使用受刺激的胎盘干细胞的血管生成的制作方法

使用受刺激的胎盘干细胞的血管生成
1.本技术是申请日为2016年5月25日、申请号为201680043819.3、发明名称为“使用受刺激的胎盘干细胞的血管生成”的发明专利申请的分案申请。
2.本技术要求2015年5月26日提交的美国临时专利申请no.62/166,504的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。
1.技术领域
3.本文提供了使用已经被一种或多种细胞因子刺激的组织培养塑料粘附胎盘细胞(例如胎盘干细胞，本文称为pdac)促进血管生成和循环系统疾病或紊乱(例如与血管形成不足或血流不足相关或由其引起的疾病或紊乱，或通过改善血管生成而可的疾病或紊乱)的方法。
2.

背景技术：

4.胎盘是特别有吸引力的干细胞来源。因为哺乳动物胎盘是丰富的，并且通常被作为医疗废物丢弃，因此它们代表医学上有用的干细胞的独特来源。本文提供了这样的分离的胎盘干细胞、胎盘干细胞的体，以及使用其促进血管生成和循环系统疾病或紊乱(例如通过促进血管生成而可的疾病或紊乱)的方法。
3.

技术实现要素：

5.在一个方面，本文提供了组织培养塑料粘附胎盘细胞，例如胎盘干细胞，本文也称为pdac(胎盘衍生粘附细胞，例如下文第5.2节中描述的胎盘衍生粘附细胞)，其已经被一种或多种细胞因子刺激。在某些实施方式中，受刺激的pdac被促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和/或inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，促炎细胞因子是il-ιβ。
6.在具体实施方式中，本文提供的受刺激的pdac粘附于组织培养塑料，并且是通过例如流式细胞术确定的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
。
7.在一些实施方式中，本文所述的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)以比未受刺激的pdac(例如尚未被细胞因子(例如促炎细胞因子，如il-ιβ)刺激的pdac)更高的水平分泌促血管生成因子。在具体实施方式中，所述分泌因子包括gm-csf、g-csf、il-6、gro、mcp-1、卵泡抑素和/或il-8。在具体实施方式中，本文所述的所述受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)具有促血管生成特性。
8.在另一方面，本文提供了患有循环系统疾病或紊乱的个体的方法，其包括向所述个体施用有效量的组织培养塑料粘附胎盘细胞，例如胎盘干细胞，本文也称为pdac(胎盘衍生粘附细胞，例如下文第5.2节中描述的胎盘衍生粘附细胞)，其已经被一种或多种细胞因子刺激，其中所述受刺激的pdac被以足以可检测地改善所述疾病或紊乱的一种或多种症状的量和时间施用于所述个体。在某些实施方式中，受刺激的pdac被促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和/
或inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，促炎细胞因子是il-ιβ。
9.在具体实施方式中，本文提供了有需要的受试者的疾病或紊乱的方法，其包括向所述受试者施用有效量的受刺激的pdac，例如il-ιβ刺激的pdac，例如il-ιβ刺激的cd34-、cd10
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、cd105
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、cd200
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pdac。在具体实施方式中，所述受刺激的pdac被配制成药物组合物。在具体实施方式中，所述疾病或紊乱是心肌梗死。在另一个具体实施方式中，所述疾病或紊乱是充血性心力衰竭。在另一个具体实施方式中，所述疾病或紊乱是心肌病。
10.在另一个具体实施方式中，用受刺激的pdac，例如il-ιβ刺激的pdac，例如il-ιβ刺激的cd34-、cd10
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、cd105
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、cd200
+
pdac的疾病或紊乱是糖尿病足溃疡(dfu)。在具体实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有i型糖尿病。在另一个具体实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有ii型糖尿病。在某些实施方式中，根据本文提供的方法的受试者具有多于一处dfu，例如受试者在单脚上具有多于一处dfu，或在每只脚上具有至少一处dfu。在具体实施方式中，受试者在一只脚或两只脚的底部具有一处或多处dfu。在某些实施方式中，根据本文提供的方法的受试者具有外周神经病，例如对腿和/或脚的神经中的一个或多个的损伤。
11.在某些实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有dfu，其具有导致受试者的外周脉管系统中的血流中的中断的情况。在具体实施方式中，受试者具有外周动脉疾病(pad)。在某些实施方式中，所述dfu由pad引起和/或与pad相关。
12.在某些实施方式中，本文提供的dfu的方法导致根据本文提供的方法的受试者中的dfu的一种或多种症状的可检测的改善。dfu的示例性症状包括但不限于脚和/或小腿上的疮(sore)、溃疡和水疱；脚(或双脚)和/或小腿的疼痛；走路困难；脚(或双脚)的变，例如脚(或双脚)显示出黑、蓝和/或红；和感染的迹象(例如发烧、皮肤发红和/或肿胀)。
13.在某些实施方式中，本文提供的dfu的方法包括向具有dfu的受试者施用足以可检测地改善一个或多个改善征象的量和时间的受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)，其中所述改善征象包括(i)溃疡尺寸减小；(ii)溃疡闭合：不存在引流或对敷料的需要的一个或多个溃疡的皮肤闭合；(iii)闭合后溃疡闭合保持指定时间段，例如闭合后2周、3周、4周、5周或6周；(iv)增加的到溃疡闭合的时间；(v)踝臂指数(abi)的改善，踝臂指数是当受试者处于静止时测量踝部处和手臂中的血压，然后在受试者处于运动中(例如在跑步机上行走)时重复的测试，并且其可用于预测/评估pad的严重度；(vi)趾肱指数(tbi)的改善，趾肱指数是与脚踝血压相反使用脚趾血压的类似于abi的测试；(vii)经皮氧水平的改善，即接近溃疡的皮肤下面的组织中的氧水平(参见例如ruangsetakit等.,j wound care,2010,19(5):202-6)；(viii)脉搏容积记录的改善，其是非侵入性血管测试，其中使用血压袖带和手持式超声设备获得关于手臂和腿中的动脉血流的信息；(ix)到大截肢(major amputation)的时间，例如脚踝以上的截肢；(x)wagner评分量表的改善，wagner评分量表使用分级系统评估溃疡深度和骨髓炎或坏疽的存在：等级0(溃疡前或溃疡后病灶(lesion))、等级1(部分/全层溃疡)、等级2(探查到肌腱或囊)、等级3(深度，伴有骨炎)、等级4(部分脚坏疽)和等级5(全脚坏疽)；(xi)卢瑟福标准的改善，卢瑟福标准用于外周动脉疾病的分期，具有七个分类阶段：阶段0-无症状、阶段1-轻度跛行、阶段2-中度跛行、阶段3-严重跛行、阶段4-静息痛、阶段5-不超出足部的足趾的溃疡的缺血性溃疡，和阶段6-严重缺
血性溃疡或明显坏疽；以及(xii)腿部静息痛评分的改善，腿部静息痛评分是疼痛的0-10量表，0为无疼痛，而10代表最大疼痛。
14.在某些实施方式中，本文提供的dfu的方法包括向患有dfu的受试者施用足以可检测地改善通过例如以下评估的受试者的生活质量的量和时间的胎盘干细胞(例如包含胎盘干细胞的药物组合物)：(i)36项简易格式健康调查(short form health survey，sf-36)(参见如ware等.,medical care 30(6):473-483)；(ii)糖尿病足溃疡量表简易格式(diabetic foot ulcer scale short form，dfs-sf)，其测量糖尿病足溃疡对生活质量的影响(参见如bann等.,pharmacoeconomics,2003,21(17):1277-90)；(iii)患者全面印象变化量表(patient global impression of change scale)，以评估神经病随时间的变化(参见如kamper等.,j.man.manip.ther,2009,17(3):163-170)；和/或(iv)euroqol5d(eq-5d
tm
)表，其是用于获取患者的健康状况的描述性概况和单一指标值的健康问卷。
15.在其他实施方式中，用受刺激的padc(例如il-1β刺激的pdac，例如il-1β刺激的cd34-、cd10
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、cd105
+
、cd200
+
pdac)的疾病或紊乱是动脉瘤、心绞痛、主动脉狭窄、主动脉炎、心律失常、动脉硬化、动脉炎、不对称室间隔肥厚(ash)、动脉粥样硬化、心房纤颤和扑动、细菌性心内膜炎、巴罗综合征(二尖瓣脱垂)、心动过缓、伯格氏病(血栓闭塞性脉管炎)、心脏肥大、心脏炎、颈动脉疾病、主动脉缩窄、先天性心脏缺陷、冠状动脉疾病、艾森曼格综合征、栓塞、心内膜炎、红斑性肢痛、纤颤、纤维肌性发育不良、心脏阻滞、心脏杂音、高血压、低血压、特发性婴儿动脉钙化、川崎病(皮肤粘膜淋巴结综合征、皮肤粘膜淋巴结病、婴儿多动脉炎)、代谢综合征、微血管性心绞痛、心肌炎、阵发性房性心动过速(pat)、结节性动脉周炎(多动脉炎、结节性多动脉炎)、心包炎、周围血管疾病、严重肢体缺血、静脉炎、肺动脉瓣狭窄(肺狭窄)、雷诺氏病、肾动脉狭窄、肾血管性高血压、风湿性心脏病、糖尿病性血管病变、间隔缺损、无症状性缺血、x综合征、心动过速、takayasu动脉炎、法洛四联症、大血管错位、三尖瓣闭锁、动脉干、心脏瓣膜病、静脉曲张溃疡、静脉曲张、血管炎、室间隔缺损、wolff-parkinson-white综合征、心内膜垫缺损、急性风湿热、急性风湿性心包炎、急性风湿性心内膜炎、急性风湿性心肌炎、慢性风湿性心脏病、二尖瓣疾病、二尖瓣狭窄、风湿性二尖瓣不全、主动脉瓣疾病、其他心内膜结构疾病、缺血性心脏病(急性和亚急性)、心绞痛、急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病、脊柱后侧凸心脏病、心肌炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、心内膜弹力纤维增生症、房室传导阻滞、心脏节律失常、心肌变性、脑血管疾病、动脉、小动脉和毛细血管疾病、或静脉和淋巴管疾病。
16.在其他具体实施方式中，用受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac，如il-1β刺激的cd34-、cd10
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、cd105
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、cd200
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pdac)的疾病或紊乱是脑前动脉闭塞和狭窄、或脑动脉闭塞。在一个实施方式中，本文提供了个体的方法，所述个体具有个体的脑中或周围血流中断，例如所述个体具有可归因于个体的脑或中枢神经系统(cns)中或周围血流中断的症状或神经学缺陷，所述方法包括向所述个体施用有效量的受刺激的pdac(例如，il-1β刺激的pdac)。在某些实施方式中，血流中断导致个体的脑或cns的缺氧性损伤或低氧性损伤。
17.在其他具体实施方式中，用受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac，如il-1β刺激的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
pdac)的疾病或紊乱是外周动脉闭塞和狭窄。在一个实施方式中，本文提供了个体的方法，所述个体具有肢体中或周围血流中断，例如所述个体
具有可归因于个体的外周血管系统中或周围血流中断的症状或血管缺陷，所述方法包括向所述个体施用有效量的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在某些实施方式中，血流中断导致个体的肢体和或手足的缺氧性损伤或低氧性损伤。
18.在本文所述的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)是通过注射施用。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，将受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)施用于通过将包含胎盘细胞的基质或支架植入到所述受试者中而的受试者。
19.在本文所述的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被肌内施用。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被静脉内施用。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被皮下施用。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被局部施用。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被全身施用。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被直接施用于被的疾病(例如溃疡，如糖尿病足溃疡)的部位。在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)邻近被的疾病(例如溃疡，如糖尿病足溃疡)的部位施用或在其周围施用。
20.在某些实施方式中，本文所述的方法包括施用约1
×
106、3
×
106、5
×
106、1
×
107、3
×
107、5
×
107、1
×
108、3
×
108、5
×
108、1
×
109、5
×
109或1
×
10
10
个受刺激的pdac(例如，作为包含受刺激的pdac的药物组合物的部分)。在某些实施方式中，本文所述的方法包括施用约1
×
106至3
×
106、3
×
106至5
×
106、5
×
106至1
×
107、1
×
107至3
×
107、3
×
107至5
×
107、5
×
107至1
×
108、1
×
108至3
×
108、3
×
108至5
×
108、5
×
108至1
×
109、1
×
109至5
×
109或5
×
109至1
×
10
10
个受刺激的pdac(例如，作为包含受刺激的pdac的药物组合物的部分)。在具体实施方式中，本文所述的方法包括施用约3
×
106个受刺激的pdac。在另一个具体实施方式中，本文所述的方法包括施用约1
×
107个受刺激的pdac。在另一个具体实施方式中，本文所述的方法包括施用约3
×
107个受刺激的pdac。在另一个具体实施方式中，本文所述的方法包括施用约1
×
108个受刺激的pdac。
21.在本文所述的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被肌内施用于受试者多于一次，施用之间为一周，例如在第1天(施用的第一天)施用受刺激的pdac并且在一周后(即，在第8天)施用第二剂量的受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约3
×
106个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约1
×
107个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约3
×
107个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约1
×
108个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)。在另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)在至少三个不同时
机施用于受试者，施用之间为约一周。
22.在本文所述的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)被施用于受试者多于一次，施用之间为一个月，例如在第1天(施用的第一天)施用受刺激的pdac并且在约一个月后(例如在第27、28、29、30、31、32或33天)施用第二剂量的受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)。在具体实施方式中，方法包括在施用的每一天施用约3
×
106个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)(例如在第1天施用3
×
106个受刺激的pdac，并且在第1天后1个月(例如在第27、28、29、30、31、32或33天)施用约3
×
106个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物))。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天施用约3
×
107个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)(例如在第1天施用3
×
107个受刺激的pdac，并且在第1天后1个月(例如在第27、28、29、30、31、32或33天)施用约3
×
107个受刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天施用约1
×
108个受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)(例如在第1天施用1
×
108个受刺激的pdac，并且在第1天后1个月(例如在第27、28、29、30、31、32或33天)施用约1
×
108个受刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如包含受刺激的pdac的药物组合物)在至少三个不同时机施用于受试者，施用之间为约一个月。
23.在各种实施方式中，可用于本文公开的方法的受刺激的pdac被包含在细胞体中，其中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞是所述受刺激的pdac。在某些实施方式中，所述细胞体中的受刺激的pdac基本上不含具有母体基因型的细胞，例如所述体中的受刺激的pdac的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％具有胎儿基因型，即是胎儿来源的。在某些实施方式中，包含所述受刺激的pdac的细胞体包含具有母体基因型的细胞，例如所述体中的细胞的至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％具有母体基因型，即是母体来源的。
24.在某些实施方式中，用于本文所述方法的受刺激的pdac对于受体是自体性的。在某些实施方式中，用于本文所述方法的受刺激的pdac对于受体是异源性的。
25.在某些实施方式中，用于本文所述方法的受刺激的pdac在施用于受试者之前被冷冻保存。在某些实施方式中，用于本文所述方法的受刺激的pdac是从胎盘细胞库(例如pdac库)获得。
26.3.1定义
27.如本文所使用的，当提及陈述的数值时，术语"约"表示在陈述的数值的正负10％内的值。
28.如本文所使用的，关于本文所述的胎盘衍生粘附细胞的术语"血管生成的"意味着细胞可以形成血管或血管样芽(sprout)，或者细胞可以促进另外的细胞(例如内皮细胞)体中的血管生成(例如血管或血管样结构的形成)。
29.如本文所使用的，术语"血管生成"指血管形成的过程，其包括但不限于内皮细胞活化、迁移、增殖、基质重塑和细胞稳定化。
30.如本文所使用的，术语"衍生的"指从
……
分离的或以其他方式纯化的。例如，胎盘
衍生粘附细胞是从胎盘分离的。术语"衍生的"涵盖从直接从组织(例如胎盘)分离的细胞培养的细胞和从原代分离物培养或扩增的细胞。
31.如本文所使用的，"免疫定位"指使用免疫蛋白(例如抗体或其片段)在例如流式细胞术、荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、原位杂交、免疫组织化学等中检测化合物(例如细胞标志物)。
32.如本文所使用的，术语"sh2"指结合细胞标志物cd105上的表位的抗体。因此，被称为sh2
+
的细胞是cd105
+
。
33.如本文所使用的，术语"sh3"和"sh4"指结合细胞标志物cd73上存在的表位的抗体。因此，被称为sh3
+
和/或sh4
+
的细胞是cd73
+
。
34.胎盘具有在其内部发育的胎儿的基因型，但在妊娠期间也与母体组织紧密物理接触。因此，如本文所使用的，与携带胎儿的母亲的基因型相反，术语"胎儿基因型"指胎儿的基因型，例如与从其获得本文所述的特定的分离的胎盘细胞的胎盘相关的胎儿的基因型。如本文所使用的，术语"母体基因型"指携带胎儿(例如，与从其获得本文所述的特定的分离的胎盘细胞的胎盘相关的胎儿)的母亲的基因型。
35.如本文所使用的，术语"分离的细胞"，例如"分离的胎盘细胞"、"分离的胎盘干细胞"等，指基本上与从其衍生干细胞的组织(例如胎盘)的其他不同细胞分开的细胞。如果干细胞与其天然相关的细胞(例如，非干细胞)或显示不同标志物谱(profile)的干细胞的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或至少99％被从干细胞中移除，例如在干细胞的收集和/或培养过程中，则细胞是"分离的"。
36.如本文所使用的，当涉及细胞时，"多能的"是指细胞具有分化成一些但不一定是全部类型的身体细胞的能力，或分化成具有一些但不是全部类型的身体细胞的特征的细胞的能力，或分化成具有三个胚层中的一个或多个的细胞的能力。在某些实施方式中，例如，如下文5.2节中所述的分离的胎盘细胞(pdac)，其具有分化成具有神经原性细胞、软骨形成细胞和/或成骨细胞的特征的细胞的能力，是多能细胞。
37.如本文所使用的，术语"分离的细胞的体"是指基本上与从其衍生细胞体的组织(例如胎盘)的其他细胞分开的细胞体。
38.如本文所使用的，术语"胎盘细胞"指作为原代分离物或培养细胞的、从哺乳动物胎盘分离的(例如如下文5.2节中所述)，或从分离自哺乳动物胎盘的细胞培养的干细胞或祖细胞，本文也称为"pdac"，不考虑在原代培养物后的传代次数。在某些实施方式中，本文所使用的术语"胎盘细胞"然而不是指，并且用于本文提供的方法的胎盘细胞然而不是，滋养层、细胞滋养层、合胞体滋养层(syncitiotrophoblasts)、成血管细胞(angioblasts)、成血管细胞(hemangioblasts)、胚胎生殖细胞、胚胎干细胞、从胚泡的内细胞团块获得的细胞、或从晚期胚胎的性腺嵴获得的细胞，例如胚胎生殖细胞。本文所述的胎盘细胞(例如pdac)不是在2009年11月19日提交的标题为"amnion derived angiogenic cells"的未决美国专利申请no.12/622,352中描述的羊膜衍生粘附细胞，其公开内容特此通过引用整体并入。如果细胞显示干细胞的属性，例如与一种或多种类型的干细胞相关的标志物或基因表达谱；在培养中复制至少10-40次的能力，以及分化成显示具有三种胚层中的一种或多种的分化细胞的特征的细胞的能力，则细胞被看作是"干细胞"。除非本文另有说明，否则术语"胎盘的"包括脐带。在某些实施方式中，本文公开的分离的胎盘细胞在分化条件下体外
分化、体内分化或两者。
39.如本文所使用的，当标志物是高于背景可检测的时，胎盘细胞对于特定标志物是"阳性的"。特定标志物的检测可以例如通过使用抗体或通过基于编码标志物的基因或mrna的序列的寡核苷酸探针或引物完成。例如，胎盘细胞对于例如cd73是阳性的，因为cd73以可检测地大于背景的量(与例如同种型对照相比)在胎盘细胞上是可检测的。当标志物可以用于区分细胞与至少一种其他细胞类型时，或者可以用于当存在或由细胞表达时选择或分离细胞时，细胞对于标志物也是阳性的。在例如抗体介导的检测的情况下，作为特定细胞表面标志物存在的指示的“阳性”意味着使用对该标志物特异性的抗体(例如荧光标记抗体)，该标志物是可检测的；"阳性"也指展示产生可检测地高于背景的信号(例如在细胞计数器中)的量的标志物的细胞。例如，细胞是"cd200
+
"，其中细胞被对cd200特异性的抗体可检测地标记，并且来自抗体的信号可检测地高于对照(例如背景或同种型对照)的信号。相反地，在相同语境中"阴性"指与对照(例如背景或同种型对照)相比，使用对标志物特异性的抗体，细胞表面标志物是不可检测的。例如，细胞是"cd34-"，其中细胞未被对cd34特异性的抗体可重现地、可检测地标记到大于对照(例如背景或同种型对照)的程度。使用适当的对照，使用抗体未检测到或不可检测的标志物以相似的方式被确定为阳性或阴性。例如，如果在来自细胞或细胞体的rna中检测到的oct-4rna的量如所测定的(例如通过检测rna的方法，如rt-pcr、狭缝杂交(slot blots)等)可检测地大于背景，则细胞或细胞体可以被确定是oct-4
+
。除非本文另有说明，否则分化("cd")标志物的簇被使用抗体检测。在某些实施方式中，oct-4被确定存在，并且如果oct-4是使用rt-pcr可检测的，则细胞是"oct-4
+
"。
40.如本文所使用的，当涉及在流式细胞术中可检测的标志物的表达时，标示"低"指标志物由少于10％的测试细胞表达，或者在例如流式细胞术中可归于标志物的荧光比背景高小于1log。
41.如本文所使用的，""包括疾病、紊乱或病症或其任何参数或症状的补救、改善、严重度减轻、或时程减少。
42.如本文所使用的，当在受刺激的胎盘干细胞(例如受刺激的pdac)的情况下使用时，"受刺激的"指已经与改变接触的细胞的表型的一种或多种分子接触的细胞。例如，胎盘干细胞可以与以某种方式改变细胞的一种或多种细胞因子接触。在受刺激的胎盘pdac中观察到的变化可以包括例如基因表达的变化、可溶性因子的分泌、或生长速率和/或细胞分裂。在具体实施方式中，在相同或相似的实验条件下，受刺激的pdac(例如已经被细胞因子(例如促炎细胞因子，如il-1β)刺激的pdac)以比未受刺激的pdac(例如尚未被细胞因子(例如促炎细胞因子，如il-1β)刺激的pdac)更高的水平分泌促血管生成因子。在具体实施方式中，所述分泌的促血管生成因子包括gm-csf、g-csf、il-6、gro、mcp-1、卵泡抑素和/或il-8。在具体实施方式中，本文所述的所述受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)具有促血管生成特性。
4.附图说明
43.图1显示了由塑料粘附胎盘细胞(pdac)分泌的某些生长因子和细胞因子的水平。
44.图2a-2c显示了pdac细胞条件培养基(p-cm)对人血管内皮细胞(huvec)的生长和存活(图2a)、细胞网络长度(图2b)和形成的细胞管的数量(图2c)的影响。
45.图3显示了p-cm对培养的huvec中的多个磷酸化信号传导通路的时间依赖性影响。
46.图4显示了48小时内p-cm处理对huvec基因表达的影响。
47.图5显示了il-1β对由pdac分泌的各种因子的影响。
48.图6显示了从il-1β刺激的pdac分离的p-cm对huvec细胞信号传导通路的影响。
49.图7a-d显示了在用从il-1β刺激的pdac分离的p-cm处理huvec期间，肝生长因子(hgf)阻断对mek(图7a)、erk1/2(图7b)、stat3(图7c)和akt(图7d)通路的影响。
5.具体实施方式
50.5.1血管生成和与血流不畅(poor blood flow)相关或由其引起的疾病或病症的。
51.本文提供了循环系统疾病或紊乱的方法，其包括施用有效量的组织培养塑料粘附胎盘细胞，例如pdac，如下文第5.2节所述，其中所述pdac已经被细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述pdac被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和inf-γ中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。在某些实施方式中，受刺激的pdac是血管生成性的。
52.5.1.1循环系统疾病
53.本文提供的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)和这样的细胞的体可用于表现出将受益于增加的血管生成的多种疾病状态或病症的个体。这样的疾病状态或病症的实例包括心肌梗死、外周动脉疾病、左心发育不良综合征、糖尿病溃疡、褥疮溃疡、静脉溃疡、动脉溃疡、烧伤、非愈合性骨折、骨关节炎和颌面部骨修复。在某些实施方式中，受刺激的pdac和这样的细胞的体可用于促进表现出创伤性组织损失的个体中的血管生成，或者防止瘢痕形成，或者促进具有全关节置换或假牙修复的个体中的血管生成。在具体实施方式中，所述疾病或紊乱是充血性心力衰竭。
54.在具体实施方式中，本文提供的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)和这样的细胞的体可用于具有循环系统功能不全的个体，例如具有外周血管疾病或冠状动脉疾病的个体。
55.在一个方面，本文提供了用于患有心脏疾病或损伤的患者的方法，其包括将性细胞组合物施用于患有心脏或循环系统疾病或损伤的患者，和评估病人心脏功能的改善，其中所述细胞组合物包含本文所述的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在一个实施方式中，心脏疾病是心肌病。在具体实施方式中，心肌病是特发性的或是具有已知原因的心肌病。在其他具体实施方式中，心肌病在性质上是缺血性的或非缺血性的。在另一个实施方式中，心脏或循环系统疾病包括血管成形术、动脉瘤、心绞痛(心绞痛)、主动脉狭窄、主动脉炎、心律失常、动脉硬化、动脉炎、不对称室间隔肥厚(ash)、动脉粥样硬化、心房纤颤和扑动、细菌性心内膜炎、巴罗综合征(二尖瓣脱垂)、心动过缓、伯格氏病(血栓闭塞性脉管炎)、心脏肥大、心肌病、心肌炎、颈动脉疾病、主动脉缩窄、先天性心脏病(先天性心脏缺陷)、冠状动脉疾病、艾森曼格综合征、栓塞、心内膜炎、红斑性肢痛、纤颤、纤维肌性发育不良、心脏阻滞、心脏杂音、高血压、低血压、特发性婴儿动脉钙化、川崎病(皮肤粘膜淋巴结综合征、皮肤粘膜淋巴结病、婴儿多动脉炎)、代谢综合征、微血管性心绞痛、心肌梗死(心脏
病)、心肌炎、阵发性房性心动过速(pat)、结节性动脉周炎(多动脉炎、结节性多动脉炎)、心包炎、周围血管疾病、严重肢体缺血、糖尿病血管病变、静脉炎、肺动脉瓣狭窄(肺狭窄)、雷诺氏病、肾动脉狭窄、肾血管性高血压、风湿性心脏病、间隔缺损、无症状性缺血、x综合征、心动过速、takayasu动脉炎、法洛四联症、大血管错位、三尖瓣闭锁、动脉干、心脏瓣膜病、静脉曲张溃疡、静脉曲张、血管炎、室间隔缺损、wolff-parkinson-white综合征或心内膜垫缺损中的一种或多种。在具体实施方式中，所述疾病或紊乱是心力衰竭，例如充血性心力衰竭。
56.在其他实施方式中，心脏或循环系统疾病包括急性风湿热、急性风湿性心包炎、急性风湿性心内膜炎、急性风湿性心肌炎、慢性风湿性心脏病、二尖瓣疾病、二尖瓣狭窄、风湿性二尖瓣不全、主动脉瓣疾病、其他心内膜结构疾病、缺血性心脏病(急性和亚急性)、心绞痛、肺循环疾病(急性肺心病、肺栓塞、慢性肺心病)、脊柱后侧凸性心脏病、心肌炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、心内膜弹力纤维增生症、房室传导阻滞、心脏节律失常、心肌变性、包括脑血管疾病的循环系统疾病、脑前动脉闭塞和狭窄、脑动脉闭塞，动脉、小动脉和毛细血管的疾病(动脉粥样硬化、动脉瘤)，或静脉和淋巴管的疾病中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，所述疾病或紊乱是糖尿病足溃疡。
57.在另一个实施方式中，包括用包含受刺激的pdac(如il-1β刺激的pdac)的性细胞组合物在有或没有另外的细胞类型的情况下患有心肌病的个体。在某些实施方式中，个体获益于，例如获益于细胞支持其他细胞(包括存在于心脏中的干细胞或祖细胞)生长的能力，组织向内生长或组织的血管生成，和有益的细胞的因子、趋化因子、细胞因子等的存在，但细胞不整合到个体中或在个体中增加。在另一个实施方式中，患者受益于使用细胞的性，但细胞在患者中不长时间存活。在一个实施方式中，细胞的数量、生存力或生物化学活性逐渐下降，在其他实施方式中，细胞中的下降可能之前是一段时间的活性，例如生长、分裂或生物化学活性。在其他实施方式中，衰老的、无法存活的或甚至死亡的细胞能够具有有益的效果。
58.患有循环系统疾病或紊乱的个体中的改善可以通过循环系统疾病或紊乱的一种或多种症状的可检测的改善而评估或证实，其中所述个体被施用本文提供的受刺激的pdac或性组合物。
59.在另一个实施方式中，患有循环系统疾病或紊乱的个体中的改善可以通过与施用受刺激的pdac之前的个体相比，心脏功能的一个或多个征象的可检测改善而评估或证实，例如胸心输出量(co)、心脏指数(ci)、肺动脉楔压(pawp)、和心脏指数(ci)、缩短分数％(％fs)、射血分数(ef)、左心室射血分数(lvef)；左心室舒张末期内径(lvedd)、左心室收缩末期内径(lvesd)、收缩力(例如，dp/dt)、压力容积环、心脏做功测量、心房或心室功能增加；泵送效率增加、泵送效率损失速率降低、血液动力学功能损失减少；和心肌病相关并发症减少中的一个或多个的可检测改善的证实，其中所述个体被施用受刺激的pdac或包含受刺激的pdac的性组合物。
60.接受本文提供的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)或包含受刺激的pdac的性组合物的个体的改善也可以通过主观度量(metrics)(例如个体关于他或她的施用后健康状况的自我评估)评估。
61.在某些实施方式中，细胞的施用的成功不是基于具有施用的受刺激的pdac(例如
il-1β刺激的pdac)的个体的存活。相反，成功是基于如上所述的心脏或循环系统健康的改善的一个或多个度量。因此，细胞不需要与患者的心脏整合和搏动、或进入血管。
62.受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)或包含这样的细胞的性组合物向有需要的个体的施用可以例如通过移植、植入(例如细胞自身或作为基质-细胞组合的部分的细胞的植入)、注射(例如直接注射到疾病或病症的部位，例如直接注射到已经患有心肌梗塞的个体的心脏中的缺血部位)、输注、经导管递送或本领域已知用于提供细胞疗法的任何其他手段。
63.在一个实施方式中，将性细胞组合物提供给有需要的个体，例如通过注射到个体中的一个或多个部位。在具体实施方式中，性细胞组合物通过心内注射例如到心脏中的缺血区域而提供。在其他具体实施方式中，将细胞注射到心脏表面上、相邻区域中、或甚至到更远的区域。在优选的实施方式中，细胞可以回到患病的或受损的区域。
64.患有冠状或血管系统疾病或病症的个体可以在细胞将是性地有益的任何时候被施用受刺激的pdac。在某些实施方式中，例如，本发明的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)或性组合物在心肌梗塞的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天内施用。时间接近心肌梗塞(例如1-3天或1-7天内)的施用相对于时间远离心肌梗塞(例如心肌梗塞后3天或7天)的施用是优选的。在其他实施方式中，本发明的细胞或性组合物在疾病或病症的初步诊断的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或者1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天内施用。
65.本文还提供了在心肌梗塞的中使用的试剂盒。试剂盒提供包含受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)的性细胞组合物，其可以以药学上可接受的形式制备(例如通过与药学上可接受的载体混合)，和施用器以及使用说明书。理想地，试剂盒可以在现场使用，例如在医生的办公室中，或由紧急护理提供者使用以被应用于被诊断为已经患有心肌梗塞或类似心脏事件的患者。
66.在本文提供的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)与干细胞(即非pdac的干细胞)、成肌细胞、肌细胞、成心肌细胞、心肌细胞，或成肌细胞、肌细胞、成心肌细胞和/或心肌细胞的祖细胞一起施用。
67.在具体实施方式中，本文提供的方法包括将受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac、例如包含受刺激的细胞的性组合物)施用于患有心脏或循环系统疾病的患者；和评估患者心脏功能的改善，其中所述性细胞组合物作为基质-细胞复合物施用。在某些实施方式中，基质是包含至少细胞的支架，优选是生物可吸收的。
68.受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)和这样的细胞的体可以性地或预防性地提供给个体，例如患有心脏或循环系统的疾病、紊乱或病症，或者感染心脏或循环系统的个体。这样的疾病、紊乱或病症可以包括动脉粥样硬化引起的充血性心力衰竭、心肌病或心脏损伤，例如缺血性损伤，例如来自心肌梗塞或创伤(急性或慢性)。
69.在某些实施方式中，向个体施用有效量的受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac，例如在包含pdac的受刺激的细胞的体中的。在具体实施方式中，体包含约50％的受刺激的pdac。在另一个具体实施方式中，体是受刺激的pdac的基本上同质的体。在其
他实施方式中，体包含至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的受刺激的pdac。
70.受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)可以以性组合物的形式施用于个体，所述性组合物包含细胞和另外的剂，例如胰岛素样生长因子(igf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血管内皮生长因子(vegf)、肝细胞生长因子(hgf)、白细胞介素18(il-8)、抗血栓形成剂(例如肝素、肝素衍生物、尿激酶、或ppack(右旋苯丙氨酸脯氨酸精氨酸氯甲基酮)、抗凝血酶化合物、血小板受体拮抗剂、抗凝血酶抗体、抗血小板受体抗体、阿司匹林、双嘧达莫、鱼精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制剂、和/或血小板抑制剂)、抗凋亡剂(例如促红细胞生成素(epo)、epo衍生物或同系物、或它们的盐、血小板生成素(tpo)、igf-i、igf-ii、肝细胞生长因子(hgf)、或半胱天冬酶抑制剂)、抗炎剂(例如p38 map激酶抑制剂、他汀类药物、il-6抑制剂、il-1抑制剂、吡嘧司特、曲尼司特、类克(remicade)、西罗莫司和/或非甾体抗炎化合物(例如乙酰水杨酸、布洛芬、替泊、托美丁或苏洛芬))、免疫抑制剂或免疫调节剂(例如钙调磷酸酶抑制剂，如环孢菌素、他克莫司、mtor抑制剂如西罗莫司或依维莫司；抗增殖剂例如硫唑嘌呤和/或吗替麦考酚酯；皮质类固醇，例如泼尼松龙或氢化可的松；抗体例如单克隆抗il-2rα受体抗体、巴利昔单抗、达利珠单抗，多克隆抗t细胞抗体例如抗胸腺细胞球蛋白(atg)、抗淋巴细胞球蛋白(alg)和/或单克隆抗t细胞抗体okt3、或如美国专利no.7,468,276和美国专利申请公布no.2007/0275362中所述的粘附胎盘干细胞，其每一个的公开内容通过引用整体并入本文)、和/或抗氧化剂(例如普罗布考；维生素a、c和/或e、辅酶q-10、谷胱甘肽、l半胱氨酸、n-乙酰半胱氨酸，或前述任一种的抗氧化剂衍生物、类似物或盐)。在某些实施方式中，包含pdac的性组合物还包含一种或多种另外的细胞类型，例如成体细胞(例如成纤维细胞或内胚层细胞)、干细胞和/或祖细胞。这样的剂和/或一种或多种另外的细胞类型可以单独地或以两种或更多种这样的化合物或试剂的组合施用于有需要的个体。
71.在某些实施方式中，待的个体是哺乳动物。在具体实施方式中，待的个体是人。在具体实施方式中，个体是家畜动物或家养动物。在其他具体实施方式中，待的个体是马、羊、牛或阉牛、猪、狗或猫。
72.5.1.2缺血性疾病的
73.在某些实施方式中，本文提供了患有例如在外周脉管系统中具有血流中断的个体的方法，其包括向个体施用有效量的受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac。在某些具体实施方式中，缺血是外周动脉疾病(pad)，例如是严重肢体缺血(cli)。在某些其他实施方式中，缺血是外周血管疾病(pvd)、外周动脉疾病、缺血性血管疾病、缺血性心脏疾病或缺血性肾病。
74.在具体实施方式中，所述血流中断是严重肢体缺血。在另一个更具体的实施方式中，所述cli是下肢的动脉中的严重阻塞，其显著降低血流量。在另一个更具体的实施方式中，所述cli的特征是缺血性静息痛，当个体不动时腿部和脚部的剧烈疼痛，腿或脚上的非愈合疮，脚的疼痛或麻木，腿或脚的光泽、光滑、干燥的皮肤、脚趾甲增厚，腿或脚的消失或减弱的脉搏，不愈合的开放性疮、皮肤感染或溃疡，和/或腿或脚的干性坏疽(干燥、黑皮肤)。在另一个具体实施方式中，患有cli的个体已经经历至少一个指头和/或整个肢体的缺损。在方法的另一个具体实施方式中，所述有效量是受刺激的pdac(例如il-1β刺激的
pdac)的数量，其导致可归因于个体的外周脉管系统中的血流中断的一种或多种症状、肢体功能损失和/或氧剥夺(低氧/缺氧)的消除、可检测的改善、严重度的减轻或进展的减缓。在另一个具体实施方式中，所述有效量的分离的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)被预防性地施用于所述个体，例如以减少或消除在所述血流中断之后由肢体中或周围的二次或继发血流中断引起的组织损伤。
75.在其他实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)可用于中风，例如缺血性中风，例如通过促进cns缺血区域的血管生成而中风。在一个方面，本文提供了个体的方法，所述个体具有个体的脑中或脑周围的血流中断，例如所述个体具有可归因于个体的脑或中枢神经系统(cns)中或其周围血流中断的症状或神经功能缺陷，所述方法包括向所述个体施用有效量的分离的组织培养塑料粘附人胎盘细胞，其中所述分离的胎盘细胞具有多能细胞或干细胞的特征。在某些实施方式中，血流中断导致对个体的脑或cns的缺氧性损伤或低氧性损伤。如本文所考虑的，可归因于个体的脑中或周围血流中断的个体的症状或神经缺陷包括可归因于可能伴随这样的个体的脑中或周围血流中断的再灌注损伤的症状或神经缺陷。
76.除了是血管生成性的以外，本文提供的受刺激的胎盘细胞(例如如下所述的il-1β刺激的pdac)是神经保护性的。在某些实施方式中，受刺激的胎盘细胞在低氧环境下(例如低氧条件下(例如低于5％o2))是神经保护性的。在某些实施方式中，当与神经元或其他神经细胞或星形胶质细胞接触时，受刺激的胎盘干细胞增加神经元、神经细胞或星形胶质细胞的健康，例如如通过在体外的pdac和神经元的共培养物中的神经突长度的增加所看到的。在某些其他实施方式中，pdac(例如il-1β刺激的pdac)降低低氧环境中的一种或多种活性氧种类的浓度。此外，在某些实施方式中，受刺激的胎盘细胞(例如pdac)分泌神经营养细胞因子bdnf、vegf、hgf、g-csf、神经生长因子(ngf)和/或神经营养因子-3(ntf3)中的一种或多种。因此，pdac(例如il-1β刺激的pdac)可用于对cns和对pns二者的缺血性损伤，例如中风导致的对cns中的神经系统的缺血性损伤，或者严重肢体缺血或外周血管疾病导致的pns中的神经系统的缺血性损伤。在其他实施方式中，pdac(例如il-1β刺激的pdac)可用于例如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化、帕金森病、阿尔兹海默症和/或周围神经病，例如糖尿病性神经病。
77.5.1.3糖尿病足溃疡的
78.本文提供了有需要的受试者中的糖尿病足溃疡(dfu)的方法，其包括向受试者施用有效量的受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac。在具体实施方式中，所述受刺激的pdac被配制成药物组合物。
79.在具体实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有i型糖尿病。在另一个具体实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有ii型糖尿病。在某些实施方式中，根据本文提供的方法的受试者具有多于一处dfu，即受试者在单脚上具有多于一处dfu，或在每只脚上具有至少一处dfu。在具体实施方式中，受试者在一只脚或两只脚的底部具有一处或多处dfu。
80.在某些实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有外周神经病，例如对腿和/或脚的神经中的一个或多个的损伤。
81.在某些实施方式中，根据本文提供的方法的具有dfu的受试者具有dfu，其具
有导致受试者的外周脉管系统中的血流中的中断的情况。在具体实施方式中，受试者具有外周动脉疾病(pad)。在某些实施方式中，所述dfu由pad引起和/或与pad相关。
82.在某些实施方式中，本文提供的dfu的方法导致根据本文提供的方法的受试者中的dfu的一种或多种症状的可检测的改善。dfu的示例性症状包括但不限于脚部和/或小腿上的疮、溃疡和水疱；脚(或双脚)和/或小腿的疼痛；走路困难；脚(或双脚)的变，例如脚(或双脚)显示出黑、蓝和/或红；和感染的迹象(例如发烧、皮肤发红和/或肿胀)。
83.在某些实施方式中，本文提供的dfu的方法包括向具有dfu的受试者施用足以可检测地改善一个或多个改善征象的量和时间的受刺激的pdac(例如，il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)，其中所述改善征象包括(i)溃疡尺寸减小；(ii)溃疡闭合：不存在引流或对敷料的需要的一个或多个溃疡的皮肤闭合；(iii)闭合后溃疡闭合保持指定时间段，例如闭合后2周、3周、4周、5周或6周；(iv)到溃疡闭合的时间；(v)踝臂指数(abi)的改善，踝臂指数是当受试者处于静止时测量踝部处和手臂中的血压，然后在受试者处于运动中(例如在跑步机上行走)时重复的测试，并且其可用于预测/评估pad的严重度；(vi)趾肱指数(tbi)的改善，趾肱指数是与脚踝血压相反使用脚趾血压的类似于abi的测试；(vii)经皮氧的改善，即接近溃疡的皮肤下面的组织中的氧水平(参见例如ruangsetakit等.,j wound care,2010,19(5):202-6)；(viii)脉搏容积记录的改善，其是非侵入性血管测试，其中使用血压袖带和手持式超声设备获得关于手臂和腿中的动脉血流的信息；(ix)到大截肢的时间，例如脚踝以上的截肢；(x)wagner评分量表的改善，wagner评分量表使用分级系统评估溃疡深度和骨髓炎或坏疽的存在：等级0(溃疡前或溃疡后病灶)、等级1(部分/全层溃疡)、等级2(探查到肌腱或囊)、等级3(深度，伴有骨炎)、等级4(部分脚坏疽)和等级5(全脚坏疽)；(xi)卢瑟福标准的改善，卢瑟福标准用于外周动脉疾病的分期，具有七个分类阶段：阶段0-无症状、阶段1-轻度跛行、阶段2-中度跛行、阶段3-严重跛行、阶段4-静息痛、阶段5-不超出足部的足趾的溃疡的缺血性溃疡，和阶段6-严重缺血性溃疡或明显坏疽；以及(xii)腿部静息痛评分的改善，腿部静息痛评分是疼痛的0-10量表，0为无疼痛，而10代表最大疼痛。
84.在某些实施方式中，本文提供的dfu的方法包括向患有dfu的受试者施用足以可检测地改善通过例如以下评估的受试者的生活质量的量和时间的受刺激的pdac(例如，il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)：(i)36项简易格式健康调查(short form health survey，sf-36)(参见如ware等.,medical care 30(6):473-483)；(ii)糖尿病足溃疡量表简易格式(diabetic foot ulcer scale short form，dfs-sf)，其测量糖尿病足溃疡对生活质量的影响(参见如bann等.,pharmacoeconomics,2003,21(17):1277-90)；(iii)患者全面印象变化量表(patient global impression of change scale)，以评估神经病随时间的变化(参见如kamper等.,j.man.manip.ther,2009,17(3):163-170)；和/或(iv)euroqol5d(eq-5d
tm
)表，其是用于获取患者的健康状况的描述性概况和单一指标值的健康问卷。
85.在本文所述的dfu的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)通过注射施用。在本文所述的dfu的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的
pdac的药物组合物)通过将包含胎盘细胞的基质或支架植入到所述受试者中而施用于被的受试者。
86.在本文所述的dfu的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)被肌内施用。在本文所述的dfu的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)被静脉内施用。在本文所述的dfu的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)被皮下施用。在本文所述的dfu的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)被局部施用。在本文所述的dfu的方法的另一个具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)被全身施用。在某些实施方式中，本文所述的dfu的方法包括施用约1
×
106、3
×
106、5
×
106、1
×
107、3
×
107、5
×
107、1
×
108、3
×
108、5
×
108、1
×
109、5
×
109或1
×
10
10
个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)。在某些实施方式中，本文所述的dfu的方法包括施用约1
×
106至3
×
106、3
×
106至5
×
106、5
×
106至1
×
107、1
×
107至3
×
107、3
×
107至5
×
107、5
×
107至1
×
108、1
×
108至3
×
108、3
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108至5
×
108、5
×
108至1
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109、1
×
109至5
×
109、或5
×
109至1
×
10
10
个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)。在具体实施方式中，本文所述的dfu的方法包括施用约3
×
106个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，本文所述的dfu的方法包括施用约1
×
107个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，本文所述的dfu的方法包括施用约3
×
107个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。
87.在本文所述的dfu的方法的具体实施方式中，受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)被肌内施用，施用之间为一周，例如在第1天(施用的第一天)施用受刺激的pdac并在一周后(即在第8天)施用第二剂量的受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac或包含il-1β刺激的pdac的药物组合物)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约3
×
106个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约1
×
107个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，方法包括在施用的每一天(即在第1天和第8天)施用约3
×
107个受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)。在另一个具体实施方式中，被施用受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)的受试者患有pad。
88.5.2分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞体
89.用作产生受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)的基础的胎盘细胞是可从胎盘或其部分获得的细胞，其粘附于组织培养基底并且具有多能细胞或干细胞但不是滋养层的特征。本节(5.2)描述了胎盘细胞，其代表可用于产生受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)的细胞来源。
90.用作产生受刺激的pdac的基础的胎盘细胞可以是胎儿或母体来源的(即，可以分别具有胎儿或母体的基因型)。优选地，胎盘细胞及其体是胎儿来源的。如本文所使用的，短语"胎儿来源的"或"非母体来源的"表示分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞的体是从
与胎儿相关的脐带或胎盘结构获得的，即具有胎儿基因型。如本文所使用的，短语"母体来源的"表示细胞或细胞体是从与母亲相关的胎盘结构获得的，即具有母体基因型。分离的胎盘细胞或包含分离的胎盘细胞的细胞体可以包含只是胎儿来源或母体来源的分离的胎盘细胞，或者可以包含胎儿和母体来源二者的分离的胎盘细胞的混合体。分离的胎盘细胞和包含受刺激的分离的胎盘细胞的细胞体可以通过下文讨论的形态学、标志物和培养特征识别和选择。在某些实施方式中，本文所述的胎盘细胞(例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞)中的任一者对于受体(例如患有循环系统疾病或紊乱的个体)是自体性的。在某些其他实施方式中，本文所述的胎盘细胞(例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞)中的任一者对于受体(例如患有循环系统疾病或紊乱的个体)是异源性的。
91.在某些实施方式中，本文所述用作产生受刺激的pdac(例如下文第5.2.1节、第5.2.2节和第5.2.3节中所述的pdac)的基础的胎盘干细胞被一种或多种促炎细胞因子刺激。在某些实施方式中，本文所述用作产生受刺激的的pdac(例如下文第5.2.1节、第5.2.2节和第5.2.3节中所述的pdac)的基础的胎盘干细胞已经被il-1α,il-1β,il-6,il-8,il-18,tnf-α或inf-γ中的一种或多种刺激。在具体实施方式中，本文所述用作产生受刺激的的pdac(例如下文第5.2.1节、第5.2.2节和第5.2.3节中所述的pdac)的基础的胎盘干细胞已经被il-1β刺激。
92.5.2.1物理和形态特征
93.当在原代培养物或细胞培养物中培养时，本文所述用于产生受刺激的pdac的分离的胎盘细胞粘附于组织培养基底，例如组织培养容器表面(例如组织培养塑料)，或涂布细胞外基质或配体(例如层粘连蛋白、胶原(例如天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻璃粘连蛋白和细胞外膜蛋白(例如(bd discovery labware,bedford,mass.)))的组织培养表面。用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞在培养中呈现大致成纤维细胞样的、星状的外观，具有从中央细胞体延伸的许多细胞质突起。然而，细胞在形态学上可以与在相同条件下培养的成纤维细胞区分，因为分离的胎盘细胞比成纤维细胞表现出更多的这种突起。在形态上，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞也可与造血干细胞区分，所述造血干细胞通常在培养中呈现更圆的或鹅卵石的形态。
94.在某些实施方式中，当在生长培养基中培养时，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞发育胚状体样体(embryoid-like body)。胚状体样体是不连续的细胞团块，其可以在增殖分离的胎盘细胞的粘附层的顶部上生长。使用术语"胚状体样的"是因为细胞团块类似于胚状体(从胚胎干细胞的培养生长的细胞团块)。在其中胚状体样体可以发育成分离的胎盘细胞的增殖培养物的生长培养基包括包含以下的培养基，例如dmem-lg(例如来自gibco)、2％胎牛血清(例如来自hyclone labs)、1
×
胰岛素-转铁蛋白-硒(its)、1
×
亚油酸-牛血清白蛋白(la-bsa)、10-9
m地塞米松(例如来自sigma)、10-4
m抗坏血酸2-磷酸酯(例如来自sigma)、表皮生长因子10ng/ml(例如来自r&d systems)、和血小板衍生生长因子(pdgf-bb)10ng/ml(例如来自r&d systems)。
95.5.2.2细胞表面、分子和遗传标志物
96.用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是组织培养塑料粘附人胎盘细胞，其具有多能细胞或干细胞的特征，并且表达可用于识别和/或分离细胞或包含干细胞
的细胞体的多种标志物。在某些实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞是血管生成性的，例如在体内或体外。用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞和胎盘细胞体包括直接从胎盘或其任何部分(例如绒毛膜、胎盘子叶等)获得的胎盘细胞和含有胎盘细胞的细胞体。用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞体也包括培养物中的分离的胎盘细胞(即两种或更多种)的体，和容器(例如袋)中的体。用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞不是骨髓衍生间充质细胞、脂肪衍生间充质干细胞或从脐带血、胎盘血或外周血获得的间充质细胞。可用于本文所述的方法和组合物中的用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞(例如胎盘多能细胞和胎盘细胞)在本文和例如美国专利no.7,311,904；7,311,905和7,468,276；和美国专利申请公布no.2007/0275362(其公开内容在此通过引用整体并入)中描述。
97.在某些其他实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞是分离的胎盘多能细胞。在一个实施方式中，所述细胞(例如用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞)是如通过流式细胞术检测的cd34-、cd10
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞具有分化成神经表型细胞、成骨表型细胞和/或软骨形成表型细胞的潜能。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd45-或cd90
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd45-和cd90
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
或cd45-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
或cd45-，即细胞是cd34-、cd10
+
、cd45-、cd90
+
、cd105
+
和cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述cd34-、cd10
+
、cd45-、cd90
+
、cd105
+
和cd200
+
细胞另外是cd80-和cd86-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞已经被一种或多种细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述细胞因子是促炎细胞因子。在另一个具体实施方式中，所述细胞因子是il-ιβ。
98.在某些实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是如通过流式细胞术检测的cd34-、cd10
+
、cd105
+
和cd200
+
，以及cd38-、cd45-、cd80-、cd86-、cd133-、hla-dr,dp,dq-、ssea3-、ssea4-、cd29
+
、cd44
+
、cd73
+
、cd90
+
、cd105
+
、hla-a,b,c
+
、pdl1
+
、abc-p
+
和/或oct-4
+
中的一种或多种。在其他实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞中的任一种另外是cd29
+
、cd38-、cd44
+
、cd54
+
、sh3
+
或sh4
+
中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，细胞另外是cd44
+
。在上述分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞中的任一种的另一个具体实施方式中，细胞另外是cd171-、cd133-、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-或程序性死亡-1配体(pdl1)
+
或其任何组合中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘干细胞已经被一种或多种细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述细胞因子是促炎细胞因子。在另一个具体实施方式中，所述细胞因子是il-ιβ。
99.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎
盘细胞另外是cd13
+
、cd29
+
、cd33
+
、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、sh3
+
(cd73
+
)、sh4
+
(cd73
+
)、cd80-、cd86-、cd90
+
、sh2
+
(cd105
+
)、cd106/vcam
+
、cd117-、cd144/ve-钙粘蛋白
低
、cd184/cxcr4-、cd200
+
、cd133-、oct-4
+
、ssea3-、ssea4-、abc-p
+
、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-、hla-g-或程序性死亡-1配体(pdl1)
+
或其任何组合中的一种或多种。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd13
+
、cd29
+
、cd33
+
、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54/icam
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、sh3
+
(cd73
+
)、sh4
+
(cd73
+
)、cd80-、cd86-、cd90
+
、sh2
+
(cd105
+
)、cd106/vcam
+
、cd117-、cd144/ve-钙粘蛋白
低
、cd184/cxcr4-、cd200
+
、cd133-、oct-4
+
、ssea3-、ssea4-、abc-p
+
、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-、hla-g-或程序性死亡-1配体(pdl1)
+
。
100.在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞中的任一种另外是如通过流式细胞术检测的abc-p
+
、或通过rt-pcr确定的oct-4
+
(pou5f1
+
)，其中abc-p是胎盘特异性abc转运蛋白(也称为乳腺癌抗性蛋白(bcrp)和米托蒽醌抗性蛋白(mxr))，以及oct-4是octamer-4蛋白(pou5f1)。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞中的任一种另外是如通过流式细胞术确定的ssea3-或ssea4-，其中ssea3是阶段特异性胚胎抗原3，以及ssea4是阶段特异性胚胎抗原4。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞中的任一种另外是ssea3-和ssea4-。
101.在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞中的任一种另外是mhc-i
+
(例如hla-a,b,c
+
)、mhc-ii-(例如hla-dp,dq,dr-)或hla-g-中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞中的任一种另外是mhc-i
+
(例如hla-a,b,c
+
)、mhc-ii-(例如hla-dp,dq,dr-)或hla-g-中的一种或多种。
102.本文还提供了用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞的体，或者细胞体，例如胎盘细胞的体，其包含例如针对可用于本文公开的方法和组合物的分离的胎盘细胞而富集的胎盘干细胞。包含用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞的优选细胞体，其中细胞体包含例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的分离的cd10
+
、cd105
+
和cd34-胎盘细胞；即所述体中至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是分离的cd10
+
、cd105
+
和cd34-胎盘细胞。在具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
或cd45-。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
和cd45-。在另一个具体实施方式中，上述分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞中的任一种另外是cd29
+
、cd38-、cd44
+
、cd54
+
、sh3
+
或sh4
+
中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
的分离的胎盘细胞，或者用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
的分离的胎盘细胞另外是cd44
+
。在包含上述分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞的细胞体中的任一种的具体实施方式中，分离的胎盘细胞另外是cd13
+
、cd29
+
、cd33
+
、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、sh3
+
(cd73
+
)、sh4
+
(cd73
+
)、cd80-、cd86-、cd90
+
、sh2
+
(cd105
+
)、cd106/vcam
+
、cd117-、cd144/ve-钙粘蛋白
低
、cd184/
cxcr4-、cd200
+
、cd133-、oct-4
+
、ssea3-、ssea4-、abc-p
+
、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-、hla-g-或程序性死亡-1配体(pdl1)
+
或其任何组合中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
细胞另外是cd13
+
、cd29
+
、cd33
+
、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54/icam
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、sh3
+
(cd73
+
)、sh4
+
(cd73
+
)、cd80-、cd86-、cd90
+
、sh2
+
(cd105
+
)、cd106/vcam
+
、cd117-、cd144/ve-钙粘蛋白
低
、cd184/cxcr4-、cd200
+
、cd133-、oct-4
+
、ssea3-、ssea4-、abc-p
+
、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-、hla-g-或程序性死亡-1配体(pdl1)
+
。
103.在某些实施方式中，用于产生受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-、ssea4-、oct-4
+
和abc-p
+
中的一种或多种或全部，其中所述分离的胎盘细胞通过胎盘组织的物理和/或酶促破坏获得。在具体实施方式中，分离的胎盘细胞是oct-4
+
和abc-p
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
和cd34-，其中所述分离的胎盘细胞具有以下特征中的至少一个：cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-和ssea4-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
、cd34-、cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-和ssea4-。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
、cd34-、ssea3-和ssea4-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
和cd34-，并且是sh2
+
或sh3
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
、cd34-、sh2
+
和sh3
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
、cd34-、ssea3-和ssea4-，并且是sh2
+
或sh3
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
和cd34-，并且是sh2
+
或sh3
+
，并且是cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、ssea3-或ssea4-中的至少一种。在另一个具体实施方中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
、cd34-、cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、ssea3-和ssea4-，并且是sh2
+
或sh3
+
。
104.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac(其可用于本文所述的方法和组合物)的分离的胎盘干是sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
和oct-4
+
。在另一个具体实施方式中，分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd54
+
、cd90
+
、cd34-、cd45-、ssea3-或ssea4-。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-和ssea4-。在另一个具体实施方式中，分离的胎盘细胞是sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-和ssea4-、cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd54
+
、cd90
+
、oct-4
+
、cd34-或cd45-。
105.在另一个实施方式中，可用于本文公开的方法和组合物的用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh2
+
、sh3
+
和sh4
+
；其中所述分离的胎盘细胞另外是oct-4
+
、ssea3-或ssea4-中的一种或多种。
106.在某些实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是cd200
+
或hla-g-。在具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd200
+
和hla-g-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞另外是cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具
体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述干细胞是cd34-、cd38-、cd45-、cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，在允许形成胚状体样体的条件下，所述分离的cd200
+
或hla-g-胎盘细胞促进在包含分离的胎盘细胞的胎盘细胞体中形成胚状体样体。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞与不是干细胞或多能细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
107.在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物中的细胞体是包含例如针对cd200
+
、hla-g-干细胞富集的细胞的体。在具体实施方式中，所述体是用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞体。在各种实施方式中，所述细胞体中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞。优选地，所述细胞体中至少约70％细胞是分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞。更优选地，至少约90％、95％或99％的所述细胞是分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞。在细胞体的具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞也是cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞也是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞也是cd34-、cd38-、cd45-、cd73
+
和cd105
+
。在另一个实施方式中，当在允许形成胚状体样体的条件下培养时，所述细胞体产生一个或多个胚状体样体。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
108.在另一个实施方式中，可用于本文所述方法和组合物中的分离的胎盘细胞是cd73
+
、cd105
+
和cd200
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是hla-g-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd34-、cd38-、cd45-和hla-g-。在另一个具体实施方式中，在体在允许形成胚状体样体的条件下培养时，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的cd73
+
、cd105
+
和cd200
+
胎盘细胞促进在包含分离的胎盘细胞的胎盘细胞的体中形成一个或多个胚状体样体。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞与不是分离的胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
109.在另一个实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的细胞体(其可用于本文所述的方法和组合物)是包含例如针对分离的cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞富集的细胞的体。在各种实施方式中，所述细胞体中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约70％的所述细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约90％、95％或99％的细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞。在所述体的具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激
的pdac的分离的胎盘细胞是hla-g-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞另外是cd34-、cd38-、cd45-和hla-g-。在另一个具体实施方式中，当在允许形成胚状体样体的条件下培养时，所述细胞体产生一个或多个胚状体样体。在另一个具体实施方式中，所述胎盘细胞体与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述胎盘细胞体与不展示这些特性的胎盘细胞分离。
110.在某些其他实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-、ssea4-、oct-4
+
、hla-g-或abc-p
+
中的一种或多种。在具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-、ssea4-和oct-4
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd45-、cd54
+
、sh2
+
、sh3
+
和sh4
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd45-、cd54
+
、sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
和oct-4-。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、hla-g-、sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
和abc-p
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
和oct-4
+
。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
、cd34-、ssea3-和ssea4-。在具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的所述分离的oct-4
+
、cd34-、ssea3-和ssea4-胎盘细胞另外是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh2
+
、sh3
+
和sh4
+
。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是oct-4
+
和cd34-，以及是sh3
+
或sh4
+
。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd34-以及是cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd54
+
、cd90
+
或oct-4
+
。
111.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是cd200
+
和oct-4
+
。在具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的所述分离的胎盘细胞是hla-g-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞是cd34-、cd38-、cd45-、cd73
+
、cd105
+
和hla-g-。在另一个具体实施方式中，当体是在允许形成胚状体样体的条件下培养时，分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞促进包含分离的细胞的胎盘细胞体产生一个或多个胚状体样体。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞与不是干细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞与不展示这些特性的胎盘细胞分离。
112.在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物的细胞体是用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞的体，其包含例如针对cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞富集的细胞。
在各种实施方式中，所述细胞体中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，至少约70％的所述细胞是分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约80％、90％、95％或99％的细胞是分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞。在分离的体的具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞另外是cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞另外是hla-g-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-、cd45-、cd73
+
、cd105
+
和hla-g-。在另一个具体实施方式中，当在允许胚状体样体形成的条件下培养时，细胞体产生一个或多个胚状体样体。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不是分离的cd200
+
、oct-4
+
胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
113.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是cd73
+
、cd105
+
和hla-g-。在另一个具体实施方式中，分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞另外是oct-4
+
。在另一个具体实施方式中，分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞另外是cd34-、cd38-、cd45-、oct-4
+
和cd200
+
。在另一个具体实施方式中，当体是在允许胚状体样体形成的条件下培养时，分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞促进在包含所述细胞的胎盘细胞体中形成胚状体样体。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞与不是分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
114.在另一个实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的细胞体(其可用于本文所述的方法和组合物)是包含例如针对分离的cd73
+
、cd105
+
和hla-g-胎盘细胞富集的体的细胞体。在各种实施方式中，所述细胞体中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中的至少约70％细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中的至少约90％、95％或99％的细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞。在上述体的具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞另外是oct-4
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞另外是cd34-、cd38-、cd45-、oct-4
+
和cd200
+
。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的所述细胞体与不是cd73
+
、cd105
+
、hla-g-胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的所述细胞体与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
115.在另一个实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是cd73
+
和cd105
+
，并且当所述体是在允许胚状体样体形成的条件下培养时，促进在包含所述cd73
+
、cd105
+
细胞的分离的胎盘细胞的体中形成一个或多个胚状体样体。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是oct-4
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是oct-4
+
、cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞与不展示这些特性的胎盘细胞分离。
116.在另一个实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的细胞体(其可用于本文所述的方法和组合物)是包含例如针对作为cd73
+
、cd105
+
的分离的胎盘细胞富集的体，并且当所述体是在允许胚状体样体形成的条件下培养时，促进在包含所述细胞的分离的胎盘细胞的体中形成一个或多个胚状体样体的细胞体。在各种实施方式中，所述细胞体中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细胞是分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约70％的细胞是所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约90％、95％或99％的细胞是所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞。在上述体的具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是oct-4
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-、cd45-、oct-4
+
和cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不是所述分离的cd73
+
、cd105
+
胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
117.在另一个实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是oct-4
+
，并且在允许胚状体样体形成的条件下培养时，促进在包含所述细胞的分离的胎盘细胞的体中形成一个或多个胚状体样体。在具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
、cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞与不是oct-4
+
胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞与不展示这些特性的胎盘细胞分离。
118.在另一个实施方式中，用于产生本文所述的受刺激的pdac的细胞体(其可用于本文所述的方法和组合物)是包含例如针对作为oct-4
+
的分离的胎盘细胞富集的体，并且当所述体是在允许胚状体样体形成的条件下培养时，促进在包含所述细胞的分离的胎盘细胞的体中形成一个或多个胚体状样体的细胞体。在各种实施方式中，所述细胞体中的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或至少约60％的细
胞是所述分离的oct-4
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约70％的细胞是所述分离的oct-4
+
胎盘细胞。在另一个实施方式中，所述细胞体中至少约80％、90％、95％或99％的细胞是所述分离的oct-4
+
胎盘细胞。在上述体的具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-或cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd73
+
和cd105
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述分离的oct-4
+
胎盘细胞另外是cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
、cd34-、cd38-和cd45-。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述细胞体与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
119.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是hla-a,b,c
+
、cd45-、cd133-和cd34-胎盘细胞。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞体(其可用于本文所述的方法和组合物)是包含分离的胎盘细胞的细胞的体，其中所述分离的细胞体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的hla-a,b,c
+
、cd45-、cd133-和cd34-胎盘细胞。在具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不是hla-a,b,c
+
、cd45-、cd133-和cd34-胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞体基本上不含母体组分；例如所述分离的胎盘细胞体中至少约40％、45％、5-0％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。
120.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的cd10
+
、cd13
+
、cd33
+
、cd45-、cd117-和cd133-胎盘细胞。在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物的细胞体是包含分离的胎盘细胞的细胞的体，其中所述细胞体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的cd10
+
、cd13
+
、cd33
+
、cd45-、cd117-和cd133-胎盘细胞。在具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不是所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的cd10
+
、cd13
+
、cd33
+
、cd45-、cd117-和cd133-胎盘细胞是非母体来源的，即具有胎儿基因型。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不展示这些特性的胎盘细胞分离。
121.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的cd10-、cd33-、cd44
+
、cd45-和cd117-胎盘细胞。在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物的细胞体是包含例如针对分离的胎盘细胞富集的体的细胞体，其中所述细胞体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是分离的cd10-、cd33-、cd44
+
、cd45-和cd117-胎盘细胞。在具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述细胞体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、
90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
122.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的cd10-、cd13-、cd33-、cd45-和cd117-胎盘细胞。在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物的细胞体是包含例如针对分离的cd10-、cd13-、cd33-、cd45-和cd117-胎盘细胞富集的体的细胞体，其中所述体中至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％的细胞是cd10-、cd13-、cd33-、cd45-和cd117-胎盘细胞。在具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述细胞体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不展示这些特性的胎盘细胞分离。
123.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是hla a,b,c
+
、cd45-、cd34-和cd133-，和另外是cd10
+
、cd13
+
、cd38
+
、cd44
+
、cd90
+
、cd105
+
、cd200
+
和/或hla-g-，和/或对cd117是阴性。在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法的细胞体是包含分离的胎盘细胞的细胞体，其中所述体中至少约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或约99％的细胞是分离的胎盘细胞，其是hla a,b,c-、cd45-、cd34-、cd133-，并且其另外对cd10、cd13、cd38、cd44、cd90、cd105、cd200是阳性和/或对cd117和/或hla-g是阴性。在具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不是所述细胞的胎盘细胞分离。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述细胞体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体与不展示这些标志物的胎盘细胞分离。
124.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的胎盘细胞，其通过抗体结合确定为是cd200
+
和cd10
+
，并且通过抗体结合和rt-pcr两者确定为是cd117-。在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘细胞是分离的胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，其是cd10
+
、cd29-、cd54
+
、cd200
+
、hla-g-、mhc i
+
类和p-2-微球蛋白
+
。在另一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物中的分离的胎盘细胞是胎盘细胞，其中至少一种细胞标志物的表达比间充质干细胞(例如骨髓衍生间充质干细胞)高至少两倍。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是非母体来源的。在另一个具体实施方式中，所述细胞体中至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、90％、85％、90％、95％、98％或99％的所述细胞是非母体来源的。
125.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的胎盘细胞，例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，其是cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54/icam
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、cd80-、cd86-、cd103-、
cd104-、cd105
+
、cd106/vcam
+
、cd144/ve-钙粘蛋白
低
、cd184/cxcr4-、β2-微球蛋白
低
、mhc-i
低
、mhc-ii-、hla-g
低
和/或pdl1
低
中的一种或多种。在具体实施方式中，分离的胎盘细胞至少是cd29
+
和cd54
+
。在另一个具体实施方式中，分离的胎盘细胞至少是cd44
+
和cd106
+
。在另一个具体实施方式中，分离的胎盘细胞至少是cd29
+
。
126.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的细胞体(其可用于本文所述的方法和组合物)包含分离的胎盘细胞，并且在所述细胞体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是分离的胎盘细胞，其是cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54/icam
+
、cd62-e-、cd62-l-、cd62-p-、cd80-、cd86-、cd103-、cd104-、cd105
+
、cd106/vcam
+
、cd144/ve-钙粘蛋白
dim
、cd184/cxcr4-、β2-微球蛋白
dim
、hla-i
dim
、hla-ii-、hla-g
dim
和/或pdl1
dim
中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，所述细胞体中至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是cd10
+
、cd29
+
、cd44
+
、cd45-、cd54/icam
+
、cd62-e-、cd62-l-、cd62-p-、cd80-、cd86-、cd103-、cd104-、cd105
+
、cd106/vcam
+
、cd144/ve-钙粘蛋白
dim
、cd184/cxcr4-、β2-微球蛋白
dim
、mhc-i
dim
、mhc-ii-、hla-g
dim
和pdl1
dim
。
127.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的胎盘细胞，其是cd10
+
、cd29
+
、cd34-、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd90
+
、sh2
+
、sh3
+
、sh4
+
、ssea3-、ssea4-、oct-4
+
和acb-p
+
中的一种或多种或全部，其中abc-p是胎盘特异性abc转运蛋白(也称为乳腺癌抗性蛋白(bcrp)和米托蒽醌抗性蛋白(mxr))，其中所述分离的胎盘细胞通过灌注哺乳动物(例如人)胎盘而获得，所述胎盘已经被排出脐带血并灌注以去除残余血液。
128.在任何上述特性的另一个具体实施方式中，细胞标志物(例如分化或免疫原性标志物的簇)的表达通过流式细胞术测定；在另一个具体实施方式中，标志物的表达通过rt-pcr测定。
129.基因谱分析(profiling)证实分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞体(例如用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞和分离的胎盘细胞体)可区别于其他细胞，例如间充质干细胞，如骨髓衍生间充质干细胞。本文所述分离的胎盘细胞可以基于一种或多种基因的表达区别于例如间充质干细胞，该表达在分离的胎盘细胞或某些分离的脐带干细胞中与骨髓衍生间充质干细胞相比显著更高。特别地，当细胞在相同条件下生长时，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法)可以基于一种或多种基因的表达区别于间充质干细胞，该表达在分离的胎盘细胞中显著高于在相等数量的骨髓衍生间充质干细胞中(即高至少两倍)，其中所述一种或多种基因是actg2、adarbl、amigo2、arts-1、b4galt6、bche、c1lorf9、cd200、col4a1、col4a2、cpa4、dmd、dsc3、dsg2、elovl2、f2rl1、flj10781、gata6、gpr126、gprc5b、hla-g、icam1、ier3、igfbp7、il1a、il6、il18、krt18、krt8、lipg、lrap、matn2、mest、nfe2l3、nuakl、pcdh7、pdlim3、pkp2、rtnl、serpinb9、st3gal6、st6galnac5、slc12a8、tcf21、tgfb2、vtn、zc3h12a或上述的任何组合。参见例如美国专利申请公布no.2007/0275362，其公开内容通过引用整体并入本文。在某些具体实施方式中，所述一种或多种基因的所述表达例如通过rt-pcr或如使用u133-a微阵列(affymetrix)的微阵列分析测定。在另一个具体实施方式中，当在培养基中培养多次体翻倍(例如约3至35次体翻倍)时，所述分离的胎盘细胞表达所述一种或多种基因，所述培
养基包含dmem-lg(例如来自gibco)、2％胎牛血清(例如来自hyclone labs.)、l
×
胰岛素-转铁蛋白-硒(its)、l
×
亚油酸-牛血清白蛋白(la-bsa)、10-9
m地塞米松(例如来自sigma)、10-4
m抗坏血酸2-磷酸酯(例如来自sigma)、表皮生长因子10ng/ml(例如来自r&d systems)和血小板衍生生长因子(pdgf-bb)10ng/ml(例如来自r&d systems)。在另一个具体实施方式中，分离的胎盘细胞特异性基因或分离的脐带细胞特异性基因是cd200。
130.这些基因的具体序列可见于到2008年3月为止的genbank登录号nm_001615(actg2)、bc065545(adarb1)、(nm_181847(amigo2)、ay358590(arts-1)、bc074884(b4galt6)、bc008396(bche)、bc020196(c11orf9)、bc031103(cd200)、nm_001845(col4a1)、nm_001846(col4a2)、bc052289(cpa4)、bc094758(dmd)、af293359(dsc3)、nm_001943(dsg2)、af338241(elovl2)、ay336105(f2rl1)、nm_018215(flj10781)、ay416799(gata6)、bc075798(gpr126)、nm_016235(gprc5b)、af340038(icam1)、bc000844(ier3)、bc066339(igfbp7)、bc013142(il1a)、bt019749(il6)、bc007461(il18)、(bc072017)krt18、bc075839(krt8)、bc060825(lipg)、bc065240(lrap)、bc010444(matn2)、bc011908(mest)、bc068455(nfe2l3)、nm_014840(nuak1)、ab006755(pcdh7)、nm_014476(pdlim3)、bc126199(pkp-2)、bc090862(rtn1)、bc002538(serpinb9)、bc023312(st3gal6)、bc001201(st6galnac5)、bc126160或bc065328(slc12a8)、bc025697(tcf21)、bc096235(tgfb2)、bc005046(vtn)和bc005001(zc3h12a)。
131.在某些具体实施方式中，当细胞在相同的条件下生长时，用于产生本文所述受刺激的pdac的所述分离的胎盘细胞以比相同数量的骨髓衍生间充质干细胞可检测地更高水平表达actg2、adarbl、amigo2、arts-1、b4galt6、bche、c11orf9、cd200、col4a1、col4a2、cpa4、dmd、dsc3、dsg2、elovl2、f2rl1、flj10781、gata6、gpr126、gprc5b、hla-g、icam1、ier3、igfbp7、il1a、il6、il18、krt18、krt8、lipg、lrap、matn2、mest、nfe2l3、nuak1、pcdh7、pdlim3、pkp2、rtn1、serpinb9、st3gal6、st6galnac5、slc12a8、tcf21、tgfb2、vtn和zc3h12a中的每一个。
132.在具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞以比相同数量的骨髓衍生间充质干细胞(bm-msc)可检测地更高水平表达cd200和arts1(1型肿瘤坏死因子的氨肽酶调节剂)；arst-1和lrap(白细胞衍生的精氨酸氨肽酶)；il6(白细胞介素-6)和tgfb2(转化生长因子，β2)；il6和krt18(角蛋白18)；ier3(即刻早期应答3)、mest(中胚层特异性转录物同系物)和tgfb2；cd200和ier3；cd200和il6；cd200和krt18；cd200和lrap；cd200和mest；cd200和nfe2l3(核因子(红细胞衍生2)-样3)；或cd200和tgfb2，其中所述骨髓衍生间充质干细胞已经在培养物中经历与所述分离的胎盘细胞已经经历的传代次数相等的传代次数。在其他具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞以比相同数量的骨髓衍生间充质干细胞(bm-msc)可检测地更高水平表达arts-1、cd200、il6和lrap；arts-1、il6、tgfb2、ier3、krt18和mest；cd200、ier3、il6、krt18、lrap、mest、nfe2l3和tgfb2；arts-1、cd200、ier3、il6、krt18、lrap、mest、nfe2l3和tgfb2；或ier3、mest和tgfb2，其中所述骨髓衍生间充质干细胞已经在培养物中经历与所述分离的胎盘细胞已经经历的传代次数相等的传代次数。
133.上文提到的基因的表达可以通过标准技术评估。例如，可以通过常规技术分别选择和构建基于基因序列的探针。基因的表达可以例如在包含针对所述基因中的一种或多种
的探针的微阵列上评估，例如affymetrixhuman genome u133a 2.0阵列，或affymetrixhuman genome u133 plus 2.0(santa clara,california)。即使特定genbank登录号的序列被修改，也可以评估这些基因的表达，因为使用公知标准技术可以容易地产生特异性于改变的序列的探针。
134.这些基因的表达水平可用于确认分离的胎盘细胞体的身份、将细胞体识别为包含至少多个分离的胎盘细胞，等等。分离的胎盘细胞(其身份已被证实)的体可以是克隆的，例如从单个分离的胎盘细胞扩增的分离的胎盘细胞体，或混合的干细胞体，例如单独地包含从多个分离的胎盘细胞扩增的分离的胎盘细胞的细胞体，或包含如本文所述分离的胎盘细胞的细胞体，以及至少一种其他类型的细胞。
135.这些基因的表达水平可以用于选择分离的胎盘细胞体。例如，如果上文列出的基因中的一种或多种的表达在来自细胞体的样品中显著高于在等量间充质干细胞体中，则可以选择该细胞体，如克隆扩增的细胞。这样的选择可以具有来自多个分离的胎盘细胞体的体、来自多个身份未知的细胞体的体，等等。
136.与例如间充质干细胞对照中的所述一种或多种基因的表达水平(例如等量骨髓衍生间充质干细胞中的所述一种或多种基因的表达水平)相比，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞可以基于一种或多种这样的基因的表达水平选择。在一个实施方式中，在包含等量间充质干细胞的样品中的所述一种或多种基因的表达水平用作对照。在另一个实施方式中，用作在某些条件下测试的用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞的对照是代表在所述条件下所述一种或多种基因在间充质干细胞中的表达水平的数值。
137.在某些实施方式中，可用于本文提供的方法的胎盘细胞(例如pdac)在暴露于1至100ng/ml vegf 4至21天后不表达cd34，如通过免疫定位检测的。在具体实施方式中，所述胎盘粘附细胞粘附于组织培养塑料。在另一个具体实施方式中，当在血管生成因子(例如血管内皮生长因子(vegf)、上皮生长因子(egf)、血小板衍生生长因子(pdgf)或碱性成纤维细胞生长因子(bfgf))的存在下培养时，例如在基质如matrigel
tm
上，所述细胞体诱导内皮细胞形成芽或管状结构。
138.在另一个方面，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞、细胞体(例如pdac体)、或其中所述分离的细胞体中至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或98％的细胞是pdac的细胞体，将vegf、hgf、il-8、mcp-3、fgf2、卵泡抑素、g-csf、egf、ena-78、gro、il-6、mcp-1、pdgf-bb、timp-2、upar或半乳糖凝集素-1中的一种或多种或全部，分泌例如到一个或多个细胞在其中生长的培养基中。在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞在低氧条件(例如低于约5％o2)下表达与常氧条件(例如约20％或约21％o2)相比增加水平的cd202b、il-8和/或vegf。
139.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞或包含所述胎盘细胞的细胞体中的任一者可以引起在与所述胎盘衍生粘附细胞接触的内皮细胞体中的芽或管状结构的形成。在具体实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞与人内皮细胞共培养，其形成芽或管状结构，或支持内皮细胞芽的形成，例如当在细胞外基质蛋白(如i型胶原和iv型胶原和/或血管生成因子如血管内皮生长因子(vegf)、上皮生长因子(egf)、血小板衍生生长因子(pdgf)或碱性成纤维细胞生长因子(bfgf))的存在下例
如在基底(如胎盘胶原蛋白或matrigel
tm
)中或上培养至少4天时。在另一个实施方式中，包含本文所述的胎盘衍生粘附细胞的任何细胞体分泌血管生成因子(如血管内皮生长因子(vegf)、肝细胞生长因子(hgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)或白细胞介素-8(il-8))，并且由此当在细胞外基质蛋白(如i型和iv型胶原蛋白)存在下例如在基底(如胎盘胶原蛋白或matrigel
tm
)中或上培养时，可以诱导人内皮细胞形成芽或管状结构。
140.在另一个实施方式中，包含胎盘衍生粘附细胞(pdac)的任何上述细胞体分泌血管生成因子。在具体实施方式中，细胞体分泌血管内皮生长因子(vegf)、肝细胞生长因子(hgf)、血小板源生长因子(pdgf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和/或白细胞介素-8(il-8)。在其他具体实施方式中，包含pdac的细胞体分泌一种或多种血管生成因子，并且由此在体外伤口愈合试验中诱导人内皮细胞迁移。在其他具体实施方式中，包含胎盘衍生粘附细胞的细胞体诱导人内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞或成肌细胞的成熟、分化或增殖。
141.本文所述分离的胎盘细胞在原代培养物或在包含例如dmem-lg(gibco)、2％胎牛血清(fcs)(hyclone laboratories)、1
×
胰岛素-转铁蛋白-硒(its)、1
×
亚麻酸-牛血清白蛋白(la-bsa)、10-9
m地塞米松(sigma)、10-4
m抗坏血酸2-磷酸酯(sigma)、表皮生长因子(egf)10ng/ml(r&d systems)、血小板衍生生长因子(pdgf-bb)10ng/ml(r&d systems)和100u青霉素/1000u链霉素的培养基中的增殖期间显示以上特性(例如细胞表面标志物和/或基因表达谱的组合)。
142.在用于产生本文所述受刺激的pdac的任何胎盘细胞的某些实施方式中，细胞是人的。在用于产生本文所述受刺激的pdac的任何胎盘细胞的某些实施方式中，细胞标志物特性或基因表达特性是人标志物或人基因。
143.在用于产生本文所述受刺激的pdac的所述分离的胎盘细胞或细胞体的另一个具体实施方式中，所述细胞或体已经被扩增，例如传代至少、约、或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次或更多，或增殖至少、约、或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50次体翻倍。在用于产生本文所述受刺激的pdac的所述分离的胎盘细胞或细胞体的另一个具体实施方式中，所述细胞或体是原代分离物。在本文公开的分离的胎盘细胞或包含分离的胎盘细胞的细胞体的另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞是婴儿来源的(即具有胎儿基因型)。
144.在某些实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的所述分离的胎盘细胞在生长培养基(即配置成促进增殖的培养基)中培养的期间(例如在生长培养基中增殖的期间)不分化。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞不需要饲养层以增殖。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞在不存在饲养层的培养基中不分化，仅仅是因为缺乏饲养细胞层。
145.在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)是分离的胎盘细胞，其中多个所述分离的胎盘细胞对醛脱氢酶(aldh)是阳性的，如通过醛脱氢酶活性试验评估。这样的试验是本领域已知的(参见例如bostian
和betts，biochem.j.,173,787,(1978))。在具体实施方式中，所述aldh试验使用(aldagen,inc.,ashland,oregon)作为醛脱氢酶活性的标志物。在具体实施方式中，所述多个是在所述细胞体中的约3％至约25％的细胞之间。在另一个实施方式中，本文提供了分离的脐带细胞(例如分离的多能脐带细胞)体，其中多个所述分离的脐带细胞对醛脱氢酶是阳性的，如通过使用作为醛脱氢酶活性的指示的醛脱氢酶活性试验评估的。在具体实施方式中，所述多个是在所述细胞体中的约3％至约25％的细胞之间。在另一个实施方式中，所述分离的胎盘细胞体或分离的脐带细胞体显示出比具有约相同细胞数量并且在相同条件下培养的骨髓衍生间充质干细胞体高至少三倍或至少五倍的aldh活性。
146.在包含用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞的任何细胞体的某些实施方式中，所述细胞体中的胎盘细胞基本上不含具有母体基因型的细胞；例如所述体中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的胎盘细胞具有胎儿基因型。在包含本文所述分离的胎盘细胞的任何细胞体的某些其他实施方式中，包含所述胎盘细胞的细胞体基本上不含具有母体基因型的细胞；例如所述体中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的细胞具有胎儿基因型。
147.在用于产生本文所述受刺激的pdac的任何上述分离的胎盘细胞或细胞体的具体实施方式中，细胞或所述体中至少约95％或约99％的细胞的核型是正常的。在任何上述胎盘细胞或细胞体的另一个具体实施方式中，细胞或细胞体中的细胞是非母体来源的。
148.携带任何上述标志物组合的用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体可以以任何比率组合。任何两种或更多种上述分离的胎盘细胞体可以组合形成分离的胎盘细胞体。例如，分离的胎盘细胞体可以包含由上述标志物组合之一定义的分离的胎盘细胞第一体，和由上述标志物组合中的另一个定义的分离的胎盘细胞第二体，其中所述第一和第二体以约1:99、2:98、3:97、4:96、5:95、10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2或约99:1的比率组合。以类似的方式，可以组合上述分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体的任何三种、四种、五种或更多种。
149.用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞(其可用于本文所述的方法和组合物)可以例如通过采用或不采用酶消化的胎盘组织的破坏(参见第5.3.3节)或灌注(参见第5.3.4节)获得。例如，分离的胎盘细胞体可以根据包括以下的方法生产：灌注已排出脐带血的哺乳动物胎盘并灌注以去除剩余的血液；用灌注溶液灌注所述胎盘；并且收集所述灌注溶液，其中灌注后的所述灌注溶液包含含有分离的胎盘细胞的胎盘细胞体；并从所述细胞体中分离多个所述分离的胎盘细胞。在具体实施方式中，灌注溶液通过脐静脉和脐动脉两者，并在其从胎盘渗出后收集。在另一个具体实施方式中，灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或通过脐动脉并从脐静脉收集。
150.在各种实施方式中，从胎盘灌注获得的细胞体含有的用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞是所述胎盘细胞体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、
99％或至少99.5％。在另一个具体实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘细胞包含胎儿和母体细胞。在另一个具体实施方式中，通过灌注收集的分离的胎盘细胞是至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％的胎儿细胞。
151.在另一个具体实施方式中，本文提供了包含通过灌注收集的用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞体的组合物，其中所述组合物包含用于收集分离的胎盘细胞的灌注溶液的至少一部分。
152.用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞的分离体可以通过用组织破碎酶消化胎盘组织以获得包含细胞的胎盘细胞体，并从所述胎盘细胞的剩余部分分离或基本上分离多个胎盘细胞而产生。胎盘的全部或任何部分可以被消化以获得本文所述分离的胎盘细胞。在具体实施方式中，例如，所述胎盘组织可以是整个胎盘、羊膜、绒毛膜、羊膜和绒毛膜的组合、或任何前述的组合。在其他具体实施方式中，组织破坏酶是胰蛋白酶或胶原酶。在各种实施方式中，从消化胎盘获得的细胞体内含有的分离的胎盘细胞是所述胎盘细胞体的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或至少99.5％。
153.上述分离的胎盘细胞体以及用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞体通常可以包含约、至少、或不超过1
×
102、5
×
102、1
×
103、5
×
103、1
×
104、5
×
104、1
×
105、5
×
105、1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108、1
×
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
个或更多个分离的胎盘细胞。可用于本文所述方法的分离的胎盘细胞体包含至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的存活的分离的胎盘细胞，例如如例如通过台盼蓝排除法测定的。
154.5.2.3在培养物中的生长
155.本文第5.2节中所述分离的胎盘细胞(例如用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞)的生长与任何哺乳动物细胞一样，部分取决于选择用于生长的特定培养基。在最佳条件下，分离的胎盘细胞通常在约1天中数量翻倍。在培养期间，本文所述分离的胎盘细胞粘附于培养物中的基底，例如组织培养容器(例如组织培养皿塑料、纤连蛋白涂敷的塑料等)表面并形成单层。
156.当在合适的条件下培养时，包含用于产生本文所述受刺激的padc的分离的胎盘细胞的胎盘细胞体可以形成胚状体样体，即三维细胞簇在粘附细胞层顶部上生长。胚状体样体内的细胞可以表达与极早期干细胞相关的标记物，例如oct-4、nanog、ssea3和ssea4。胚状体样体内的细胞通常不像本文所述分离的胎盘细胞那样粘附于培养物基底，但在培养期间倾向于保持附着于粘附细胞。胚状体样体细胞由于生存力而依赖于粘附的分离的胎盘细胞，因为胚状体样体在不存在粘附的分离的胎盘细胞的情况下不形成。因此，粘附的分离的胎盘细胞促进在包含粘附的分离的胎盘细胞的胎盘细胞体中生长一个或多个胚状体样体。不希望被理论所束缚，胚状体样体细胞被认为在粘附的分离的胎盘细胞上生长，非常像胚胎干细胞在细胞的饲养层上生长。
157.5.3获得分离的胎盘细胞的方法
158.5.3.1干细胞收集组合物
159.本文还提供收集和分离胎盘细胞的方法，例如在上文第5.2.2节中描述的分离的胎盘细胞，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞。通常，这样的细胞使用生理上可接受的溶液(例如细胞收集组合物)从哺乳动物胎盘获得。示例性的细胞收集组合
物在相关的美国专利申请公布no.2007/0190042，标题为"improved medium for collecting placental stem cells and preserving organs"中详细描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
160.细胞收集组合物可以包含适合于收集和/或培养细胞(例如本文所述分离的胎盘细胞)的任何生理上可接受的溶液，例如盐水溶液(例如磷酸盐缓冲盐水、kreb溶液、改良kreb溶液、eagle溶液、0.9％nacl等)、培养基(例如dmem、h.dmem等)等。
161.细胞收集组合物可以包含倾向于从收集时到培养时保存分离的胎盘细胞的一种或多种组分，即防止分离的胎盘细胞死亡，或延迟分离的胎盘细胞死亡、减少细胞体中死亡的分离的胎盘细胞的数量等。这样的组分可以是例如凋亡抑制剂(例如半胱天冬酶抑制剂或jnk抑制剂)、血管舒张药(例如硫酸镁、降压药、心房利钠肽(anp)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、消炎痛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)、坏死抑制剂(例如2-(1h-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐、或)、tnf-α抑制剂和/或携氧全氟化碳(例如全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
162.细胞收集组合物可以包含一种或多种组织降解酶，例如金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、rna酶或dna酶等。这样的酶包括但不限于胶原酶(例如胶原酶i、ii、iii或iv、来自溶组织梭菌(clostridium histolyticum)的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、liberase、透明质酸酶等。
163.细胞收集组合物可以包含杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施方式中，抗生素是大环内酯(例如妥布霉素)、头孢菌素(例如头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢罗齐、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如青霉素v)或喹诺酮(例如氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在特定实施方式中，抗生素是对革兰氏阳性菌(+)和/或革兰氏阴性菌(-)(例如绿脓假单胞菌、金黄葡萄球菌等)有活性的。在一个实施方式中，抗生素是庆大霉素，例如在培养基中约0.005％至约0.01％(w/v)。
164.细胞收集组合物也可以包含以下化合物中的一种或多种：腺苷(约1mm至约50mm)；d-葡萄糖(约20mm至约100mm)；镁离子(约1mm至约50mm)；在一个实施方式中，以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在的分子量大于20,000道尔顿的大分子(例如以约25g/1至约100g/1，或约40g/1至约60g/1存在的合成或天然存在胶体、多糖，如葡聚糖或聚乙二醇)；抗氧化剂(例如以约25μμ至约100μμ存在的丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素c或维生素e)；还原剂(例如以约0.1mm至约5mm存在的n-乙酰半胱氨酸)；防止钙进入细胞的试剂(例如以约2μμ至约25μμ存在的维拉帕米)；(例如约0.05g/l至约0.2g/l)；在一个实施方式中，以足以帮助防止残留血液凝结的量存在的抗凝剂(例如，以约1000单位/1至约100,000单位/1的浓度存在的肝素或水蛭素)；或含有阿米洛利的化合物(例如以约1.0μμ至约5μμ存在的阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利)。
165.5.3.2胎盘的收集和处理
166.通常，人胎盘在出生后在其排出后不久被回收。在优选的实施方式中，在知情同意之后并且在获得患者的完整病史并将其与胎盘相关联之后，从患者回收胎盘。优选地，病史
在分娩之后继续。这样的病史可用于协调胎盘或从其收集的分离的胎盘细胞的后续使用。例如，鉴于病史，分离的人胎盘细胞可用于与胎盘相关的婴儿，或婴儿的父母、兄弟妹或其他亲属的个性化医疗。
167.在分离的胎盘细胞的回收之前，脐带血和胎盘血优选地被除去。在某些实施方式中，分娩之后，胎盘中的脐带血被回收。胎盘可以进行传统脐带血回收过程。通常，使用针或套管借助于重力从胎盘放血(参见例如anderson，美国专利no.5,372,581；hessel等，美国专利no.5,415,665)。通常将针或套管置于脐静脉中，并轻轻地按摩胎盘以帮助从胎盘排出脐带血。这样的脐带血回收可以商业地进行，例如lifebank usa，cedar knolls，n.j.。优选地，胎盘被重力排血，而没有进一步操作，从而最小化脐带血回收期间的组织破坏。
168.通常，将胎盘从分娩或生育室运送到另一个位置，例如实验室，以通过例如灌注或组织解离回收脐带血和收集干细胞。胎盘优选地在无菌、绝热的运送装置中运送(胎盘温度维持在20-28℃)，例如通过将胎盘与夹紧的近端脐带放置在无菌拉链锁塑料袋中，然后将其置于绝热容器中。在另一个实施方式中，胎盘在基本上如未决美国专利申请no.7,147,626中所描述的脐带血采集套件中运送，其公开内容通过引用并入本文。优选地，胎盘在分娩后四到二十四小时递送到实验室。在某些实施方式中，在脐带血回收之前，将近端脐带夹紧，优选地插入胎盘4-5cm(厘米)中。在其他实施方式中，在脐带血回收之后但在进一步处理胎盘之前，将近端脐带夹紧。
169.在细胞收集之前，胎盘可以在无菌条件下并在室温或在5℃至25℃的温度下储存。在灌注胎盘以去除任何残留脐带血之前，胎盘可以储存四至二十四小时、至多四十八小时、或长于四十八小时的时间。在一个实施方式中，胎盘在排出后约0小时至约两小时之间收获。胎盘优选在5℃至25℃的温度下储存在抗凝剂溶液中。合适的抗凝剂溶液是本领域公知的。例如，可以使用肝素或华法林钠的溶液。在优选的实施方式中，抗凝剂溶液包含肝素溶液(例如1:1000溶液中为1％w/w)。在收集胎盘细胞之前，经放血的胎盘优选地储存不超过36小时。
170.哺乳动物胎盘或其一部分，一旦被如上所述一般地收集和制备，可以以任何本领域已知方式进行处理，例如可以灌注或破碎，例如用一种或多种组织破碎酶消化，以获得分离的胎盘细胞。
171.5.3.3胎盘组织的物理破碎和酶消化
172.在一个实施方式中，干细胞通过物理破碎器官的部分或全部而从哺乳动物胎盘收集。例如，胎盘或其一部分可以例如被破碎、剪切、切碎、切块、剁碎、浸软等。组织然后可以被培养以获得分离的胎盘细胞体。通常，使用例如培养基、盐水溶液或干细胞收集组合物(参见第5.5.1节和下文)破碎胎盘组织。
173.在物理破碎和/或酶消化和干细胞回收之前，胎盘可以被切成组件。分离的胎盘细胞可以从羊膜、绒毛膜、脐带、胎盘子叶或其任何组合的全部或部分(包括从整个胎盘)获得。优选地，分离的胎盘细胞从包含羊膜和绒毛膜的胎盘组织获得。通常，分离的胎盘细胞可以通过破碎小块胎盘组织(例如体积为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或约1000立方毫米的胎盘组织块)获得。可以使用任何物理破碎方法，前提是破碎方法使所述器官中的多个、更优选地大部分、以及更优选至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的细胞是有活力的，如通过例如台盼蓝
排除法测定的。
174.分离的粘附胎盘细胞通常可以在排出后约前三天内的任何时间，但优选在排出后约8小时至约18小时之间从胎盘或其部分收集。
175.在具体实施方式中，破碎的组织在适合于分离的胎盘细胞的增殖的组织培养基中培养(参见例如下文第5.6节，描述胎盘细胞(例如pdac)的培养)。
176.在另一个具体实施方式中，分离的胎盘细胞通过胎盘组织的物理破碎收集，其中物理破碎包括酶消化，其可以通过使用一种或多种组织消化酶完成。胎盘或其一部分也可以用一种或多种酶进行物理破碎和消化，然后将所得材料浸入或混合至细胞收集组合物中。
177.优选的细胞收集组合物包含一种或多种组织破碎酶。可以用于破碎胎盘组织的酶包括木瓜蛋白酶，脱氧核糖核酸酶，丝氨酸蛋白酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胶原酶、分散酶或弹性蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可被血清中的α2微球蛋白抑制，并且因此用于消化的培养基通常不含血清。edta和dna酶常用于酶消化过程以提高细胞回收的效率。消化物优选被稀释以避免将细胞捕获在粘性消化物内。
178.可以使用组织消化酶的任何组合。使用胰蛋白酶进行消化的典型浓度包括0.1％至约2％胰蛋白酶，例如约0.25％胰蛋白酶。蛋白酶可以组合使用，即两种或更多种蛋白酶在相同的消化反应中，或可以顺序使用，以释放胎盘细胞，例如胎盘干细胞和胎盘多能细胞。例如，在一个实施方式中，胎盘或其部分首先在37℃下用适合量的胶原酶i以约1至约2mg/ml消化例如30分钟，然后用胰蛋白酶以约0.25％浓度消化例如10分钟。丝氨酸蛋白酶优选在其他酶使用之后相继使用。
179.在另一个实施方式中，组织可以通过将螯合剂(例如乙二醇双(2-氨基乙基醚)-n,n,n'n'-四乙酸(egta)或乙二胺四乙酸(edta))添加至包含干细胞的干细胞收集组合物或其中组织在用干细胞收集组合物分离干细胞之前被破碎和/或消化的溶液中而被进一步破碎。
180.消化后，将消化物例如用培养基洗涤三次，并将洗涤的细胞接种到培养瓶中。然后通过差速粘附分离细胞，并表征例如生存力、细胞表面标志物、分化等。
181.应认识到，在整个胎盘或包含胎儿和母体细胞两者的胎盘的部分的情况下(例如，在包含绒毛膜或子叶的胎盘的部分的情况下)，分离的胎盘细胞可以包含源自胎儿和母体来源两者的胎盘细胞的混合。在不包含或包含可忽略数量的母体细胞的胎盘的一部分(例如羊膜)的情况下，从其分离的胎盘细胞将几乎排他地包含胎儿胎盘细胞(即具有胎儿基因型的胎盘细胞)。
182.胎盘细胞(例如上文第5.2.2节中描述的胎盘细胞)可以通过差速胰蛋白酶化(参见下文第5.3.5节)从破碎的胎盘组织分离，然后在一个或多个新的培养容器中在新鲜的增殖培养基中培养，任选地随后进行第二差速胰蛋白酶化步骤。
183.5.3.4胎盘灌注
184.胎盘细胞(例如上文第5.2.2节中描述的胎盘细胞，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘细胞)也可以通过哺乳动物胎盘的灌注获得。灌注哺乳动物胎盘以获得胎盘细胞的方法公开于例如hariri的美国专利no.7,045,148和7,255,729，美国专利申请公布no.2007/0275362和2007/0190042中，其中每一个的公开内容通过引用整体并入本文。
185.胎盘细胞可以使用例如细胞收集组合物作为灌注溶液，通过灌注收集，例如经过胎盘血管。在一个实施方式中，哺乳动物胎盘通过使灌注溶液经过脐动脉和脐静脉中的任一者或两者而灌注。灌注溶液流经胎盘可以使用例如重力流入胎盘完成。优选地，使用泵(例如蠕动泵)迫使灌注溶液经过胎盘。脐静脉可以例如用连接到无菌连接装置(例如无菌管)的套管(例如或塑料套管)进行插管。无菌连接装置连接到灌注管汇。
186.在准备灌注时，胎盘优选地以使脐动脉和脐静脉位于胎盘的最高点的方式定向(例如悬浮)。胎盘可以通过使灌注流体通过胎盘脉管系统和周围组织灌注。胎盘还可以通过使灌注流体通入脐静脉并从脐动脉采集而灌注，或使灌注流体通入脐动脉并从脐静脉采集而灌注。
187.在一个实施方式中，例如，脐动脉和脐静脉同时连接例如到移液管，其通过柔性连接器连接到灌注溶液的储存器。灌注溶液通入脐静脉和动脉。灌注溶液从血管壁渗出和/或穿过血管壁进入胎盘的周围组织，并从怀孕期间附着于母体子宫的胎盘表面收集到合适的开放血管中。灌注溶液也可以被引入经过脐带开口，并被允许从与母体子宫壁交界的胎盘壁中的开口流出或渗出。通过这种方法(其可被称为"平底锅"方法)收集的胎盘细胞通常是胎儿和母体细胞的混合物。
188.在另一个实施方式中，灌注溶液通过脐静脉并从脐动脉采集，或通过脐动脉并从脐静脉采集。通过这种方法(其可被称为"闭路"方法)收集的胎盘细胞通常几乎排他地是胎儿。
189.应认识到，使用平底锅方法进行灌注，即由此在灌注液已经从胎盘的母体侧渗出之后收集灌注液，导致胎儿和母体细胞的混合。因此，通过这种方法收集的细胞可以包含胎儿和母体来源两者的胎盘细胞(例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞)的混合体。相反，在闭路方法中唯一通过胎盘脉管系统进行灌注，由此使灌注流通过一个或两个胎盘血管并且唯一地通过剩余的一个或多个血管进行收集，导致收集几乎排他地是胎儿来源的胎盘细胞的体。
190.在一个实施方式中，闭路灌注方法可以如下进行。在出生后约48小时内获得分娩后胎盘。脐带被夹紧并在夹具上方切割。脐带可以被丢弃，或可以被处理以回收例如脐带干细胞，和/或处理脐带膜用于生物材料的制备。羊膜可以在灌注期间被保留，或可以与绒毛膜分离，例如使用手指钝解剖。如果羊膜在灌注之前与绒毛膜分离，则其可以被例如丢弃或处理，例如以通过酶消化获得干细胞，或以产生例如羊膜生物材料，例如在美国申请公布no.2004/0048796中所述的生物材料，其公开内容通过引用整体并入本文。在例如使用无菌纱布清洁胎盘的所有可见血块和残余血液之后，例如通过部分切割脐带膜以暴露脐带的横截面而暴露脐带血管。识别血管并打开，例如通过使闭合的鳄鱼夹推进经过每个血管的切割端。然后将装置(例如连接到灌注装置或蠕动泵的塑料管)插入每个胎盘动脉中。泵可以是任何适用于该目的的泵，例如蠕动泵。然后将连接到无菌收集储存器(例如血液袋，如250ml收集袋)的塑料管插入到胎盘静脉中。或者，将连接到泵的管插入胎盘静脉，并将连接到一个或多个收集储存器的管插入胎盘动脉之一或两者中。然后用一定体积的灌注溶液(例如约750ml的灌注溶液)灌注胎盘。然后收集灌注液中的细胞，例如通过离心。在某些实施方式中，用灌注溶液(例如100-300ml灌注溶液)灌注胎盘以在灌注之前去除残余血液以收集胎盘细胞，例如胎盘干细胞和/或胎盘多能细胞。在另一个实施方式中，在灌注以收集
胎盘细胞之前不用灌注溶液灌注胎盘以去除残余血液。
191.在一个实施方式中，在灌注期间将近端脐带夹紧，并且更优选地，在脐带插入胎盘中4-5cm(厘米)内夹紧。
192.在放血过程期间从哺乳动物胎盘第一批收集的灌注流体通常被脐血和/或胎盘血的残余血红细胞着。随着灌注的进行，灌注流体变得更无，并且残留的脐血细胞被洗出胎盘。通常30至100ml(毫升)的灌注流体足以使胎盘初步放血，但根据观察的结果可以使用更多或更少的灌注流体。
193.用于分离胎盘细胞的灌注流体的体积可以根据待收集的细胞的数量、胎盘的大小、从单个胎盘待进行的收集的数量等而变化。在各种实施方式中，灌注流体的体积可以是50ml至5000ml、50ml至4000ml、50ml至3000ml、100ml至2000ml、250ml至2000ml、500ml至2000ml或750ml至2000ml。通常，放血后用700-800ml灌注流体灌注胎盘。
194.胎盘可以在数小时或数天的时间内灌注多次。在胎盘待被多次灌注的情况下，可将其在无菌条件下维持或培养在容器或其他合适的导管中，并用细胞收集组合物，或者含有或不含抗凝剂(例如肝素、华法林钠、香豆素、双羟基香豆素)，和/或含有或不含抗微生物剂(例如β-巯基乙醇(0.1mm)；抗生素(例如链霉素(例如40-100μg/ml)、青霉素(例如40u/ml)、两性霉素b(例如0.5μg/ml))的标准灌注溶液(例如，普通生理盐水，如磷酸盐缓冲盐水("pbs"))灌注。在一个实施方式中，维持或培养分离的胎盘一段时间而不收集灌注液，使得在灌注和收集灌注液之前维持或培养胎盘1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时，或2天或3天或更多天。可以将灌注的胎盘维持一个或多个额外的时间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或更多小时，并用例如700-800ml灌注流体灌注第二次。胎盘可以被灌注1、2、3、4、5或更多次，例如每1、2、3、4、5或6小时灌注一次。在优选的实施方式中，重复胎盘的灌注和灌注溶液(例如细胞收集组合物)的收集直至回收的有核细胞的数量降至100个细胞/ml以下。不同时间点的灌注液可以被进一步单独处理以回收时间依赖性细胞(例如干细胞)体。来自不同时间点的灌注液也可以被合并。在优选的实施方式中，胎盘细胞在排出后约8小时和约18小时之间的一个或多个时间收集。
195.灌注优选地导致收集比可从未用所述溶液灌注，且未以其他方式处理以获得胎盘细胞(例如，通过组织破碎，例如酶消化)的哺乳动物胎盘获得的数量显著更多的胎盘细胞。在这个上下文中，"显著更多"意味着至少10％更多。灌注产生比例如可从在其中胎盘或其部分已经被培养的培养基分离的胎盘细胞的数量显著更多的胎盘细胞。
196.胎盘细胞可以通过用包含一种或多种蛋白酶或其他组织破碎酶的溶液灌注而从胎盘分离。在具体实施方式中，使胎盘或其部分(例如羊膜、羊膜和绒毛膜、胎盘小叶或子叶、脐带或任何前述的组合)达到25-37℃，并与一种或多种破碎酶在200ml的培养基中孵育30分钟。收集来自灌注液的细胞，使其达到4℃，并用包含5mm edta、2mm二硫苏糖醇和2mmβ-巯基乙醇的冷抑制剂混合物洗涤。几分钟后用冷(例如4℃)干细胞收集组合物洗涤胎盘细胞。
197.5.3.5胎盘细胞的分离、分选和表征
198.分离的胎盘细胞，例如上文在第5.2.2节中描述的细胞，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞，无论通过灌注或物理破碎(例如通过酶消化)获得，最初可
以通过ficoll梯度离心从其他细胞中纯化(例如与其分离)。这样的离心可以遵循离心速度的任何标准方案等。在一个实施方式中，例如，通过在室温下以5000
×
g离心15分钟从灌注液中回收从胎盘收集的细胞，这将细胞与例如污染性碎片和血小板分离。在另一个实施方式中，将胎盘灌注液浓缩至约200ml，轻轻地分层在ficoll上，并在22℃下以约1100
×
g离心20分钟，收集细胞的低密度界面层用于进一步处理。
199.将细胞团粒重新悬浮于新鲜的干细胞收集组合物中或适合于细胞维持(例如干细胞维持)的培养基中，例如含有2u/ml肝素和2mm edta的imdm无血清培养基(gibcobrl，ny)。可以根据制造商推荐的程序，例如使用lymphoprep(nycomed pharma，oslo，norway)，分离总单核细胞部分。
200.通过灌注或消化获得的胎盘细胞可以例如进一步或初始地通过使用例如0.05％胰蛋白酶和0.2％edta(sigma,st.louis mo)的溶液的差速胰蛋白酶化分离。差速胰蛋白酶化是可能的，因为分离的胎盘细胞(其是组织培养塑料粘附的)通常在约五分钟内从塑料表面脱离，而其他粘附体通常需要超过20-30分钟的孵育。可以在胰蛋白酶化和使用例如胰蛋白酶中和溶液(tns，gambrex)的胰蛋白酶中和后收获脱离的胎盘细胞。在粘附细胞的分离的一个实施方式中，将例如约5-10
×
106个细胞的等分部分置于多个t-75瓶的每一个中，优选纤连蛋白涂覆的t75瓶。在这样的实施方式中，细胞可以用市售间充质干细胞生长培养基(mscgm)(cambrex)培养，并置于组织培养孵育箱中(37℃，5％co2)。10至15天后，非粘附细胞通过用pbs洗涤从瓶中去除。然后用mscgm代替pbs。优选地每天检查瓶中各种粘附细胞类型的存在，特别是识别和扩增成纤维细胞簇。
201.从哺乳动物胎盘收集的细胞数量和类型可以被监测，例如通过使用标准细胞检测技术如流式细胞术、细胞分选、免疫细胞化学(例如用组织特异性或细胞标志物特异性抗体染)、荧光激活细胞分选(facs)、磁激活细胞分选(macs)测量形态和细胞表面标志物的变化，通过使用光或共焦显微镜检查细胞形态，和/或通过使用本领域众所周知的技术(如pcr和基因表达谱分析)测量基因表达的变化。也可以使用这些技术识别对一种或多种特定标志物呈阳性的细胞。例如，使用针对cd34的抗体，可以使用上述技术确定细胞是否包含可检测量的cd34；如果是，则细胞是cd34
+
。同样，如果细胞产生足够的oct-4rna以可通过rt-pcr检测到，或比成体细胞显著更多的oct-4rna，则细胞是oct-4
+
。针对细胞表面标志物的抗体(例如cd标志物，如cd34)和干细胞特异性基因(如oct-4)的序列是本领域公知的。
202.胎盘细胞，特别是已经通过ficoll分离、差速粘附或两者的组合分离的细胞，可以使用荧光激活细胞分选仪(facs)分选。荧光激活细胞分选(facs)是众所周知的基于颗粒的荧光特性用于分离颗粒(包括细胞)的方法(kamarch,1987,methods enzymol,151:150-165)。个体颗粒中的荧光部分的激光激发导致小的电荷，允许从混合物中电磁分离正颗粒和负颗粒。在一个实施方式中，细胞表面标志物特异性抗体或配体被不同的荧光标记标记。细胞通过细胞分选器进行处理，允许基于细胞结合所用抗体的能力分离细胞。facs分选的颗粒可以直接沉积到96孔或384孔板的个体孔中以促进分离和克隆。
203.在一个分选方案中，基于标志物cd34、cd38、cd44、cd45、cd73、cd105、oct-4和/或hla-g中的一种或多种的表达分选来自胎盘的细胞，例如pdac。这可以结合基于细胞在培养物中的粘附特性选择这样的细胞的程序完成。例如，组织培养塑料粘附选择可以在基于标志物表达的分选之前或之后完成。在一个实施方式中，例如，细胞首先根据它们的cd34表达
进行分选；cd34-细胞被保留，并且另外是cd200
+
和hla-g-的cd34-细胞与所有其他cd34-细胞分离。在另一个实施方式中，来自胎盘的细胞基于其标志物cd200和/或hla-g的表达被分选；例如，展示cd200并缺乏hla-g的细胞被分离用作进一步的使用。在具体实施方式中，表达例如cd200和/或缺乏例如hla-g的细胞可以基于它们的cd73和/或cd105表达，或由抗体sh2、sh3或sh4识别的表位，或cd34、cd38或cd45表达的缺乏而被进一步分选。例如，在另一个实施方式中，胎盘细胞通过其cd200、hla-g、cd73、cd105、cd34、cd38和cd45的表达或缺乏被分选，以及作为cd200
+
、hla-g-、cd73
+
、cd105
+
、cd34-、cd38-和cd45-的胎盘细胞与其他胎盘细胞分离用作进一步的使用。
204.在分选的胎盘细胞的任何上述实施方式的具体实施方式中，在分选后剩余的细胞体中至少50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞是所述分离的胎盘细胞。胎盘细胞可以通过上面第5.2.2节中描述的任何标志物中的一个或多个进行分选。
205.在具体实施方式中，例如，(1)粘附于组织培养塑料，和(2)cd10
+
、cd34-和cd105
+
的胎盘细胞被从其他胎盘细胞分选(即分离)。在另一个具体实施方式中，(1)粘附于组织培养塑料，和(2)cd10
+
、cd34-、cd105
+
和cd200
+
的胎盘细胞被从其他胎盘细胞分选(即分离)。在另一个具体实施方式中，(1)粘附于组织培养塑料，和(2)cd10
+
、cd34-、cd45-、cd90
+
、cd105
+
和cd200
+
的胎盘细胞被从其他胎盘细胞分选(即分离)。
206.关于基于核苷酸序列的胎盘细胞检测，本文所列标志物的序列容易地在公众可获得的数据库(例如genbank或embl)获得。
207.关于抗体介导的胎盘细胞(例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞)的检测和分选，对特定标志物特异性的任何抗体可以与任何适用于细胞检测和分选(例如荧光激活细胞分选)的荧光团或其他标记组合使用。针对特定标志物的抗体/荧光团组合包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)缀合的抗hla-g(可从serotec,raleigh,north carolina获得)、cd10(可从bd immunocytometry systems,san jose,california获得)、cd44(可从bd biosciences pharmingen,san jose,california获得)和cd105(可从r&d systems inc.,minneapolis,minnesota获得)单克隆抗体；藻红蛋白(pe)缀合的抗cd44、cd200、cd117和cd13单克隆抗体(bd biosciences pharmingen)；藻红蛋白-cy7(pe cy7)缀合的抗cd33和cd10单克隆抗体(bd biosciences pharmingen)；别藻蓝蛋白(apc)缀合的链霉抗生物素蛋白和抗cd38单克隆抗体(bd biosciences pharmingen)；和生物素化cd90(bd biosciences pharmingen)。可使用的其他抗体包括但不限于cd133-apc(miltenyi)、kdr-生物素(cd309，abcam)、细胞角蛋白k-fitc(sigma或dako)、hla abc-fitc(bd)、hla dr、dq、dp-pe(bd)、β-2-微球蛋白-pe(bd)、cd80-pe(bd)和cd86-apc(bd)。可以使用的其他抗体/标记组合包括但不限于cd45-percp(橙皮苷(peridin)叶绿素蛋白)；cd44-pe；cd19-pe；cd10-f(荧光素)；hla-g-f和7-氨基-放线菌素-d(7-aad)；hla-abc-f等。这个列表不是穷举性的，并且来自其他供应商的其他抗体也是市售的。
208.本文提供的分离的胎盘细胞可使用例如藻红蛋白-cy7(pe cy7)缀合的链霉抗生物素蛋白和生物素缀合的抗cd117或cd133单克隆抗体对cd117或cd133进行分析；然而，使用这个系统，因为相对高的背景，细胞可能分别对cd117或cd133呈阳性。
209.分离的胎盘细胞可以用针对单个标志物的抗体进行标记并检测和/分选。胎盘细胞也可以同时用针对不同标志物的多种抗体进行标记。
210.在另一个实施方式中，可以使用磁珠分离细胞。可以使用磁激活细胞分选(macs)技术分选细胞，所述技术是基于颗粒结合磁珠(0.5-100μm直径)的能力分离颗粒的方法。可以在磁性微球上进行各种有用的修饰，包括共价添加特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠与细胞混合以允许结合。然后将细胞通过磁场以分离具有特定细胞表面标志物的细胞。在一个实施方式中，然后可以将这些细胞分离并与偶合至针对另外的细胞表面标志物的抗体的磁珠再混合。细胞再次经过磁场，分离结合抗体两者的细胞。然后可以将这样的细胞稀释到单独的皿中，例如用于克隆分离的微量滴定盘。
211.分离的胎盘细胞也可以基于细胞形态和生长特性表征和/或分选。例如，分离的胎盘细胞可以被表征为具有例如在培养物中的成纤维细胞样外观，和/或基于例如培养物中的成纤维细胞样外观进行选择。分离的胎盘细胞也可以被表征为具有其形成胚状体样体的能力，和/或基于其形成胚状体样体的能力进行选择。在一个实施方式中，例如，形状为成纤维细胞样的、表达cd73和cd105的，并在培养物中产生一个或多个胚状体样体的胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。在另一个实施方式中，在培养物中产生一个或多个胚状体样体的oct-4
+
胎盘细胞与其他胎盘细胞分离。
212.在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞可以通过集落形成单位试验识别和表征。集落形成单位试验是本领域公知的，例如mesencult
tm
培养基(stem cell technologies,inc.,vancouver british columbia)。
213.分离的胎盘细胞可以使用本领域已知的标准技术评估生存力、增殖潜力和寿命，例如台盼蓝排除试验、荧光素二乙酸酯摄取试验、碘化丙啶摄取试验(以评估生存力)；以及胸苷摄取试验、mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)细胞增殖试验(以评估增殖)。寿命可以通过本领域公知的方法测定，例如通过测定扩展培养物中体翻倍的最大次数。
214.分离的胎盘细胞，例如上文第5.2.2节中描述的分离的胎盘细胞，也可使用本领域已知的其他技术与其他胎盘细胞分离，例如期望细胞的选择性生长(正选择)、不想要的细胞的选择性破坏(负选择)；基于混合体中的差速细胞可凝集性的分离，例如用大豆凝集素；冻-融程序；过滤；常规离心和区带离心；淘析离心法(逆流离心)；单位重力分离；逆流分配；电泳等。
215.5.3.6受刺激的胎盘细胞
216.本文还提供分离的胎盘细胞(例如上文第5.2.2节中描述的分离的胎盘细胞)体，所述分离的胎盘细胞已经通过使所述细胞与一种或多种刺激性分子接触而被刺激。在具体实施方式中，所述细胞或细胞(例如pdac)体被一种或多种细胞因子刺激。在另一个具体实施方式中，所述细胞或细胞(例如pdac)体被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述一种或多种促炎细胞因子选自il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和inf-γ。在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞或细胞(例如pdac)体被il-1α刺激。在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞或细胞(例如pdac)体被il-1β刺激。在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞或细胞(例如pdac)体被il-6刺激。在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞或细胞(例如pdac)体被il-8刺激。在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞或细胞(例如pdac)体被il-18刺激。在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞或细胞(例如pdac)体被tnf-α刺激。在另一个具体实施方式中，本文所述的细
胞或细胞(例如pdac)体被inf-γ刺激。
217.在一个实施方式中，本文所述细胞(例如pdac)体被一种或多种细胞因子刺激，其中所述细胞因子为1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、10,000pg/ml或100,000pg/ml的浓度。在具体实施方式中，所述培养基补充有1pg/ml至10pg/ml、10pg/ml至100pg/ml、100pg/ml至1,000pg/ml、1,000pg/ml至10,000pg/ml或10,000pg/ml至100,000pg/ml浓度的所述一种或多种细胞因子。
218.在另一个具体实施方式中，本文所述的细胞(例如pdac)体被一种或多种细胞因子刺激，其中所述刺激发生1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时或60小时。在另一个具体实施方式中，本文所述细胞(例如pdac)体被一种或多种细胞因子刺激，其中所述刺激发生1分钟和5分钟之间、5分钟和10分钟之间、10分钟和15分钟之间、15分钟和30分钟之间、30分钟和60分钟之间、60分钟和2小时之间、2小时和5小时之间、5小时和10小时之间、10小时和15小时之间、15小时和20小时之间、20小时和25小时之间、25小时和30小时之间、30小时和35小时之间、35小时和40小时之间、40小时和45小时之间、45小时和50小时之间、50小时和55小时之间或55小时和60小时之间。
219.在一些实施方式中，本文所述受刺激的pdac(例如il-ιβ刺激的pdac)以比未受刺激的pdac更高的水平产生分泌因子。在具体实施方式中，所述分泌因子包括gm-csf、g-csf、il-6、gro、mcp-1、卵泡抑素和/或il-8。在具体实施方式中，本文所述的所述受刺激的pdac(例如il-1β刺激的pdac)具有促血管生成特性。
220.在具体实施方式中，本文所述的细胞(例如pdac)体在体外被刺激。
221.5.4分离的胎盘细胞的培养
222.5.4.1培养基
223.分离的胎盘细胞、或分离的胎盘细胞体、或胎盘细胞从其生长出的细胞或胎盘组织可用于启动或接种细胞培养物。通常将细胞转移到未涂覆或涂覆细胞外基质或配体(例如层粘连蛋白、胶原蛋白(例如天然的或变性的)、明胶、纤连蛋白、鸟氨酸、玻连蛋白、聚赖氨酸、cellstart
tm
和/或细胞外膜蛋白(例如(bd discovery labware,bedford,mass))或其他合适的生物分子或合成模拟剂的无菌组织培养容器中。
224.分离的胎盘细胞可以在本领域认为对细胞(例如干细胞)培养可接受的任何培养基中和任何条件下培养。优选地，培养基包含血清。分离的胎盘细胞可以在例如以下中培养：含有its(胰岛素-转铁蛋白-硒)、la+bsa(亚油酸-牛血清白蛋白)、地塞米松、l-抗坏血酸、pdgf、egf、igf-1和青霉素/链霉素的dmem-lg(dulbecco改良必需培养基，低葡萄糖)/mcdb 201(鸡成纤维细胞基础培养基)；包含10％胎牛血清(fbs)的dmem-hg(高葡萄糖)；包含15％fbs的dmem-hg；包含10％fbs、10％马血清、和氢化可的松的imdm(iscove改良dulbecco培养基)；包含1％至20％fbs、egf、和肝素的m199；包含10％fbs、glutamax
tm
和庆大霉素的α-mem(最小必需培养基)；包含10％fbs、glutamax
tm
和庆大霉素的dmem，等等。
225.可用于培养胎盘细胞的其他培养基包括dmem(高或低葡萄糖)、eagle基础培养基、ham f10培养基(f10)、ham f-12培养基(f12)、iscove改良dulbecco培养基、间充质干细胞生长培养基(mscgm)、liebovitz l-15培养基、mcdb、dmem/f12、rpmi 1640、高级dmem(gibco)、dmem/mcdb201(sigma)和cell-gro free。
226.培养基可以补充有一种或多种组分，包括例如血清(例如胎牛血清(fbs)，优选约2-15％(v/v)；马(马)血清(es)；人血清(hs))；β-巯基乙醇(bme)，优选约0.001％(v/v)；一种或多种生长因子，例如血小板衍生生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、胰岛素样生长因子-1(igf-1)、白血病抑制因子(lif)、血管内皮生长因子(vegf)和促红细胞生长素(epo)；氨基酸，包括l-缬氨酸；和单独或组合的控制微生物污染的一种或多种抗生素和/或抗真菌剂，例如青霉素g、硫酸链霉素、两性霉素b、庆大霉素和制霉菌素。
227.分离的胎盘细胞可以在标准组织培养条件下培养，例如在组织培养皿或多孔板中。分离的胎盘细胞也可以使用悬滴法进行培养。在这个方法中，分离的胎盘细胞以约1
×
104个细胞/ml悬浮于约5ml培养基中，并将一滴或多滴培养基置于组织培养容器(例如100ml皮氏培养皿)的盖子的内侧。液滴可以是例如单一液滴，或来自例如多通道移液管的多个液滴。小心地将盖子翻转并将其置于含有足以保持皿气氛中的含水量的一定体积的液体(例如无菌pbs)的皿的底部的顶部，并培养干细胞。
228.在具体实施方式中，分离的胎盘干细胞在促炎细胞因子的存在下培养。含有促炎细胞因子的培养基可以是本领域认为对于细胞(例如干细胞)培养可接受的任何培养基和在任何条件下，另外包含一种或多种促炎细胞因子。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和/或inf-γ中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。
229.促炎细胞因子可以以本领域认为可接受的任何浓度补充到培养基中。在具体实施方式中，所述培养基补充有1pg/ml、10pg/ml、100pg/ml、1,000pg/ml、10,000pg/ml或100,000pg/ml浓度的所述一种或多种细胞因子。在具体实施方式中，所述培养基补充有1pg/ml至10pg/ml、10pg/ml至100pg/ml、100pg/ml至1,000pg/ml、1,000pg/ml至10,000pg/ml或10,000pg/ml至100,000pg/ml浓度的所述一种或多种细胞因子。
230.在一个实施方式中，分离的胎盘细胞在用于维持分离的胎盘细胞中的未分化表型的化合物的存在下培养。在具体实施方式中，化合物是取代的3,4-二氢吡啶并(dihydropyridimol)[4,5-d]嘧啶。在另一个具体实施方式中，化合物是具有以下化学结构的化合物：
[0231][0232]
化合物可以以例如约1μμ至约10μμ的浓度与分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体接触。
[0233]
5.4.2胎盘细胞的扩增和增殖
[0234]
一旦分离的胎盘细胞或分离的胎盘细胞体(例如与至少50％的胎盘细胞(干细胞或干细胞体与其体内正常相关联)分离的胎盘细胞或胎盘细胞体)，细胞或细胞体可以在体外增殖和扩增。例如，分离的胎盘细胞体可以在组织培养容器(例如皿、瓶、多孔
板等)中培养足以使细胞增殖至70-90％汇合的时间，即直至细胞及其后代占据组织培养容器的培养表面积的70-90％。
[0235]
分离的胎盘细胞可以以允许细胞生长的密度接种在培养容器中。例如，细胞可以以低密度(例如约1000至约5000个细胞/cm2)至高密度(例如约50000至更多个细胞/cm2)接种。在优选的实施方式中，细胞在空气中在约0至约5体积％co2存在下培养。在一些优选的实施方式中，细胞在空气中在约2至约25％o2下培养，优选地在空气中在约5至约20％o2下培养。细胞优选地在约25℃至约40℃，优选37℃下培养。细胞优选地在孵育箱中培养。培养基可以是静态的或搅动的，例如使用生物反应器。胎盘细胞。例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞，优选地在低氧化应激下(例如，加入谷胱甘肽、抗坏血酸、过氧化氢酶、生育酚、n-乙酰半胱氨酸等)生长。
[0236]
一旦获得低于100％的汇合，例如70％至90％的汇合，细胞可以传代。例如，可以使用本领域公知的技术对细胞进行酶处理，例如胰蛋白酶化，以将其与组织培养表面分离。在通过移液移除细胞并计数细胞后，将约10000-100000个细胞/cm2传代至含有新鲜培养基的新的培养容器中。通常，新培养基是与从其移除分离的胎盘细胞的培养基相同类型的培养基。分离的胎盘细胞可以传代约、至少、或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20次或更多次。
[0237]
5.4.3分离的胎盘细胞体
[0238]
本文还提供了分离的胎盘细胞(例如上文第5.2.2节中描述的分离的胎盘细胞，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞)体，其可用于本文所述的方法和组合物。用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞体可以从一个或多个胎盘直接分离；也就是说，细胞体可以是包含分离的胎盘细胞的胎盘细胞体，其中所述分离的胎盘细胞获自或被包含在灌注液中，或者获自或被包含在破碎的胎盘组织(例如胎盘组织消化物(即，通过胎盘或其部分的酶消化获得的细胞的集合))中。用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞也可以被培养和扩增以产生分离的胎盘细胞体。包含用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞的胎盘细胞体也可以被培养和扩增以产生胎盘细胞体。在一个实施方式中，本文所述的分离的胎盘细胞被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和/或inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。
[0239]
可用于本文提供的方法的胎盘细胞体包含分离的胎盘细胞，例如本文第5.4.2节中所述的分离的胎盘细胞。在具体实施方式中，所述胎盘细胞体包含pdac，例如il-1β刺激的pdac。在各种实施方式中，胎盘细胞体中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的细胞是分离的胎盘细胞。也就是说，分离的胎盘细胞体可以包含例如多至1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的不是分离的胎盘细胞的细胞。
[0240]
可用于本文所述的方法和组合物的分离的胎盘细胞体可以通过例如选择表达特定标志物和/或特定培养物或形态学特性的分离的胎盘细胞(无论是源自酶消化还是灌注)而产生。在一个实施方式中，例如，本文提供了通过选择(a)粘附于基底，和(b)表达cd200并缺乏hla-g表达的胎盘细胞；并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生细胞体的方法。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达cd200并缺乏hla-g表达
的胎盘细胞并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择(a)粘附于基底，和(b)表达cd73、cd105和cd200的胎盘细胞；并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过识别表达cd73、cd105和cd200的胎盘细胞并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择(a)粘附于基底和(b)表达cd200和oct-4的胎盘细胞；并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达cd200和oct-4的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择(a)粘附于基底、(b)表达cd73和cd105，和(c)当所述体在允许胚状体样体形成的条件下培养时，促进在包含所述干细胞的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体的胎盘细胞；并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达cd73和cd105，并且当所述体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述干细胞的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择(a)粘附于基底，和(b)表达cd73和cd105且缺乏hla-g表达的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达cd73和cd105且缺乏hla-g表达的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，产生细胞体的方法包括选择(a)粘附于基底，(b)表达oct-4，和(c)当所述体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述干细胞的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达oct-4，并且当所述体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述干细胞的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。
[0241]
在另一个实施方式中，细胞体，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞体，是通过选择(a)粘附于基底，和(b)表达cd10和cd105且不表达cd34的胎盘细胞；并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达cd10和cd105且不表达cd34的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞体，是通过选择(a)粘附于基底，和(b)表达cd10、cd105和cd200且不表达cd34的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个实施方式中，细胞体是通过选择表达cd10、cd105和cd200且不表达cd34的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个具体实施方式中，细胞体，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞体，是通过选择(a)粘附于基底，和(b)表达cd10、cd90、cd105和cd200且不表达cd34和cd45的胎盘细胞；并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。在另一个具体实施方式中，细胞体，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的细胞体，是通过选择表达cd10、cd90、cd105和cd200且不表达cd34和cd45的胎盘细胞，并将所述细胞与其他细胞分离以形成细胞体而产生。
[0242]
可以以类似的方式分离或获得包含具有上文第5.2.2节中描述的任何标志物组合的胎盘细胞的细胞体的选择。
[0243]
在任何上述实施方式中，分离的细胞体的选择另外可以包括选择表达abc-p(胎盘特异性abc转运蛋白；参见例如allikmets等.,cancer res.58(23):5337-9(1998))的胎盘细胞。方法还可以包括选择显示对例如间充质干细胞特异性的至少一种特性(例如cd44的表达，cd90的表达或前述的组合的表达)的细胞。
[0244]
在上述实施方式中，基底可以是任何表面，在其上可以完成细胞(例如分离的胎盘细胞)的培养和/或选择。通常，基底是塑料，例如组织培养皿或多孔板塑料。组织培养塑料可以用生物分子(例如层粘连蛋白或纤连蛋白)涂覆。
[0245]
可以通过细胞选择领域已知的任何手段为胎盘细胞体选择细胞，例如用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞。例如，可以使用针对一种或多种细胞表面标志物的抗体或多种抗体选择细胞，例如在流式细胞术或facs中。使用与磁珠结合的抗体可以完成选择。对某些干细胞相关标志物特异性的抗体是本领域已知的。例如，针对oct-4(abcam,cambridge,ma)、cd200(abcam)、hla-g(abcam)、cd73(bd biosciences pharmingen,san diego,ca)、cd105(abcam；biodesign international,saco,me)等的抗体。针对其他标志物的抗体也是可商购的，例如针对cd34、cd38和cd45的抗体可从例如stemcell technologies或biodesign international获得。
[0246]
用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘细胞体可以包含不是干细胞的胎盘细胞，或不是胎盘细胞的细胞。
[0247]
包含用于产生本文所述受刺激的pdac的胎盘衍生粘附细胞的分离的细胞体可以包含第二细胞类型，例如不是胎盘衍生粘附细胞的胎盘细胞，或例如不是胎盘细胞的细胞。例如，分离的胎盘衍生粘附细胞体可以包含例如可与第二类型的细胞体组合，其中所述第二类型的细胞是例如胚胎干细胞、血细胞(例如胎盘血、胎盘血细胞、脐带血、脐带血细胞、外周血、外周血细胞、来自胎盘血、脐带血或外周血的有核细胞，等等)、从血液分离的干细胞(例如从胎盘血、脐带血或外周血分离的干细胞)、来自胎盘灌注液的有核细胞，例如来自胎盘灌注液的总有核细胞；脐带干细胞，血液衍生有核细胞、骨髓衍生间充质基质细胞、骨髓衍生间充质干细胞、骨髓衍生造血干细胞、粗骨髓、成体(体)干细胞的体，包含在组织内的干细胞的体，培养的细胞，例如培养的干细胞，完全分化细胞(例如软骨细胞、成纤维细胞、羊膜细胞、成骨细胞、肌细胞、心脏细胞等)的体、周细胞等。在具体实施方式中，包含胎盘衍生粘附细胞的细胞体包含胎盘干细胞或来自脐带的干细胞。在某些实施方式中，其中第二类型的细胞是血液或血细胞，红细胞已经被从所述细胞体去除。
[0248]
在具体实施方式中，第二类型的细胞是造血干细胞。这样的造血干细胞可以是例如包含在未处理的胎盘、脐带血或外周血内；在来自胎盘血、脐带血或外周血的总有核细胞中；在来自胎盘血、脐带血或外周血的分离的cd34
+
细胞体中；在未处理的骨髓中；在来自骨髓的总有核细胞中；在来自骨髓的分离的cd34
+
细胞体中等。
[0249]
在另一个实施方式中，用于产生本文所述受刺激的pdac的分离的胎盘衍生粘附细胞体与来自血管系统的多个成体细胞或祖细胞组合。在各种实施方式中，细胞是内皮细胞、内皮祖细胞、肌细胞、心肌细胞、周细胞、成血管细胞、成肌细胞或成心肌细胞。
[0250]
在另一个实施方式中，第二细胞类型是在培养物中被操纵以表达与胚胎干细胞相关的多能性和功能的标志物的非胚胎细胞类型。
[0251]
在用于产生本文所述受刺激的pdac的上述分离的胎盘衍生粘附细胞体的具体
实施方式中，胎盘衍生粘附细胞和第二类型细胞中的任一者或两者对于细胞的预期受体是自体的，或是同种异体的。
[0252]
在另一个具体实施方式中，组合物包含胎盘衍生粘附细胞和胚胎干细胞。在另一个具体实施方式中，组合物包含胎盘衍生粘附细胞和间充质基质或干细胞，例如骨髓衍生间充质基质或干细胞。在另一个具体实施方式中，组合物包含骨髓衍生造血干细胞。在另一个具体实施方式中，组合物包含胎盘衍生粘附细胞和造血祖细胞，例如来自骨髓、胎儿血、脐带血、胎盘血和/或外周血的造血祖细胞。在另一个具体实施方式中，组合物包含胎盘衍生粘附细胞和成体干细胞。在更具体的实施方式中，所述成体干细胞是神经干细胞、肝干细胞、胰干细胞、内皮干细胞、心脏干细胞或肌肉干细胞。
[0253]
在其他具体实施方式中，第二类型的细胞在所述体中占细胞的约、至少、或不超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。在其他具体实施方式中，所述组合物中的pdac在所述组合物中占细胞的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％。在其他具体实施方式中，胎盘衍生粘附细胞在所述体中占细胞的约、至少、或不超过10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％或45％。
[0254]
比较每个体中的总有核细胞的数量，分离的胎盘衍生粘附细胞体中的细胞可以与另外的类型的多个细胞(例如与干细胞体)以约100,000,000:1、50,000,000:1、20,000,000:1、10,000,000:1、5,000,000:1、2,000,000:1、1,000,000:1、500,000:1、200,000:1、100,000:1、50,000:1、20,000:1、10,000:1、5,000:1、2,000:1、1,000:1、500:1、200:1、100:1、50:1、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:100、1:200、1:500、1:1,000、1:2,000、1:5,000、1:10,000、1:20,000、1:50,000、1:100,000、1:500,000、1:1,000,000、1:2,000,000、1:5,000,000、1:10,000,000、1:20,000,000、1:50,000,000或约1:100,000,000的比率组合。分离的胎盘衍生粘附细胞体中的细胞也可以与多种细胞类型的多个细胞组合。
[0255]
在其他实施方式中，本文所述胎盘细胞(例如上述pdac)体与成骨胎盘粘附细胞(opac)组合，例如在2009年8月24日提交的标题为"methods and composition for treatment of bone defects with placental stem cells"的专利申请no.12/546,556中描述的opac，或者与羊膜衍生血管生成细胞(amdac)组合，例如标题为"amnion derived angiogenic cells"的美国专利申请no.12/622,352中所述的amdac，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0256]
在一个实施方式中，本文所述分离的胎盘细胞(例如pdac)被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和/或inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。
[0257]
5.5胎盘细胞库的生产
[0258]
来自产后胎盘的分离的细胞，例如上文第5.2.2节中描述的分离的胎盘细胞，可以以许多不同的方式培养以产生一组批次(a set of lots)，例如其中批次是一组可独立施用的剂量的分离的胎盘细胞。例如，这样的批次可以从来自胎盘灌注液或来自酶消化的胎盘组织的细胞获得。从多个胎盘获得的胎盘细胞批次组可以整理在分离的胎盘细胞库中用于例如长期储存。通常，组织培养塑料粘附细胞可以从胎盘材料的初始培养物获得以形成种子培养物，其在受控条件下扩增以形成来自大致相等次数的翻倍的细胞体。批次优选
地来源于单个胎盘的组织，但是可以来源于多个胎盘的组织。
[0259]
在一个实施方式中，如下获得胎盘细胞批。胎盘组织首先被破碎，例如通过切碎、用合适的酶例如胰蛋白酶或胶原酶(参见上文第5.3.3节)消化。胎盘组织优选包含来自单个胎盘的例如整个羊膜、整个绒毛膜或两者，但也可以仅包含羊膜或绒毛膜的一部分。经消化的组织被培养例如约1-3周，优选约2周。去除非粘附细胞后，收集形成的高密度落，例如通过胰蛋白酶化。将这些细胞收集并重悬浮在合适体积的培养基中，然后用于接种扩增培养物。扩增培养物可以是独立的细胞培养装置(例如nunc
tm
的cell factory)的任何布置。细胞可以被细分到任何程度以便于以例如1
×
103、2
×
103、3
×
103、4
×
103、5
×
103、6
×
103、7
×
103、8
×
103、9
×
103、1
×
104、1
×
104、2
×
104、3
×
104、4
×
104、5
×
104、6
×
104、7
×
104、8
×
104、9
×
104或10
×
104个细胞/cm2接种扩增培养物。优选地，使用约1
×
103至约1
×
104个细胞/cm2接种每个扩增培养物。根据从其获得细胞的特定一个或多个胎盘，扩增培养物的数量在数量上可以更多或更少。
[0260]
使扩增培养物生长直至培养物中细胞的密度达到某个值，例如约1
×
105个细胞/cm2。细胞可以在这个时候收集并冷冻保存，或者如上所述传代到新的扩增培养物中。在使用前，细胞可以传代，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次。在一次或多次扩增培养期间优选保持体翻倍的累积次数的记录。来自培养物的细胞可以扩增2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38或40次翻倍，或至多60次翻倍。然而，优选地，在将细胞体分成个体剂量之前，体翻倍次数为约15至约30。细胞可以在整个扩增过程中连续培养，或可以在扩增期间在一个或多个点处冷冻。
[0261]
可以将待用于个体剂量的细胞冷冻，例如冷冻保存以供以后使用。个体剂量可以包含例如约1百万至约50百万个细胞/ml，并且可以总共包含约106至约10
10
个细胞。
[0262]
因此，在一个实施方式中，胎盘细胞库可以通过以下方法制备，所述方法包括：使来自人产后胎盘的原代培养胎盘细胞扩增第一多次体翻倍；冷冻保存所述胎盘细胞以形成主细胞库；使来自主细胞库的多个胎盘细胞扩增第二多次体翻倍；冷冻保存所述胎盘细胞以形成工作细胞库；使来自工作细胞库的多个胎盘细胞扩增第三多次体翻倍；并以个体剂量冷冻保存所述胎盘细胞，其中所述个体剂量共同构成胎盘细胞库。任选地，可以使来自所述第三多次体翻倍的多个胎盘细胞扩增第四多次体翻倍并以个体剂量冷冻保存，其中所述个体剂量共同构成胎盘细胞库。
[0263]
在另一个具体实施方式中，所述原代培养胎盘细胞包含来自胎盘灌注液的胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述原代培养胎盘细胞包含来自消化的胎盘组织的胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述原代培养胎盘细胞包含来自胎盘灌注液和来自消化的胎盘组织的胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述胎盘细胞原代培养物中的所有所述胎盘细胞来自相同的胎盘。在另一个具体实施方式中，方法还包括从来自所述工作细胞库的所述多个所述胎盘细胞选择cd200
+
或hla-g-胎盘细胞以形成个体剂量的步骤。在另一个具体实施方式中，所述个体剂量包含约104至约105个胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述个体剂量包含约105至约106个胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述个体剂量包含约106至约107个胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述个体剂量包含约107至约108个胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述个体剂量包含约108至约109个胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述个体剂量包含约109至约10
10
个胎盘细胞。
[0264]
在优选的实施方式中，测试从其获得胎盘的供体(例如母体)的至少一种病原体。如果母体测试出对测试病原体为阳性，则丢弃来自胎盘的整个批次。这样的测试可以在胎盘细胞批次生产期间的任何时间进行，例如在扩增培养期间。检测其存在的病原体可以包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、人免疫缺陷病毒(i型和ii型)、巨细胞病毒、疱疹病毒等。
[0265]
在一个实施方式中，根据本文所述方法存库的胎盘干细胞在存库之前被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和/或inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。
[0266]
5.6胎盘细胞的保存
[0267]
分离的胎盘细胞，例如上文第5.3.2节中描述的分离的胎盘细胞，可以被保存，即置于允许长期储存的条件下，或抑制细胞死亡(通过例如凋亡或坏死)的条件下。
[0268]
胎盘细胞可以使用例如包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳的组合物进行保存，如相关的美国申请公布no.2007/0190042中所述，其公开内容通过引用整体并入本文。在一个实施方式中，保存可用于本文所述方法和组合物的细胞体的方法包括使所述细胞体与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物接触，其中所述凋亡抑制剂以足以与不与凋亡抑制剂接触的细胞体相比减少或防止细胞体中的凋亡的量和时间存在。在具体实施方式中，所述凋亡抑制剂是半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体实施方式中，所述凋亡抑制剂是jnk抑制剂。在另一个具体实施方式中，所述jnk抑制剂不调节所述细胞的分化或增殖。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物包含在分开的相中的所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方式中，所述细胞收集组合物包含在乳液中的所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方式中，细胞收集组合物另外包含乳化剂，例如卵磷脂。在另一个实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与细胞接触时在约0℃和约25℃之间。在另一个具体实施方式中，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在与细胞接触时在约2℃和10℃之间，或约2℃和约5℃之间。在另一个具体实施方式中，所述接触在所述细胞体的运输期间进行。在另一个具体实施方式中，所述接触在所述细胞体的冷冻和融化期间进行。
[0269]
胎盘细胞体可以例如通过包括使所述细胞体与凋亡抑制剂和器官保存化合物接触的方法进行保存，其中所述凋亡抑制剂以足以与未与凋亡抑制剂接触的细胞体相比减少或防止细胞体中的凋亡的量和时间存在。在具体实施方式中，器官保存化合物是uw溶液(描述于美国专利no.4,798,824；也被称为viaspan；也参见southard等.,transplantation 49(2):251-257(1990))或在stern等.,美国专利no.5,552,267中描述的溶液，其公开内容通过引用整体并入本文。在另一个实施方式中，所述器官保存化合物是羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或其组合。在另一个实施方式中，细胞收集组合物另外包含在两相中的或作为乳液的携氧全氟化碳。
[0270]
在方法的另一个实施方式中，胎盘细胞在灌注期间与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或其组合的细胞收集组合物接触。在另一个实施方式中，所述细胞在组织破碎(例如酶消化)的过程中接触。在另一个实施方式中，在通过灌注收集之后，或者通过组织破碎(例如酶消化)收集之后，胎盘细胞与所述细胞收集化合物接触。
[0271]
通常，在胎盘细胞收集、富集和分离期间，由于低氧和机械应激，优选的是最小化或消除细胞应激。因此，在方法的另一个实施方式中，在所述保存期间，细胞或细胞体在收集、富集或分离期间暴露于低氧条件少于六小时，其中低氧条件是比正常血氧浓度低的氧浓度。在另一个具体实施方式中，在所述保存过程中，所述细胞体暴露于所述低氧条件少于两小时。在另一个具体实施方式中，在收集、富集和分离期间，所述细胞体暴露于所述低氧条件少于一小时、或少于三十分钟、或不暴露于低氧条件。在另一个具体实施方式中，在收集、富集或分离期间，所述细胞体不暴露于剪切应激。
[0272]
胎盘细胞可以冷冻保存，例如在小容器(例如安瓿)中的冷冻保存介质中。合适的冷冻保存介质包括但不限于培养基，其包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如市售细胞冷冻培养基，例如c2695、c2639或c6039(sigma)。冷冻保存介质优选包含浓度为约2％至约15％(v/v)，例如约10％(v/v)的dmso(二甲基亚砜)。冷冻保存介质可以包含另外的试剂，例如甲基纤维素和/或甘油。胎盘细胞优选地在冷冻保存期间以约1℃/分钟冷却。优选的冷冻保存温度是约-80℃至约-180℃，优选约-125℃至约-140℃。冷冻保存的细胞可以在解冻使用前转移到液氮中。在一些实施方式中，例如，一旦安瓿已经达到约-90℃，它们被转移到液氮储存区域。冷冻保存也可以使用控速冷冻机完成。冷冻保存的细胞优选地在约25℃至约40℃的温度，优选约37℃的温度下解冻。
[0273]
在一个实施方式中，根据本文所述方法冷冻保存的胎盘干细胞在冷冻保存之前被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。
[0274]
5.7包含分离的胎盘细胞的组合物
[0275]
本文所述(例如在第5.3.6节中)受刺激的胎盘细胞可以与任何生理上可接受的或医学上可接受的化合物、组合物或装置组合用于本文所述的方法和组合物。可用于本文提供的方法的组合物可以包含本文所述的任何一种或多种受刺激的胎盘细胞(参见上文第5.3.6节)。在某些实施方式中，组合物是药学上可接受的组合物，例如包含在药学上可接受的载体中的受刺激的胎盘细胞的组合物。
[0276]
在某些实施方式中，包含受刺激的胎盘细胞的组合物另外包含基质，例如脱细胞基质或合成基质。在另一个具体实施方式中，所述基质是三维支架。在另一个具体实施方式中，所述基质包含胶原蛋白、明胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、果胶、鸟氨酸或玻连蛋白。在另一个具体实施方式中，基质是羊膜或羊膜衍生生物材料。在另一个具体实施方式中，所述基质包含细胞外膜蛋白。在另一个具体实施方式中，所述基质包含合成化合物。在另一个具体实施方式中，所述基质包含生物活性化合物。在另一个具体实施方式中，所述生物活性化合物是小于5000道尔顿的生长因子、细胞因子、抗体或有机分子。
[0277]
在另一个实施方式中，可用于本文提供的方法的组合物包含任何前述胎盘细胞或任何前述胎盘细胞体调节的培养基。
[0278]
5.7.1冷冻保存的分离的胎盘细胞
[0279]
可用于本文所述方法和组合物的分离的胎盘细胞可以保存(例如冷冻保存)用于以后使用。用于细胞(例如干细胞)冷冻保存的方法是本领域公知的。分离的胎盘细胞体可以以容易施用于个体的形式制备，例如容纳在适用于医疗用途的容器内的分离的胎盘细
胞体。这样的容器可以是例如注射器、无菌塑料袋、瓶、罐或从其可以容易地分配分离的胎盘细胞体的其他容器。例如，容器可以是血液袋或适用于向受体静脉内施用液体的其他塑料的、医学上可接受的袋。在某些实施方式中，容器是允许组合的细胞体的冷冻保存的容器。
[0280]
在一个实施方式中，根据本文所述方法冷冻保存的胎盘干细胞在冷冻保存之前被一种或多种促炎细胞因子刺激。在另一个实施方式中，在解冻所述冷冻保存的胎盘干细胞之后，所述胎盘干细胞被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和inf-γ中的一种或多种。在具体实施方式中，所述促炎细胞因子是il-ιβ。
[0281]
冷冻保存的分离的胎盘细胞体可以包含源自单个供体或源自多个供体的分离的胎盘细胞。分离的胎盘细胞体可以与预期受体完全hla匹配，或者部分或完全hla错配。
[0282]
因此，在一个实施方式中，分离的胎盘细胞可以在本文所述的方法中以在容器中的包含组织培养塑料粘附胎盘细胞体的组合物的形式使用。在具体实施方式中，分离的胎盘细胞被冷冻保存。在另一个具体实施方式中，容器是袋、瓶或罐。在另一个具体实施方式中，所述袋是无菌塑料袋。在另一个具体实施方式中，所述袋适用于、允许或促进所述分离的胎盘细胞的静脉内施用，例如通过静脉内输注。袋可以包括多个腔或隔室，其互联以允许分离的胎盘细胞和一种或多种其他溶液(例如药物)在施用之前或期间混合。在另一个具体实施方式中，组合物包含促进组合的细胞体的冷冻保存的一种或多种化合物。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞体被包含在生理上可接受的水溶液中。在另一个具体实施方式中，所述生理上可接受的水溶液是0.9％nacl溶液。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞体包含与所述细胞体的受体hla匹配的胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述组合的细胞体包含与所述细胞体的受体至少部分hla错配的胎盘细胞。在另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞源自多个供体。
[0283]
在某些实施方式中，容器中的分离的胎盘细胞是分离的cd10
+
、cd34-、cd105
+
胎盘细胞，其中所述细胞已经被冷冻保存并被包含在容器中。在具体实施方式中，所述cd10
+
、cd34-、cd105
+
胎盘细胞也是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，所述cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞也是cd45-或cd90
+
。在另一个具体实施方式中，所述cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞也是cd45-和cd90
+
。在另一个具体实施方式中，cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd13
+
、cd29
+
、cd33
+
、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、sh3
+
(cd73
+
)、sh4
+
(cd73
+
)、cd80-、cd86-、cd90
+
、sh2
+
(cd105
+
)、cd106/vcam
+
、cd117-、cd144/ve-钙粘蛋白
dim
、cd184/cxcr4-、cd200
+
、cd133-、oct-4
+
、ssea3-、ssea4-、abc-p
+
、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-、hla-g-或程序性死亡-1配体(pdl1)
+
或其任何组合中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd13
+
、cd29
+
、cd33
+
、cd38-、cd44
+
、cd45-、cd54/icam
+
、cd62e-、cd62l-、cd62p-、sh3
+
(cd73
+
)、sh4
+
(cd73
+
)、cd80-、cd86-、cd90
+
、sh2
+
(cd105
+
)、cd106/vcam
+
、cd117-、cd144/ve-钙粘蛋白
dim
、cd184/cxcr4-、cd200
+
、cd133-、oct-4
+
、ssea3-、ssea4-、abc-p
+
、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-、hla-g-和程序性死亡-1配体(pdl1)
+
。
[0284]
在某些其他实施方式中，上述分离的胎盘细胞是分离的cd200
+
、hla-g-胎盘细胞，其中所述细胞已经被冷冻保存并包含在容器内。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是
已经被冷冻保存的cd73
+
、cd105
+
、cd200
+
细胞，并被包含在容器内。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是已经被冷冻保存的cd200
+
、oct-4
+
干细胞，并被包含在容器内。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是已经被冷冻保存的cd73
+
、cd105
+
细胞，并被包含在容器内，并且其中当与胎盘细胞体一起在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述分离的胎盘细胞促进形成一个或多个胚状体样体。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是已经被冷冻保存的cd73
+
、cd105
+
、hla-g-细胞，并被包含在容器内。在另一个实施方式中，分离的胎盘细胞是已经被冷冻保存的oct-4
+
胎盘细胞，并被包含在容器内，并且其中当与胎盘细胞体一起在允许胚状体样体形成的条件下培养时，所述细胞促进形成一个或多个胚状体样体。
[0285]
在另一个具体实施方式中，上述分离的胎盘细胞是如通过流式细胞术检测的作为cd34-、cd10
+
和cd105
+
的胎盘干细胞或胎盘多能细胞(例如pdac)。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞具有分化成神经表型细胞、成骨表型细胞或成软骨表型细胞的潜能。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是cd200
+
。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
或cd45-。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
或cd45-。在另一个具体实施方式中，分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
或cd45-。在另一个具体实施方式中，cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd90
+
和cd45-。在另一个具体实施方式中，cd34-、cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
、cd90
+
、cd45-细胞另外是如通过流式细胞术检测的cd80-和cd86-。在另一个具体实施方式中，cd34-、cd10
+
、cd105
+
细胞另外是cd29
+
、cd38-、cd44
+
、cd54
+
、cd80-、cd86-、sh3
+
或sh4
+
中的一种或多种。在另一个具体实施方式中，细胞另外是cd44
+
。在上述任何分离的cd34-、cd10
+
、cd105
+
胎盘细胞的具体实施方式中，细胞另外是cd117-、cd133-、kdr-(vegfr2-)、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-和/或pdl1
+
中的一种或多种。
[0286]
在任何上述冷冻保存的分离的胎盘细胞的具体实施方式中，所述容器是袋。在各种具体实施方式中，所述容器包含约、至少、或至多1
×
106个所述分离的胎盘细胞、5
×
106个所述分离的胎盘细胞、1
×
107个所述分离的胎盘细胞、5
×
107个所述分离的胎盘细胞、1
×
108个所述分离的胎盘细胞、5
×
108个所述分离的胎盘细胞、1
×
109个所述分离的胎盘细胞、5
×
109个所述分离的胎盘细胞、1
×
10
10
个所述分离的胎盘细胞或1
×
10
10
个所述分离的胎盘细胞。在任何上述冷冻保存的体的其他具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞已经传代约、至少、或不超过5次，不超过10次，不超过15次或不超过20次。在任何上述冷冻保存的分离的胎盘细胞的另一个具体实施方式中，所述分离的胎盘细胞已经在所述容器内扩增。
[0287]
在某些实施方式中，单一单位剂量的胎盘衍生粘附细胞可在各种实施方式中包含约、至少、或不超过1
×
105、5
×
105、1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108、1
×
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
个或更多个胎盘衍生粘附细胞。在某些实施方式中，本文提供的药物组合物包含胎盘衍生粘附细胞体，其包含50％的有活力细胞或更多(即体中至少50％的细胞是功能性的或活的)。优选地，体中至少60％的细胞是有活力的。更优选地，药物组合物中的体中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是有活力的。
[0288]
5.7.2基因工程化胎盘细胞
[0289]
本文还提供了胎盘细胞，例如上文第5.2.2节和第5.3.6节中描述的任何胎盘多能
细胞或胎盘细胞，或包含这样的胎盘细胞的药物组合物，其中所述胎盘细胞已经被基因工程化以产生与血管生成相关或促进血管生成的重组或外源细胞因子。在某些实施方式中，所述促进血管生成的蛋白是肝细胞生长因子(hgf)、血管内皮生长因子(vegf)(例如vegfd)、成纤维细胞生长因子(fgf)(例如fgf2)、血管生成素(ang)、表皮生长因子(egf)、表皮-中性粒细胞-活化蛋白78(ena-78)、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、生长调节原癌基因蛋白(gro)、白细胞介素6(il-6)、il-8、瘦素、单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)、mcp-3、血小板衍生生长因子亚基b(pdgfb)、调节激活正常t-细胞表达分泌因子(rantes)、转化生长因子β1(tgf-β1)、促血小板生成素(tpo)、金属蛋白酶组织抑制剂1(timp1)、timp2和/或尿激酶纤溶酶原激活物受体(upar)中的一种或多种。
[0290]
可以使用例如用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、聚乙二醇对细胞进行基因工程化的方法或本领域技术人员已知的其他方法。这些包括使用在细胞中转运和表达核酸分子的表达载体。(参见geoddel；gene expression technology:methods in enzymology 185,academic press,san diego,calif.(1990))。可以通过常规转化或转染技术将载体dna导入原核或真核细胞中。用于转化或转染宿主细胞的合适的方法可见于sambrook等，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社(1989)和其他实验教科书。
[0291]
可以通过包括病毒转移，包括使用dna或rna病毒载体，例如逆转录病毒(包括慢病毒)、猿猴病毒(simian virus)40(sv40)、腺病毒、辛德毕斯(sindbis)病毒和牛乳头瘤病毒；化学转移，包括磷酸钙转染和deae葡聚糖转染方法；膜融合转移，使用载有dna的膜囊泡，如卵磷脂、红细胞影泡(read blood cell ghosts)和原生质体；或物理转移技术，例如显微注射、电穿孔或裸dna转移的方法，通过将dna或rna(例如编码感兴趣的蛋白的dna或rna)导入细胞中而对胎盘细胞(例如上文第5.2节中所述的pdac)进行基因修饰。可以通过外源dna的插入或通过用外源dna取代细胞基因组片段而对胎盘细胞进行基因改变。一个或多个外源dna序列的插入可以例如通过同源重组或通过病毒整合到宿主细胞基因组中，或通过使用质粒表达载体和核定位序列将dna整合到细胞中，特别是其核中而实现。dna可以包含一个或多个启动子，其允许使用某些化学品/药物(例如四环素)阳性或阴性诱导表达感兴趣的蛋白；在其他实施方式中，启动子可以是组成型的。
[0292]
可以使用磷酸钙转染将例如含有编码感兴趣的蛋白的多核苷酸序列的质粒dna导入细胞中。在某些实施方式中，dna与氯化钙溶液合并，然后加入到磷酸盐缓冲溶液中。一旦已经形成沉淀，将溶液直接加入到培养的细胞中。dmso或甘油处理可以用于提高转染效率，并且可以使用双羟乙基氨基乙磺酸盐(bes)提高稳定转染子的水平。磷酸钙转染系统是可以商购的(例如promega corp.,madison,wis.)。也可以使用deae-葡聚糖转染。
[0293]
分离的胎盘细胞也可以通过显微注射进行基因工程化。在某些实施方式中，玻璃微量移液管在光学显微镜下被引导到细胞的核中以注射dna或rna。
[0294]
胎盘细胞也可以使用电穿孔进行基因修饰。在某些实施方式中，将dna或rna加入到培养的细胞的悬浮液中，并将dna/rna-细胞悬浮液置于两个电极之间并经受电脉冲，造成细胞的外膜中的瞬时渗透性，其通过出现穿过膜的孔而证明。
[0295]
可以使用阳离子脂质体进行dna或rna的脂质体递送以对细胞进行基因修饰，所述
阳离子脂质体任选地包括二油酰基磷脂酰乙醇胺(dope)或二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)，例如(life technologies,inc.)。其他市售的递送系统包括effectene
tm
(qiagen)、dotap(roche molecular biochemicals)、fugene 6
tm
(roche molecular biochemicals)和(promega)。
[0296]
可以通过将例如靶基因、多核苷酸、反义分子或核酶序列递送到细胞中，使用病毒载体对胎盘细胞进行遗传改变。逆转录病毒载体对于快速转导-分裂细胞是有效的，尽管也已经开发了许多逆转录病毒载体以有效地将dna转移到非分裂细胞中。用于逆转录病毒载体的包装细胞株是本领域技术人员已知的。在某些实施方式中，逆转录病毒dna载体含有两个逆转录病毒ltr，使得第一ltr位于sv40启动子的5'，其被操作地连接至克隆到多克隆位点的靶基因序列，接着是3'第二ltr。一旦形成，如前所述，使用磷酸钙介导转染将逆转录病毒dna载体转移到包装细胞株中。在病毒产生大约48小时后，收获现在含有靶基因序列的病毒载体。使用慢病毒载体、重组疱疹病毒、腺病毒载体或甲病毒载体转染细胞的方法是本领域已知的。
[0297]
可以在本领域技术人员已知的技术中使用遗传标志物证实靶细胞的成功转染或转导。例如维多利亚多管发光水母的绿荧光蛋白已被证明是识别和追踪基因修饰的造血细胞的有效标志物。替代性的可选标志物包括β-gal基因、截短的神经生长因子受体或药物可选标志物(包括但不限于neo、mtx或潮霉素)。
[0298]
5.7.3药物组合物
[0299]
受刺激的分离的胎盘细胞(例如pdac，例如il-1β刺激的pdac)的体，或包含受刺激的分离的胎盘细胞的细胞的体，可以配制成用于体内使用的药物组合物，例如用于本文提供的方法。这样的药物组合物包含在用于体内施用的药学上可接受的载体(例如盐水溶液或其他公认的生理上可接受的溶液)中的受刺激的分离的胎盘细胞体，或包含受刺激的分离的胎盘细胞的细胞体。包含本文所述受刺激的分离的胎盘细胞的药物组合物可以包含本文别处所述的受刺激的分离的胎盘细胞体或受刺激的分离的胎盘细胞的任一者或任何组合。药物组合物可以包含胎儿、母体或胎儿和母体两者的受刺激的分离的胎盘细胞。本文提供的药物组合物还包含从单个个体或胎盘，或者从多个个体或胎盘获得的受刺激的分离的胎盘细胞。
[0300]
本文提供的药物组合物可以包含任何数量的受刺激的分离的胎盘细胞。例如，在各种实施方式中，单一单位剂量的受刺激的分离的胎盘细胞可以包含约、至少、或不超过1
×
102、5
×
102、1
×
103、5
×
103、1
×
104、5
×
104、1
×
105、5
×
105、1
×
106、5
×
106、1
×
107、5
×
107、1
×
108、5
×
108、1
×
109、5
×
109、1
×
10
10
、5
×
10
10
、1
×
10
11
个或更多个分离的胎盘细胞。在其他实施方式中，单一单位剂量的受刺激的分离的胎盘细胞可以包含约、至少、或不超过1
×
10
2-5
×
102、5
×
10
2-1
×
103、1
×
10
3-5
×
103、5
×
10
3-1
×
104、1
×
10
4-5
×
104、5
×
10
4-1
×
105、1
×
10
5-5
×
105、5
×
10
5-1
×
106、1
×
10
6-5
×
106、5
×
10
6-1
×
107、1
×
10
7-5
×
107、5
×
10
7-1
×
108、1
×
10
8-5
×
108、5
×
10
8-1
×
109、1
×
10
9-5
×
109、5
×
10
9-1
×
10
10
、1
×
10
10-5
×
10
10
、5
×
10
10-1
×
10
11
或1
×
10
11-5
×
10
11
个或更多个分离的胎盘细胞。
[0301]
本文提供的药物组合物包含含50％有活力细胞或更多的细胞体(即体中至少50％的细胞是功能性的或活的)。优选地，体中至少60％的细胞是有活力的。更优选地，药物组合物中的体中至少70％、80％、90％、95％或99％的细胞是有活力的。
[0302]
本文提供的药物组合物可以包含一种或多种化合物，其例如促进植入(例如，抗t细胞受体抗体、免疫抑制剂等)；稳定剂如白蛋白、葡聚糖40、明胶、羟乙基淀粉、勃脉力(plasmalyte)等。
[0303]
当配制为可注射溶液时，在一个实施方式中，药物组合物包含约1％至1.5％hsa和约2.5％葡聚糖。在优选的实施方式中，药物组合物在溶液中包含约5
×
106个细胞/毫升至约2
×
107个细胞/毫升，所述溶液包含5％hsa和10％葡聚糖，任选地包含免疫抑制剂，例如环孢菌素a，例如以10mg/kg。
[0304]
在其他实施方式中，药物组合物(例如溶液)包含多个细胞，例如受刺激的分离的胎盘细胞，例如pdac，例如il-1β刺激的pdac，其中所述药物组合物包含约1.0
±
0.3
×
106个细胞/毫升至约5.0
±
1.5
×
106个细胞/毫升。在其他实施方式中，药物组合物包含约1.5
×
106个细胞/毫升至约3.75
×
106个细胞/毫升。在其他实施方式中，药物组合物包含约1
×
106个细胞/ml至约50
×
106个细胞/ml、约1
×
106个细胞/ml至约40
×
106个细胞/ml、约1
×
106个细胞/ml至约30
×
106个细胞/ml、约1
×
106个细胞/ml至约20
×
106个细胞/ml、约1
×
106个细胞/ml至约15
×
106个细胞/ml、约1
×
106个细胞/ml至约10
×
106个细胞/ml。在某些实施方式中，药物组合物不包含可见的细胞团块(即没有大(macro)细胞团块)，或基本上没有这样的可见团块。如本文所用，"大细胞团块"指在没有放大的情况下可见的细胞聚集，即肉眼可见，并且通常指大于约150微米的细胞聚集。在一些实施方式中，药物组合物包含约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10％葡聚糖，例如葡聚糖-40。在具体实施方式中，所述组合物包含约7.5％至约9％葡聚糖-40。在具体实施方式中，所述组合物包含约5.5％葡聚糖-40。在某些实施方式中，药物组合物包含约1％至约15％人血清白蛋白(hsa)。在具体实施方式中，药物组合物包含约1％、2％、3％、4％、5％、65、75、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％hsa。在具体实施方式中，所述细胞已被冷冻保存和解冻。在另一个具体实施方式中，所述细胞已经通过70μμ至100μμ过滤器过滤。在另一个具体实施方式中，所述组合物不包含可见的细胞团块。在另一个具体实施方式中，所述组合物每106个细胞包含少于约200个细胞团块，其中所述细胞团块仅在显微镜如光学显微镜下可见。在另一个具体实施方式中，所述组合物每106个细胞包含少于约150个细胞团块，其中所述细胞团块仅在显微镜如光学显微镜下可见。在另一个具体实施方式中，所述组合物每106个细胞包含少于约100个细胞团块，其中所述细胞团块仅在显微镜如光学显微镜下可见。
[0305]
在具体实施方式中，药物组合物包含约1.0
±
0.3
×
106个细胞/毫升、约5.5％葡聚糖-40(w/v)、约10％hsa(w/v)和约5％dmso(v/v)。
[0306]
在其他实施方式中，药物组合物包含在包含10％葡聚糖-40的溶液中的多个受刺激的细胞，例如受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac，其中药物组合物包含约1.0
±
0.3
×
106个细胞/毫升至约5.0
±
1.5
×
106个细胞/毫升，并且其中所述药物组合物不包含肉眼可见的细胞团块(即不包含大细胞团块)。在一些实施方式中，药物组合物包含约1.5
×
106个细胞/毫升至约3.75
×
106个细胞/毫升。在具体实施方式中，所述细胞已被冷冻保存和解冻。在另一个具体实施方式中，所述细胞已经通过70μμ至100μμ过滤器过滤。在另一个具体实施方式中，所述组合物每106个细胞包含少于约200个微(micro)细胞团块(即仅在放大时可见的细胞团块)。在另一个具体实施方式中，所述组合物每106个细胞包含少于约150个
微细胞团块。在另一个具体实施方式中，所述组合物每106个细胞包含少于约100个微细胞团块。在另一个具体实施方式中，药物组合物包含小于15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％或2％dmso，或小于1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％dmso。
[0307]
本文还提供了包含受刺激的细胞(例如受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac)的组合物，其中所述组合物通过本文公开的方法之一产生。例如，在一个实施方式中，药物组合物包含细胞，其中药物组合物通过包括通过包括以下的方法产生：过滤包含胎盘细胞(例如胎盘干细胞或胎盘多能细胞)的溶液以形成过滤的含细胞溶液；用第一溶液稀释过滤的含细胞溶液至约1至50
×
106、1至40
×
106、1至30
×
106、1至20
×
106、1至15
×
106、或1至10
×
106个细胞/毫升，例如在冷冻保存之前；并用包含葡聚糖但不包含人血清白蛋白(hsa)的第二溶液稀释得到的过滤的含细胞溶液以产生所述组合物。在某些实施方式中，所述稀释是至不超过15
×
106个细胞/毫升。在某些实施方式中，所述稀释是至不超过10
±3×
106个细胞/毫升。在某些实施方式中，所述稀释是至不超过7.5
×
106个细胞/毫升。在其他某些实施方式中，如果过滤的含细胞溶液在稀释之前包含少于约15
×
106个细胞/毫升，则过滤是任选的。在其他某些实施方式中，如果过滤的含细胞溶液在稀释之前包含少于约10
±3×
106个细胞/毫升，则过滤是任选的。在其他某些实施方式中，如果过滤的含细胞溶液在稀释之前包含少于约7.5
×
106个细胞/毫升，则过滤是任选的。
[0308]
在具体实施方式中，在所述用第一稀释溶液稀释和用所述第二稀释溶液稀释之间，受刺激的细胞(例如受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac)被冷冻保存。在另一个具体实施方式中，第一稀释溶液包含葡聚糖和hsa。在第一稀释溶液或第二稀释溶液中的葡聚糖可以是任何分子量的葡聚糖，例如分子量为约10kda至约150kda的葡聚糖。在一些实施方式中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中的所述葡聚糖为约2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％或10％葡聚糖。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液或所述第二稀释溶液中的葡聚糖是葡聚糖-40。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液和所述第二稀释溶液中的葡聚糖是葡聚糖-40。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液中的所述葡聚糖-40是5.0％葡聚糖-40。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液中的所述葡聚糖-40是5.5％葡聚糖-40。在另一个具体实施方式中，所述第二稀释溶液中的所述葡聚糖-40是10％葡聚糖-40。在另一个具体实施方式中，所述包含hsa的溶液中的所述hsa是1至15％hsa。在另一个具体实施方式中，所述包含hsa的溶液中的所述hsa是约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％hsa。在另一个具体实施方式中，所述包含hsa的溶液中的所述hsa是10％hsa。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液包含hsa。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液中的所述hsa是10％hsa。在另一个具体实施方式中，所述第一稀释溶液包含冷冻保护剂。在另一个具体实施方式中，所述冷冻保护剂是dmso。在另一个具体实施方式中，所述第二稀释溶液中的所述葡聚糖-40是约10％葡聚糖-40。在另一个具体实施方式中，所述包含细胞的组合物包含约7.5％至约9％葡聚糖。在另一个具体实施方式中，药物组合物包含约1.0
±
0.3
×
106个细胞/毫升至约5.0
±
1.5
×
106个细胞/毫升。在另一个具体实施方式中，药物组合物包含约1.5
×
106个细胞/毫升至约3.75
×
106个细胞/毫升。
[0309]
在另一个具体实施方式中，药物组合物通过包括以下的方法制备：(a)在冷冻保存之前过滤包含受刺激的胎盘细胞(例如受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac)的含细胞溶液以产生过滤的含细胞溶液；(b)以约1至50
×
106、1至40
×
106、1至30
×
106、1至20
×
106、1至15
×
106或1至10
×
106个细胞/毫升冷冻保存过滤的含细胞溶液中的细胞；(c)解冻细胞；和(d)用葡聚糖-40溶液以约1:1至约1:11(v/v)稀释过滤的含细胞溶液。在某些实施方式中，如果在步骤(a)之前细胞的数量少于约10
±3×
106个细胞/毫升，则过滤是任选的。在另一个具体实施方式中，步骤(b)中的细胞以约10
±3×
106个细胞/毫升冷冻保存。在另一个具体实施方式中，步骤(b)中的细胞在包含约5％至约10％葡聚糖-40和hsa的溶液中冷冻保存。在某些实施方式中，步骤(b)中的所述稀释是至不超过约15
×
106个细胞/毫升。
[0310]
在另一个实施方式中，药物组合物通过包括以下的方法制备：(a)将受刺激的胎盘细胞(例如受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac)悬浮于包含10％hsa的5.5％葡聚糖-40溶液中以形成含细胞溶液；(b)过滤含细胞溶液通过70μμ过滤器；(c)用包含5.5％葡聚糖-40、10％hsa和5％dmso的溶液将含细胞溶液稀释至约1至50
×
106、1至40
×
106、1至30
×
106、1至20
×
106、1至15
×
106或1至10
×
106个细胞/毫升；(d)冷冻保存细胞；(e)解冻细胞；和(f)用10％葡聚糖-40以1:1至1:11(v/v)稀释含细胞溶液。在某些实施方式中，步骤(c)中的所述稀释是至不超过约15
×
106个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(c)中的所述稀释是至不超过约10
±3×
106个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(c)中的所述稀释是至不超过约7.5
×
106个细胞/毫升。
[0311]
在另一个实施方式中，包含受刺激的细胞的组合物通过包括以下的方法制备：(a)离心多个细胞以收集细胞；(b)在5.5％葡聚糖-40中重悬细胞；(c)离心细胞以收集细胞；(d)在包含10％hsa的5.5％葡聚糖-40溶液中重悬细胞；(e)过滤细胞通过70μμ过滤器；(f)在5.5％葡聚糖-40、10％hsa和5％dmso中稀释细胞至约1至50
×
106、1至40
×
106、1至30
×
106、1至20
×
106、1至15
×
106或1至10
×
106个细胞/毫升；(g)冷冻保存细胞：(h)解冻细胞；和(i)用10％葡聚糖-40以1:1至1:11(v/v)稀释细胞。在某些实施方式中，步骤(f)中的所述稀释是至不超过约15
×
106个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(f)中的所述稀释是至不超过约10
±3×
106个细胞/毫升。在某些实施方式中，步骤(f)中的所述稀释是至不超过约7.5
×
106个细胞/毫升。在其他某些实施方式中，如果细胞数量少于约10
±3×
106个细胞/毫升，则过滤是任选的。
[0312]
包含本文所述受刺激的分离的胎盘细胞的组合物(例如药物组合物)可以包含本文所述的任何分离的胎盘细胞。
[0313]
可以使用适合于施用细胞产品的其他可注射制剂。
[0314]
在一个实施方式中，药物组合物包含受刺激的分离的胎盘细胞，其基本上或完全是非母体来源的，即具有胎儿基因型；例如至少约90％、95％、98％、99％或约100％是非母体来源。例如，在一个实施方式中，药物组合物包含受刺激的分离的胎盘细胞的体，所述受刺激的分离的胎盘细胞是cd200
+
和hla-g-；cd73
+
、cd105
+
和cd200
+
；cd200
+
和oct-4
+
；cd73
+
、cd105
+
和hla-g-；cd73
+
和cd105
+
并且当所述胎盘细胞体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述分离的胎盘细胞体的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体；或oct-4
+
并且当所述胎盘细胞体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述分离的胎盘细胞体的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体；或上述的组合，其
中至少70％、80％、90％、95％或99％的所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在另一个实施方式中，药物组合物包含分离的胎盘细胞的体，所述分离的胎盘细胞是cd10
+
、cd105
+
和cd34-；cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
和cd34-；cd10
+
、cd105
+
、cd200
+
、cd34-以及cd90
+
或cd45-中的至少一个；cd10
+
、cd90
+
、cd105
+
、cd200
+
、cd34-和cd45-；cd10
+
、cd90
+
、cd105
+
、cd200
+
、cd34-和cd45-；cd200
+
和hla-g-；cd73
+
、cd105
+
和cd200
+
；cd200
+
和oct-4
+
；cd73
+
、cd105
+
和hla-g-；cd73
+
和cd105
+
并且当所述胎盘细胞体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体；oct-4
+
并且当所述胎盘细胞体在允许胚状体样体形成的条件下培养时促进包含所述分离的胎盘细胞的胎盘细胞体中形成一个或多个胚状体样体；或cd117-、cd133-、kdr-、cd80-、cd86-、hla-a,b,c
+
、hla-dp,dq,dr-和/或pdl1
+
中的一种或多种；或上述的组合，其中至少70％、80％、90％、95％或99％的所述分离的胎盘细胞是非母体来源。在具体实施方式中，药物组合物另外包含不从胎盘获得的干细胞。在另一个实施方式中，分离的胎盘干细胞被一种或多种促炎细胞因子刺激。在具体实施方式中，促炎细胞因子包括il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α和inf-γ中的一种或多种。在其他具体实施方式中，促炎细胞因子是il-ιβ。
[0315]
本文提供的组合物(例如药物组合物)中的分离的胎盘细胞可以包含源自单个供体或多个供体的胎盘细胞。分离的胎盘细胞可以与预期受体完全hla匹配，或者部分或完全hla错配。
[0316]
5.7.4包含分离的胎盘细胞的基质
[0317]
本文还提供了包含基质、水凝胶、支架等的组合物，其包含胎盘细胞或分离的胎盘细胞体。这样的组合物可以代替液体悬浮液中的细胞或除液体悬浮液中的细胞之外使用。
[0318]
本文所述受刺激的分离的胎盘细胞可以被接种到天然基质上，例如胎盘生物材料，例如羊膜材料。这样的羊膜材料可以是例如直接从哺乳动物胎盘解剖的羊膜；固定或热处理的羊膜，基本上干燥(即《20％h2o)的羊膜、绒毛膜，基本上干燥的绒毛膜、基本上干燥的羊膜和绒毛膜等。其上可以接种分离的胎盘细胞的优选的胎盘生物材料在hariri的美国申请公布no.2004/0048796中描述，其公开内容通过引用整体并入本文。
[0319]
本文所述受刺激的分离的胎盘细胞可以悬浮在适用于例如注射的水凝胶溶液中。用于这样的组合物的合适的水凝胶包括自组装肽，例如rad16。在一个实施方式中，可以允许包含细胞的水凝胶溶液例如在模具中硬化以形成基质，其具有分散在其中的细胞用于植入。在这样的基质中的分离的胎盘细胞也可以被培养，使得细胞在植入之前有丝分裂地扩增。水凝胶是例如通过共价键、离子键或氢键交联以产生捕获水分子以形成凝胶的三维开放晶格结构的有机聚合物(天然的或合成的)。水凝胶形成材料包括多糖，例如海藻酸盐及其盐、肽、聚磷腈(polyphosphazines)和聚丙烯酸酯，其是离子交联的，或者嵌段共聚物，例如聚环氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物等，其是分别通过温度或ph交联的。在一些实施方式中，水凝胶或基质是生物可降解的。
[0320]
在一些实施方式中，制剂包含原位可聚合凝胶(参见例如美国专利申请公布2002/0022676，其公开内容通过引用整体并入本文；anseth等.,j.control release,78(1-3):199-209(2002)；wang等,biomaterials,24(22):3969-80(2003)。
[0321]
在一些实施方式中，具有带电侧基的聚合物或其单价离子盐至少部分可溶于水性
溶液，例如水、缓冲盐溶液或含水醇溶液。具有可以与阳离子反应的酸性侧基的聚合物的实例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)和磺化聚合物，例如磺化聚苯乙烯。也可以使用由丙烯酸或甲基丙烯酸与乙烯基醚单体或聚合物反应形成的具有酸性侧基的共聚物。酸性基团的实例是羧酸基团、磺酸基团、卤代(优选氟代)醇基团、酚oh基团和酸性oh基团。
[0322]
在具体实施方式中，基质是毡(felt)，其可以是由从生物可吸收材料(例如pga、pla、pcl共聚物或共混物，或透明质酸)制成的复丝纱线构成。使用由卷边、切割、梳理和针刺组成的标准纺织品加工技术将纱线制成毡。在另一个优选的实施方式中，将本发明的细胞接种在可以是复合结构的泡沫支架上。此外，三维框架可以被模塑成有用的形状，例如待修复、替换或加强的体内特定结构。可以使用的支架的其他实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。无纺垫可以使用乙醇酸和乳酸(例如pga/pla)的合成可吸收共聚物组成的纤维形成(vicryl,ethicon,inc.,somerville,n.j.)。通过方法如冷冻干燥或冻干法(参见例如美国专利no.6,355,699)形成的由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(pcl/pga)共聚物组成的泡沫也可以用作支架。
[0323]
本文所述受刺激的分离的胎盘细胞或其共培养物可以接种到三维框架或支架上并植入体内。这样的框架可以与任何一种或多种生长因子、细胞、药物或例如刺激组织形成的其他组分组合植入。
[0324]
可以使用的支架的实例包括无纺垫、多孔泡沫或自组装肽。无纺垫可以使用由乙醇酸和乳酸(例如pga/pla)的合成可吸收共聚物组成的纤维形成(vicryl,ethicon,inc.,somerville,n.j.)。通过方法如冷冻干燥或冻干法(参见例如美国专利no.6,355,699)形成的由例如聚(ε-己内酯)/聚(乙醇酸)(pcl/pga)共聚物组成的泡沫也可以用作支架。
[0325]
在另一个实施方式中，受刺激的分离的胎盘细胞可以接种到毡上或与毡接触，所述毡可以例如由从生物可吸收材料(例如pga、pla、pcl共聚物或共混物，或透明质酸)制成的复丝纱线组成。
[0326]
在另一个实施方式中，本文提供的受刺激的分离的胎盘细胞可以接种到可以是复合结构的泡沫支架上。这样的泡沫支架可以被模塑成有用的形状，例如待修复、替换或加强的体内特定结构的一部分的形状。在一些实施方式中，在细胞接种之前，例如用0.1m乙酸处理框架，然后在聚赖氨酸、pbs和/或胶原中孵育，以增强细胞附着。可以改性基质的外表面以改善细胞附着或生长以及组织分化，例如通过血浆涂覆基质，或添加一种或多种蛋白(例如胶原蛋白、弹性纤维、网状纤维)、糖蛋白、葡萄糖胺聚糖(例如硫酸肝素、硫酸软骨素-4、硫酸软骨素-6、硫酸皮肤素、硫酸角蛋白等)、细胞基质和/或其他材料，例如但不限于明胶、藻酸盐、琼脂、琼脂糖和植物胶等。
[0327]
在一些实施方式中，支架包含使其不形成血栓的材料或被使其不形成血栓的材料处理。这些处理和材料也可以促进和维持内皮生长、迁移和细胞外基质沉积。这些材料和处理的实例包括但不限于天然材料，例如基底膜蛋白，如层粘连蛋白和iv型胶原蛋白，合成材料，如eptfe，和分段聚氨酯脲硅酮，例如purspan
tm
(the polymer technology group,inc.,berkeley,calif.)。支架也可以包含抗血栓剂如肝素；在用受刺激的分离的胎盘细胞接种之前，还可以处理支架以改变表面电荷(例如用血浆涂覆)。
[0328]
本文提供的受刺激的胎盘细胞(例如受刺激的pdac，例如il-1β刺激的pdac)也可
以接种到生理上可接受的陶瓷材料上或与其接触，其中所述陶瓷材料包括但不限于单-、二-、三-、α-三-、β-三-和四-磷酸钙，羟磷灰石，氟磷灰石，硫酸钙，氟化钙，氧化钙，碳酸钙，磷酸镁钙，生物活性玻璃，例如及其混合物。目前可商购的多孔生物相容性陶瓷材料包括(canmedica corp.,canada)、(merck biomaterial france,france)、(mathys,ag,bettlach,switzerland)，和矿化胶原骨移植产品，例如healos
tm
(depuy,inc.,raynham,ma)和rhakoss
tm
和(orthovita,malvern,pa.)。框架可以是天然和/或合成材料的混合物、共混物或复合物。
[0329]
在一个实施方式中，受刺激的分离的胎盘细胞以约0.5
×
106至约8
×
106个细胞/ml接种到合适的支架上或与合适的支架接触。
[0330]
5.8试剂盒
[0331]
在另一个方面，本文提供了适用于患有循环系统疾病或紊乱的个体的试剂盒，其包含在与剩余的试剂盒内容物分开的容器中的受刺激的pdac(例如上文第5.2节中描述的细胞(例如il-1β刺激的pdac))和使用说明。优选地，受刺激的胎盘细胞被提供在药学上可接受的溶液中，例如适用于病灶内施用的溶液或适用于静脉内施用的溶液。在某些实施方式中，受刺激的胎盘干细胞或受刺激的胎盘多能细胞是本文所述的cd10
+
、cd34-、cd105
+
胎盘细胞(例如cd10
+
、cd34-、cd105-、cd200
+
胎盘细胞或cd10
+
、cd34-、cd45-、cd90
+
、cd105
+
、cd200
+
胎盘细胞)中的任一种。
[0332]
在某些实施方式中，试剂盒包含促进受刺激的胎盘细胞递送至个体的一种或多种组分。例如，在某些实施方式中，试剂盒包含促进受刺激的胎盘细胞病灶内递送至个体的组分。在这样的实施方式中，试剂盒可以包含例如适用于将细胞递送至个体的注射器和针等。在这样的实施方式中，受刺激的胎盘细胞可以在试剂盒中被包含在袋中，或在一个或多个小瓶中。在某些其他实施方式中，试剂盒包含促进受刺激的胎盘细胞静脉内或动脉内递送至个体的组分。在这样的实施方式中，受刺激的胎盘细胞可以被包含在例如瓶子或袋子(例如能够含有至多约1.5l含细胞溶液的血袋或类似袋子)内，并且试剂盒另外包含适用于递送细胞至个体的管和针。
[0333]
此外，试剂盒可以包含减轻个体的疼痛或炎症的一种或多种化合物(例如镇痛的甾体或非甾体抗炎化合物等)。试剂盒还可以包含抗细菌或抗病毒化合物(例如一种或多种抗生素)、减轻个体焦虑的化合物(例如阿普唑仑(alaprazolam))、降低个体免疫应答的化合物(例如环孢菌素a)、抗组胺药(苯海拉明、氯雷他定、地氯雷他定、喹硫平、非索非那定、西替利嗪、异丙嗪、氯苯那敏(chlorepheniramine)、左西替利嗪、西咪替丁、法莫替丁、雷尼替丁、尼扎替丁、罗沙替丁、拉呋替丁等)。
[0334]
此外，试剂盒可以包含一次性用品，例如无菌擦拭物、一次性纸制品、手套等，其促进使个体准备好接受递送，或者降低个体由于被施用受刺激的胎盘细胞而感染的可能性。
[0335]
实施例
[0336]
6.1实施例1：分泌的pdac因子对血管细胞存活、增殖和形态的影响
[0337]
6.1.1pdac生长因子和细胞因子分泌
[0338]
解冻胎盘衍生粘附干细胞(pdac)的冷冻等分试样并在完全生长培养基(补充有10％胎牛血清的dulbecco改良eagle培养基[dmem])中扩增。然后将培养的pdac在无血清dmem中孵育24小时，并收集pdac细胞条件培养基样品(p-cm)。使用两个map免疫测定板(人血管生成/生长因子板1和人细胞因子/趋化因子板)(millipore)测定p-cm中的分泌营养因子的浓度。这个实验的结果如图1所示。确定p-cm含有可检测水平的各种营养血管生成因子，包括il-8、mcp-1、vegf-a、卵泡抑素、gro、hgf和il-6，表明培养的pdac能够分泌血管生成因子。
[0339]
6.1.2分泌的pdac因子改变huvec存活和管形成
[0340]
解冻人血管内皮细胞(huvec)并在完全内皮生长培养基(egm
tm-2)(lonza)中的纤连蛋白涂覆的平板上铺板过夜。huvec在无血清内皮基底培养基(ebm
tm-2)(lonza)中培养6小时，随后在pdac细胞条件培养基样品(p-cm)中在p-cm浓度为0.104ml/cm2的培养瓶中孵育16小时。通过hoechst染(invitrogen)，随后使用incell analyzer 2000(ge healthcare)进行定量图像分析，测定经处理的huvec细胞的生活力。如图2a所示，当与仅用dmem处理的huvec相比，用p-cm孵育的huvec具有显著更高的增殖/存活率。
[0341]
在单独的实验中，huvec在ebm
tm-2中血清饥饿3小时并收获。在p-cm或dmem单独存在的情况下，将huvec再铺板在预涂覆clutrex减少的生长因子(growth factor-reduced cultrex)(trevigen)的平板上。然后在incucyte zoom(essen bioscience)上分析再铺板的huvec 16小时以测定huvec的管形成的程度。使用imagej，使用血管生成分析仪工具包对图像进行分析。p-cm处理的huvec比对照huvec形成显著更长的网络(图2b)和显著更多的管(图2c)。这些数据表明p-cm促进血管生成的血管细胞模型中的管形成和分支。
[0342]
6.2实施例2：分泌的pdac因子影响huvec细胞信号传导和表达
[0343]
6.2.1pdac条件培养基改变huvec信号传导通路
[0344]
如上文第6.1节所述，解冻huvec并培养两天。然后将huvec在无血清ebm
tm-2中血清饥饿6小时，随后在存在或不存在p-cm的情况下培养5、15或30分钟。使用map多通路细胞信号传导多重分析(emd millipore)评估p-cm对huvec细胞信号传导的影响。
[0345]
如图3所示，在所有测试时间点，与培养物培养基对照("media ctrl"泳道)相比，用p-cm处理的huvec("tx"泳道)显示明显更高水平的磷酸化mek、磷酸化erk1/2、磷酸化akt和磷酸化stat3水平。这些结果表明用pdac条件培养基处理的血管细胞可以促进已知参与细胞增殖(mek1、erk1/2)、存活(akt)和分支(stat3)的不同细胞信号传递通路。
[0346]
6.2.2pdac条件培养基改变huvec基因表达
[0347]
如上文第6.2.1节所述，培养huvec并进行血清饥饿。然后将huvec在p-cm存在下培养4、24或48小时，并收集用于分析。根据制造商的方案使用taqman human vegf pathway arrays和quantstudio 12k实时pcr系统(life technologies)测量vegf基因表达。如图4所示，在p-cm中培养huvec导致在48小时时程内诱导众多基因。参与信号转导、增殖和存活(上排)；细胞运动性、结构和完整性(中间排)；和一氧化氮合成和血管生成(下排)的基因在经p-cm处理的huvec("p-cm")中均相对于培养基处理的对照("sf ebm-2")增加。图4中显示的基因根据其功能在下表1中列出。
[0348]
表1：由pdac条件培养基上调的huvec基因
[0349][0350]
6.3实施例3：il-1β对分泌的pdac营养因子的作用
[0351]
pdac在生长培养基中培养24小时。将il-1β以10pg/ml至10,000pg/ml范围的浓度加入到生长培养基中，并且使用两个map免疫测定板(人血管生成/生长因子板1和人细胞因子/趋化因子板)(millipore)测定分泌的pdac因子。
[0352]
如图5所示，用il-1β刺激的pdac以剂量依赖性方式产生多种营养因子。这些因子包括gm-csf、g-csf、il-6、gro、mcp-1、卵泡抑素和il-8。相反地，在用il-1β刺激pdac后，多种其他营养因子的产生没有改变，表明il-1β促进培养的pdac中的特定亚组的营养因子的分泌。
[0353]
6.4实施例4：il-1β刺激的pdac条件培养基改变huvec细胞信号传导
[0354]
如图6所示，与dmem单独存在或未受刺激的p-cm存在下培养的细胞相比，在il-1β刺激的p-cm存在下培养的huvec显示更高水平的信号传导。重要的是，掺入il-1β的p-cm也导致比il-1β刺激的p-cm更低的信号传导，表明受刺激的p-cm对huvec的影响不直接通过il-1β。对参与增殖(mek1、erk1/2)和分支形态(stat3)的细胞信号传导通路也观察到类似的趋势。总的来说，这些数据表明用促炎细胞因子刺激pdac可以促进内皮细胞中的增殖和形态信号传导通路。
[0355]
6.5实施例5：il-1β刺激的影响通过肝生长因子通路的信号
[0356]
pdac分泌可能有助于对p-cm观察到的增殖作用的许多可溶性因子。这些因子之一，肝生长因子(hgf)，是由pdac组成性分泌的。此外，huvec表达hgf受体(hgfr，也称为c-met)。为了确定hgf信号传导通路在p-cm的促血管生成作用中的角，il-1β刺激的p-cm与500ng/ml抗hgf中和抗体一起孵育40分钟(abcam)，然后被加入到血清饥饿的huvec。类似地，在上文第6.2.1节描述的六小时血清饥饿步骤期间，huvec与20nm pha665752(hgfr/c-met抑制剂)一起孵育。
[0357]
如图7所示，用抗hgf中和抗体或pha66572阻断hgf信号传导完全逆转了p-cm诱导的mek、erk1/2和stat3信号传导通路的增加(图7a-c)，并部分逆转了在akt信号传导通路方面的这种效果(图7d)。这些数据表明在培养的huvec中p-cm介导的增殖和血管生成通路的诱导至少部分地通过肝生长因子信号传导通路介导。
[0358]
6.6实施例6：糖尿病足溃疡方案
[0359]
用已经被il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞患有糖尿病足溃疡(dfu)与周边动脉疾病(pad)、年龄为18-80的受试者。在第1天(的第一天)和第8天用以下剂量肌内施用il-ιβ刺激的胎盘干细胞：(i)3
×
106il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞；(ii)1
×
107il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞；或(iii)3
×
107il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞。
[0360]
临床终点
[0361]
用于dfu的il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞的效力的主要临床终点可以是被的dfu或多处dfu的闭合。溃疡闭合可以通过不存在引流或对敷料的需要的皮肤闭合代表。完全闭合可以通过在确定闭合后溃疡闭合保留至少四周代表。溃疡闭合可以在用胎盘干细胞后三个月评估。
[0362]
用于dfu的il-1β刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞的效力的其他临床终点可以包括：(i)不良事件的频率和严重度的降低，其可以在后至多24个月评估；(ii)到溃疡闭合的时间，其可以在后6个月评估；(ii)踝臂指数(abi)的改善，其可在后6个月评估；(iii)趾肱指数(tbi)的改善，其可在后6个月评估；(iv)dfu的大小和数量减少，其可在后至多24个月评估；(v)经皮氧水平的改善，其可在后6个月评估；(vi)脉搏容积记录的改善，其可在后6个月评估；(vii)到大截肢的时间，其可在后至多24个月评估；(viii)wagner评分量表的改善，其可在后至多24个月评估；(ix)卢瑟福标准的改善，其可在后6个月评估；和(x)腿部静息痛评分的改善，其可在后至多24个月评估；和(xi)如通过以下评估的受试者的生活质量的改善：(i)36项简易格式健康调查(sf-36)(参见例如ware等,medical care 30(6):473-483)；(ii)糖尿病足溃疡量表简易格式(dfs-sf)(参见例如bann等.,pharmacoeconomics,2003,21(17):1277-90)；(iii)患者全面印象变化量表(参见例如kamper等.,j.man.manip.ther.,2009,17(3):163-170)和/或(iv)euroqol5d(eq-5d
tm
)量表。
[0363]
受试者选择
[0364]
可以使用以下合格标准选择认为使用il-1β刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞的对其适合的受试者。在决定这个方案是否适合于特定受试者时，考虑所有相关的医疗和非医疗情况。
[0365]
受试者应符合以下条件以具备接受方案的资格：
[0366]
·
男性和女性，至少18岁或以上。
[0367]
·
在进行任何与研究有关的评估/程序之前，理解并自愿签署知情同意书。
[0368]
·
能够坚持研究访问时间表和其他协议要求。
[0369]
·
糖尿病1型或2型。
[0370]
·
超过一个月持续时间的wagner评分量表为1级(仅全层)或2级严重度的糖尿病足溃疡，其没有充分地应答传统溃疡，除了存在于脚趾上以外，尺寸为至少1cm2。溃疡指数(ulcer index)的最大损伤大小范围为≤6.25cm2。溃疡指数的测量要在筛选访问时在清创(如有必要)后评估和测量。
[0371]
·
符合在具有溃疡指数的足部中的以下动脉供血不足标准中的一项或多项的受试者：
[0372]
a.abi≥0.4且≤0.8或tbi》0.30且≤0.65的周围动脉疾病。
[0373]
b.经皮氧(tcpo2)测量值在20-40mmhg之间。用tcpo2测量的区域应该没有水肿或变厚的皮肤。
[0374]
·
在筛选访问后的3个月内没有计划的血管重建或截肢。
[0375]
·
在再灌注干预失败后至少14天以及再灌注干预成功至少30天后才能开始筛选。
[0376]
·
受试者应接受需要持续护理的高血压和糖尿病以及任何其他慢性医学病症的适当药物。
[0377]
·
具有生育能力的女性(fcbp)必须在筛选时进行阴性血清妊娠试验和在采用研究疗法的前进行阴性尿妊娠试验。此外，性活跃的fcbp必须同意同时使用以下适当形式的避孕方法中的两种，例如：口服、可注射或可植入的荷尔蒙避孕；输卵管结扎术；iud；在研究期间和随访期间采用杀精子剂或输精管切除伴侣的屏障避孕。
[0378]
·
男性(包括已经进行输精管切除术的那些)必须同意在研究期间和随访期间在与fcbp的生殖性行为中保证避孕(乳胶避孕套)时使用屏障避孕(乳胶避孕套)。
[0379]
具有以下情况中的一种或多种的受试者可以从方案中排除：
[0380]
·
会阻止受试者参与研究的任何重大医疗状况、实验室异常情况或精神疾病。
[0381]
·
包括实验室异常情况的存在的任何情况，其使受试者处于不可接受的风险中，如果他或她参加研究。
[0382]
·
任何使解释研究数据的能力有疑问的情况。
[0383]
·
已知对人类免疫缺陷病毒，丙型肝炎病毒，或乙型肝炎病毒的活跃感染为阳性。
[0384]
·
怀孕或哺乳女性。
[0385]
·
筛选时体重指数》40的受试者。
[0386]
·
筛选时ast(sgot)或alt(sgpt)》2.5
×
正常上限(uln)。
[0387]
·
筛选时，使用肾脏疾病研究饮食改良等式(modification of diet in renal disease study equation)(levey，2006)计算的估计肾小球滤过率(egfr)《30ml/min/1.73m2，或过去一年中egfr下降》15ml/min/1.73m2的历史。
[0388]
·
筛选时碱性磷酸酶》2.5
×
uln。
[0389]
·
筛选时胆红素水平》2mg/dl(除非受试者患有已知的吉尔伯特氏病)。
[0390]
·
未经的慢性感染或用全身性抗生素对任何感染的，包括溃疡部位，在ip给药前一周内必须不采用抗生素。
[0391]
·
在指数溃疡(index ulcer)处或附近的活跃的骨髓炎、感染或蜂窝组织炎。
[0392]
·
在筛选/试运行期内，已经大小减少或增加≥30％的指数溃疡。
[0393]
·
由于肢体缺血而导致的静息痛。
[0394]
·
具有指数溃疡的足部中经皮氧测量≤20mmhg。
[0395]
·
足跟溃疡。
[0396]
·
不受控制的高血压(定义为在筛选过程中，在受试者坐下且休息至少5分钟时进行的2次独立测量时舒张血压》100mmhg或收缩血压》180mmhg)。
[0397]
·
控制不佳的糖尿病(血红蛋白alc》12％或筛查血清葡萄糖≥300mg/dl)。
[0398]
·
未的增殖性视网膜病变。
[0399]
·
在签署知情同意书(icf)之前的6个月内恶性室性心律失常、ccs iii-iv型心绞痛、心肌梗死/经皮冠状介入(pci)/冠状动脉旁路移植术(cabg)的病史，在接下来的3个月内待定的冠状血运重建，在签署icf之前6个月内的短暂性缺血发作/脑血管意外，和/或纽约心脏协会[nyha]iii或iv期充血性心力衰竭。
[0400]
·
异常ecg：签署icf前3个月内的新的右束支传导阻滞(bbb)≥120msec。
[0401]
·
不受控制的高凝。
[0402]
·
签署icf时，由于伴随的疾病，寿命期望不到2年。
[0403]
·
研究者认为，受试者不适合于细胞疗法。
[0404]
·
在签署icf之前5年内的恶性病史，除了现在认为被治愈的皮肤的基底细胞或鳞状细胞癌或远端癌症病史，或者阳性巴氏涂片，且具有后续阴性随访。
[0405]
·
对产品制剂的任何组分(包括牛或猪产品、葡聚糖40和二甲基亚砜[dmso])的过敏症历史。
[0406]
·
受试者已经在采用研究疗法的之前90天(或5个半衰期，以较长者为准)内接受研究性试剂(未经美国食品药品管理局(fda)批准用于任何适应症的销售用途的试剂或装置)，或已经计划在本研究完成之前参与另一项性研究。
[0407]
·
受试者已经接受在先的研究性基因或细胞疗法。
[0408]
临床结果
[0409]
如果证实一个或多个临床终点的改善，则确认il-1β刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞在dfu中的功效。
[0410]
6.7实施例7：替代性dfu方案
[0411]
用il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞患有糖尿病足溃疡(dfu)与周围动脉疾病(pad)、至少18岁的受试者。受试者组i：在第1天(的第一天)、第29天和第57天肌内施用3
×
106个il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞。受试者组ii：在第1天(的第一天)、第29天和第57天肌内施用3
×
107个il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞。受试者组iii：在第1天(的第一天)、第29天和第57天肌内施用安慰剂。
[0412]
临床终点
[0413]
用于dfu的il-ιβ刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞的效力的主要临床终点可以是肢体血管功能的改善，如通过测量踝臂指数(abi)；经皮血氧定量法(tcom)、近红外光谱、氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(fgd pet/ct)、多普勒超声、磁共振成像(mri)、血管造影和/或血氧定量法评估的。肢体血管功能的改善可以在后约1年评估。
[0414]
用于dfu的il-1β刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞的效力的其他临床终点可以包括：(i)指数溃疡的溃疡闭合和完全创伤闭合(溃疡闭合可以通过不存在引流或对敷料的需要的皮肤闭合代表；完全闭合可以通过在确定闭合后溃疡闭合保留至少四周代表)，其可以在后约一年评估；(ii)不良事件的频率和严重度的减少，其可以在后约一年评估；(iii)所有溃疡的数量、大小的减少和指数溃疡的50％闭合，其可以在后约1年评估；(iv)到经的腿的大截肢的时间的减少，其可以在后约一年评估；(v)wagner评分量表的改善，其可以在后约一年评估；(vi)卢瑟福标准的改善，其可以在后约一年评估；(vii)腿部静息痛评分的改善，其可以在后约一年评估；和(viii)如使用患者神经病全面印象变化(patient global impression of change in neuropathy，pgicn)评估的受试者生活质量的改善。
[0415]
受试者选择
[0416]
可以使用以下合格标准选择认为使用il-1β刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎
盘干细胞的对其适合的受试者。在决定这个方案是否适合于特定受试者时，考虑所有相关的医疗和非医疗情况。
[0417]
受试者应符合以下条件以具备接受方案的资格：
[0418]
·
男性和女性，至少18岁或以上。
[0419]
·
糖尿病1型或2型。
[0420]
·
超过一个月持续时间的wagner评分量表为1级(仅全层)或2级严重度的糖尿病足溃疡，其没有充分地应答传统溃疡。
[0421]
·
符合在具有溃疡指数的足部中的以下动脉供血不足标准中的一项或多项的受试者：
[0422]
a.abi≥0.4且≤0.8或tbi≥0.30且≤0.65的周围动脉疾病。
[0423]
b.经皮氧(tcpo2)测量值在20-40mmhg之间。
[0424]
·
在筛选访问后的3个月内没有计划的血管重建或截肢。
[0425]
·
在再灌注干预失败后至少14天以及再灌注干预成功至少30天后才能开始给药。
[0426]
具有以下情况中的一种或多种的受试者可以从方案中排除：
[0427]
·
会阻止受试者参与研究的任何重大医疗状况、实验室异常情况或精神疾病。
[0428]
·
包括实验室异常情况的存在的任何情况，其使受试者处于不可接受的风险中，如果他或她参加研究。
[0429]
·
怀孕或哺乳女性。
[0430]
·
筛选时体重指数》40的受试者。
[0431]
·
筛选时ast(sgot)或alt(sgpt)》2.5
×
正常上限(uln)。
[0432]
·
筛选时，使用肾脏疾病研究饮食改良等式(modification of diet in renal disease study equation)(levey，2006)计算的估计肾小球滤过率(egfr)《30ml/min/1.73m2，或过去一年中egfr下降》15ml/min/1.73m2的历史。
[0433]
·
未经的慢性感染或用全身性抗生素对任何感染的，包括溃疡部位，在ip给药前一周内必须不采用抗生素。
[0434]
·
在指数溃疡处或附近的已知的骨髓炎、感染或蜂窝组织炎。
[0435]
·
由于肢体缺血而导致的肢体静息痛。
[0436]
·
不受控制的高血压(定义为在筛选过程中，在受试者坐下且休息至少5分钟时进行的2次独立测量时舒张血压》100mmhg或收缩血压》180mmhg)。
[0437]
·
控制不佳的糖尿病(血红蛋白alc》12％或筛查血清葡萄糖≥300mg/dl)。
[0438]
·
未的增殖性视网膜病变。
[0439]
·
在签署知情同意书(icf)之前的6个月内恶性室性心律失常、ccs iii-iv型心绞痛、心肌梗死/经皮冠状介入(pci)/冠状动脉旁路移植术(cabg)的病史，在接下来的3个月内待定的冠状血运重建，在签署icf之前6个月内的短暂性缺血发作/脑血管意外，和/或纽约心脏协会[nyha]iii或iv期充血性心力衰竭。
[0440]
·
异常ecg：签署icf前3个月内的新的右束支传导阻滞(bbb)≥120msec。
[0441]
·
不受控制的高凝。
[0442]
·
签署icf时，由于伴随的疾病，寿命期望不到2年。
[0443]
·
研究者认为，受试者不适合于细胞疗法。
[0444]
·
在签署icf之前5年内的恶性病史，除了现在认为被治愈的皮肤的基底细胞或鳞状细胞癌或远端癌症病史，或者阳性巴氏涂片，且具有后续阴性随访。
[0445]
·
对产品制剂的任何组分(包括牛或猪产品、葡聚糖40和二甲基亚砜[dmso])的过敏症历史。
[0446]
·
受试者已经在采用研究疗法的之前90天(或5个半衰期，以较长者为准)内接受研究性试剂(未经美国食品药品管理局(fda)批准用于任何适应症的销售用途的试剂或装置)，或已经计划在本研究完成之前参与另一项性研究。
[0447]
·
受试者已经接受在先的研究性基因或细胞疗法。
[0448]
临床结果
[0449]
如果证实一个或多个临床终点的改善，则确认il-1β刺激的cd10
+
、cd34-、cd105
+
、cd200
+
胎盘干细胞在dfu中的功效。

技术特征：

1.一种分离的受刺激的胎盘衍生粘附细胞，其中所述细胞粘附于组织培养塑料，并且其中所述细胞是cd10
+
、cd34-、cd105
+
和cd200
+
，其中所述细胞已经在体外与一种或多种促炎细胞因子接触，并且其中所述细胞(1)促进内皮细胞的增殖；(2)促进内皮细胞体中的芽或管状结构的形成；或(3)促进内皮细胞的迁移。2.权利要求1所述的分离的细胞，其中所述细胞是如通过流式细胞术确定的cd10
+
、cd34-、cd105
+
和cd200
+
。3.权利要求1所述的分离的细胞，其中所述促炎细胞因子是il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α或inf-γ中的一种或多种。4.权利要求3所述的分离的细胞，其中所述促炎细胞因子是il-1β。5.权利要求1-4中任一项所述的分离的细胞，其中所述细胞以比未与所述一种或多种促炎细胞因子接触的分离的胎盘衍生粘附细胞更高的水平分泌营养因子。6.权利要求5所述的分离的细胞，其中所述营养因子包括gm-csf、g-csf、il-6、gro、mcp-1、卵泡抑素或il-8中的至少一种。7.权利要求5所述的分离的细胞，其中所述营养因子包括gm-csf、g-csf、il-6、gro、mcp-1、卵泡抑素和il-8。8.一种分离的细胞体，其包含权利要求1-7中任一项所述的细胞。9.权利要求8所述的分离的细胞体，其中所述体中至少50％的所述细胞是权利要求1所述的细胞。10.权利要求8所述的分离的细胞体，其中所述体中至少90％的所述细胞是权利要求1所述的细胞。11.一种患有循环系统疾病或紊乱的个体的方法，其包括向所述个体施用权利要求1-7中任一项所述的细胞的体。12.权利要求11所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用足以可检测地改善所述疾病或紊乱的一种或多种症状的量和时间的权利要求1所述的细胞的体。13.权利要求11或12所述的方法，其中所述疾病或紊乱是糖尿病足溃疡(dfu)。14.权利要求13所述的方法，其中所述dfu由外周动脉疾病(pad)引起和/或与其相关。15.权利要求11所述的方法，其中所述循环系统疾病或紊乱是心脏疾病或损伤。16.权利要求11所述的方法，其中所述疾病或紊乱是肢体中或周围的血流中断。17.权利要求16所述的方法，其中肢体中或周围的所述血流中断是由外周动脉疾病(pad)或外周血管疾病(pvd)引起。18.权利要求11至13所述的方法，其中所述疾病或紊乱是外周动脉疾病(pad)。19.权利要求11至13所述的方法，其中所述疾病或紊乱是外周血管疾病(pvd)。20.权利要求11至19所述的方法，其中所述方法包括在第1天和第8天以(i)3
×
106；(ii)1
×
107；或(iii)3
×
107个所述细胞的浓度向所述个体肌内施用权利要求1所述的细胞的体。21.权利要求11至19所述的方法，其中所述方法包括在第1天、第29天和第57天以3
×
106或3
×
107个所述细胞的浓度向所述个体肌内施用权利要求1所述的细胞的体。22.权利要求11至21所述的方法，其中与施用胎盘衍生粘附细胞之前的所述个体相比，心脏功能的一个或多个征象被可检测地改善，其中心脏功能的所述征象是胸心输出量
(co)、心脏指数(ci)、肺动脉楔压(pawp)、心脏指数(ci)、缩短分数％(％fs)、射血分数(ef)、左心室射血分数(lvef)；左心室舒张末期内径(lvedd)、左心室收缩末期内径(lvesd)、收缩力(dp/dt)、心房或心室功能降低、泵送效率增加、泵送效率损失速率降低、血液动力学功能损失减少或心肌病相关并发症减少。23.一种患有循环系统疾病或紊乱的个体的方法，其包括向所述个体施用权利要求1-8中任一项所述的细胞的体，其中与施用胎盘衍生粘附细胞之前的所述个体相比，心脏功能的一个或多个征象被可检测地改善，其中心脏功能的所述征象是胸心输出量(co)、心脏指数(ci)、肺动脉楔压(pawp)、心脏指数(ci)、缩短分数％(％fs)、射血分数(ef)、左心室射血分数(lvef)；左心室舒张末期内径(lvedd)、左心室收缩末期内径(lvesd)、收缩力(dp/dt)、心房或心室功能降低、泵送效率增加、泵送效率损失速率降低、血液动力学功能损失减少或心肌病相关并发症减少。24.权利要求23所述的方法，其中所述方法包括向所述个体施用足以可检测地改善心脏功能的一个或多个所述征象的量和时间的权利要求1-8中任一项所述的细胞的体。25.权利要求23或24所述的方法，其中所述循环系统疾病或紊乱是心脏疾病或损伤。26.一种具有肢体中或周围的血流中断的个体的方法，其包括施用有效量的权利要求1-8中任一项所述的细胞的体。27.权利要求26所述的方法，其中所述肢体中或周围的所述血流中断是外周动脉疾病(pad)或外周血管疾病(pvd)。28.权利要求11至27中任一项所述的方法，其中所述方法还包括施用另外的剂。29.权利要求11至28中任一项所述的方法，其中所述施用是通过移植，植入，注射，输注或经导管递送。30.一种生产受刺激的胎盘衍生粘附细胞的方法，其中所述细胞是cd10
+
、cd34-、cd105
+
和cd200
+
，所述方法包括使胎盘衍生粘附细胞与一种或多种促炎细胞因子在体外接触。31.权利要求30所述的方法，其中所述促炎细胞因子是il-1α、il-1β、il-6、il-8、il-18、tnf-α或inf-γ中的一种或多种。32.权利要求30或31所述的方法，其中所述促炎细胞因子是il-ιβ。33.一种药物组合物，其包含权利要求1-8中任一项所述的细胞的体和药学上可接受的载体。34.一种部件试剂盒，其包含权利要求1-8中任一项所述的细胞的体。

技术总结

本文提供了受刺激的胎盘干细胞以及使用受刺激的胎盘细胞患有循环系统疾病或紊乱的个体的方法。本发明还提供了使用这种受刺激的细胞或包含这种受刺激的细胞的细胞诱导血管生成的方法。导血管生成的方法。

技术研发人员：

K

受保护的技术使用者：

细胞结构公司

技术研发日：

2016.05.25

技术公布日：

2022/12/16