生长至80%~90%时，收集㊁传代㊂对于成骨细胞分化实验，将培养基替换为含10%胎牛血清和100n g/m L重组人骨形态发生蛋白-2(B M P-2，美国R&D S y s
t e m s公司)的培养基，培养6d㊂
1.2.2 R T-P C R
T R I z o l法提取总R N A，并检测纯度及浓度㊂依据日本T a K a R a公司试剂盒说明书进行逆转录和P C R反应㊂H19的上游引物序列为5'-G G T T G G A G T T G T G G A G A C-3'，下游引物序列为5'-G C G T A A T G G A A T G C T T G A A-3';R u n x2上游引物序列为5'-C G G C C C T C C C T G A A C T C T-3'，下游引物序列为5'-T G C C T G C C T G G G G T C T G T A-3';U6的上游引物序列为5'-T T A T G G G T C C T A G C C T G A C-3'，下游引物序列为5'-C A C T A T T G C G G G C T G C-3'㊂采用2-ΔΔC t法计算二者的相对表达水平㊂ΔC t=C t标记物-C t U6㊂以U6作为内参进行相对定量，重复3次㊂
1.2.3细胞转染
L i p o f e c t a m i n e2000将过表达和沉默载体转染进入细胞，转染48h后，观察细胞生长情况，收集细胞用于进一步研究㊂S i-H19#1(5'-3'):C C U C U A G C U U G G A A A U G A A U A(引导链),U U C A U U U C C A A G C U A G A G G G U(过客链);S i-H19#2(5'-3'):G C A C U A C C U G A C U C A G G A A U C(引导链),U U C C U G A G U C A G G U A G U G C A G(过客链)㊂
1.2.4 W e s t e r n b l o t
491重庆医学2021年1月第50卷第2期
提取细胞总蛋白，制备8%聚丙烯酰胺凝胶，每孔
20μg 上样;
80V 积层胶,120V 分离胶进行电泳,100V 转聚偏氟乙烯(P V D F )膜90m i n ,5%牛血清蛋
白(B S A )封闭P V D F 膜1h ，加一抗,4ħ振荡过夜㊂
T B S T 洗涤后滴加二抗,37ħ孵育1h ,
显影成像㊂G A P D H 作为内参,I m a g
e J 软件获取灰度值㊂1.2.5 C C K -8增殖实验
细胞转染后24㊁48㊁72h 加入C C K -8试剂,
37ħ㊁5%C O 2条件下培养2h
，多功能酶标仪测定450n m 处吸光度值(A 450值)㊂每组设2个复孔，实验重复3次㊂
1.3 统计学处理用S P S S 2
2.0软件进行统计分析,
计量资料以x ʃs 表示,
多组间比较采用方差分析，两组间比较采用两独立样本t 检验㊂以P <0.05为差异有统计学意义㊂2 结 果
2.1 N O N F H 患者及健康受试者血清l n c R N A H 19
、R u n x 2表达情况
R T -P C R 结果显示,l n c R N A H 19在N O N F H 患
者血清中的表达水平为0.43ʃ0.07，较l n c R N A H 19
在健康受试者血清中表达水平(1.03ʃ0.18)
降低，差异有统计学意义(P <0.05，图1A )㊂而R u n x 2在
N O N F H 患者血清中的表达水平为0.54ʃ0.10，低于健康受试者血清中R u n x 2表达水平(1.05ʃ0.13
)，差异有统计学意义(P <0.05，图1B )
㊂2.2 B M P -2促进l n c R N A H 19在h M S C -B M 中表达
应用不同浓度的B M P -2诱导h M S C -B M 的成骨
分化，分别采用0㊁25㊁50㊁100㊁200n g
/m L B M P -2处理h M S C -B M ,R T -P C R 检测l n c R N A H 19表达水平
变化，随着B M P -2加入量的增加,l n c R N A H 19的表
达水平明显上升(P <0.05)，但在B M P -2加入至100
n g
狭基线纹香茶菜/m L 后,l n c R N A H 19表达不再明显增加(P >0.05
)，见图2
㊂ A ：血清l n c R N A H 19相对表达水平比较;B ：血清R u n x 2相对表达语音系统
水平比较;a :P <0.05,
与对照组比较㊂图1 N O N F H 患者和健康志愿者血清l n c R N A H 19
和R u n x 2
表达水平比较
a
:P <0.05㊂
图2 l n c R N A H 19在不同浓度B M P -2处理的h M S C -B M
中的表达变化
2.3 l n c R N A H 19表达对R u n x 2的影响
在h M S C -B M 中分别过表达和沉默l n c R N A
H 19，确定基因操作工具有效，其中s i -H 19#1具有更
优的沉默效率(P <0.05，图3A )；采用R T -P C R 和
W e s t e r n b l o t 检测过表达或沉默l n c R N A H 19后
R u n x 2表达水平的变化，结果显示l n c R N A H 19的表
达变化并不引起R u n x 2m R N A 表达变化(P >0.05，图3B )，而对R u n x 2水平变化影响明显(P <0.05,
图3C )
㊂ A ：转染s i -H 19和过表达质粒前后l n c R N A H 19表达情况;B ：转染s i -H 19和过表达质粒前后R u n x 2m R N A 表达情况;C ：转染s i -H 19#1和过
表达质粒前后R u n x 2表达情况;N C ：对照病毒质粒;a
:P <0.05，与N C 比较㊂
图3 h M S C -B M 转染s i -H 19和过表达质粒前后l n c R N A H 19和R u n x 2表达情况
5
91重庆医学2021年1月第50卷第2期
2.4l n c R N A H19和R u n x2对h M S C-B M增殖能力的影响
C C K-8验证l n c R N A H19和R u n x2对h M S C-B M增殖能力的影响㊂将s i-H19#1序列转染进入h
M S C-B M后，细胞的增殖能力明显下降㊂在此基础上过表达R u n x2，被抑制的细胞的增殖能力部分恢复(P<0.05)，见图4㊂
N C：对照病毒质粒;a:P<0.05，与s i-H19#1比较㊂
图4 C C K-8验证H19和R u n x2对h M S C-B M
增殖能力的影响
3讨论
N O N F H病因复杂，可由多种原因引起，对股骨头的损伤尤为突出，目前其病因和致病机制尚不清楚㊂日本第4次全国N O N F H流行病学调查数据显示，致病因素中激素占50%，酒精占27%，酒精+激素性占2%，其他因素占21%[13]㊂目前针对N O N F H 早期患者以口服降脂药㊁抗凝药和双磷酸盐药物等为主，易引起胃肠道不适反应，并可能对肝㊁肾功能造成损伤，疗效欠佳[14]㊂对于中晚期患者多采取手术，坏死晚期采用人工关节置换术，但手术存在费用高㊁创伤大㊁并发症多等缺点㊂因此，进一步探究N O N F H的发生㊁发展机制，从分子水平探究其发病原因，给予针对性的靶向，可能是临床的突破口㊂
在过去的20年里，高通量测序技术的发展极大地加速了基因表达调控的相关研究㊂大量研究认为, n c
R N A的表达改变是疾病发生的驱动因素之一[15-16]，广泛参与生物体的生命过程，如染体重构㊁细胞分化及免疫应答等[17]㊂N O N F H的发生需要n c R N A的参与㊂L I等[18]在1项糖皮质激素诱导的N O N F H研究中发现了11个可能参与N O N F H发生㊁发展的m i R N A s，而W E I等[19]和C H E N等[20]分别发现了l n c R N A HO T A I R和l n c R N A AW P P H可能参与N O N F H相关成骨基因的转录调控㊂本研究发现,l n c R N A H19在N O N F H患者血清中表达水平明显降低，可能参与N O N F H的病理生理过程㊂l n-c R N A H19定位于人11p15.5，是第一个被证实为具有印记特性的基因[21]，在胚胎期表达，出生后表达下降，而往往在肿瘤及其他疾病中再次出现[22]㊂l n-c R N A H19过表达同血管生成和细胞增殖密切相关[21,23]㊂同时，过表达的l n c R N A H19可以诱导卵巢癌细胞的上皮间质转化(E MT)，促进其侵袭转移[23]㊂有研究认为,l n c R N A H19介导M S C s的多种分化过程，参与肌肉骨骼系统的再生，并对骨代谢过程进行调控[24]㊂
骨的形成主要是由骨祖细胞㊁软骨祖细胞及细胞外基质协同作用完成，而细胞增殖分化㊁细胞外基质成熟㊁矿化和细胞凋亡是成骨细胞在骨形成中的4个主要阶段㊂成骨细胞分化改变是N O N F H发生㊁发展过程中的关键病理变化[11]，而B M P-2能够诱导成骨细胞分化[25]㊂本研究发现,l n c R N A H19在h M S C-B M中的表达水平同B M P-2加入剂量相关,B M P-2以浓度依赖的方式促进l n c R N A H19在h M S C-B M 中的表达，提示l n c R N A H19参与了成骨细胞分化的调控㊂本研究结果显示,l n c R N A H19和R u n x2在N O N F H患者血清中均表达降低；而在h M S C-B M中过表达l n c R N A H19
后能够在转录后水平促进R u n x2的表达；相反，在抑制了l n c R N A H19的表达后R u n x2的表达也随之降低㊂而在细胞增殖的回补实验中发现，抑制l n c R N A H19后细胞的增殖能力减弱，而过表达R u n x2后，细胞的增殖能力部分恢复，提示l n c R N A H19对细胞增殖能力的影响是通过R u n x2实现的㊂
综上所述，与健康对照相比,N O N F H患者l n-c R N A H19表达下调㊂l n c R N A H19能够促进h M-S C-B M中R u n x2表达，并诱导细胞增殖㊂因此,l n-c R N A H19可能通过影响R u n x2表达参与N O N F H 的发生㊁发展，但二者之间调控的具体机制仍需进一步探讨㊂此外，血管内凝血学说认为各种系统疾病激活的血管内凝血也可能是引起骨内血栓和骨坏死的重要途径,N O N F H患者往往存在血小板活性程度增高㊁凝血趋势增加的高凝和低纤容状态㊂l n c R N A H19和R u n x2在这其中扮演的角仍不明确，这也是后期基础向临床转化的一个重要讨论方向㊂
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重庆医学2021年1月第50卷第2期
