一种香豆素前药及其制备方法和用途

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1.本发明属于药物合成领域，具体涉及一种香豆素前药及其制备方法和用途。

背景技术：

2.荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer)也称共振能量转移(resonance energy transfer)，简称fret，是指在一定范围内的两个荧光团(其中一个荧光团为能量供体，另一个荧光团为能量受体)，在吸收一定频率的光后，处于激发态的能量供体通过适当的偶极-偶极相互作用以非辐射的形式将能量转移给临近的能量受体分子的过程。在fret过程中，处于激发态的供体分子在回到基态时所释放的能量必须同受体分子从基态跃迁至激发态所需的能量相同。选择常用的香豆素作为能量供体，通过刚性哌嗪环与罗丹明连接，当羧基是封闭的螺内酯形式时，fret关闭；当羧基处于自由状态时，香豆素的发射光谱位于罗丹明的激发光谱范围内，fret打开，在一定波长的光的激发下，体系中供体由基态跃迁至激发态，随后激发态的能量转移给受体，从而使受体跃迁至激发态，而供体回到基态，在这个过程中，供体的荧光信号减弱而受体的荧光信号增强，实现比率型的荧光信号变化。
3.近年来的研究表明硫化氢(h2s)作为一种重要的内源性气体信号分子，具有抗炎、抗凋亡活性等细胞保护作用，在生命活动中扮演着重要的角，例如，h2s能够保护中枢神经系统，减轻心血管系统氧化应激和调节血压稳态等等。在复杂的细胞微环境中，通过胱硫醚裂解酶产生的h2s可以抑制一些重要的促炎转录因子，如nf-κb和磷酸二酯酶(pde)，从而抑制炎症因子的产生，发挥抗炎作用。h2s供体可以外源性提供h2s，从而调节细胞内h2s水平，对由炎症引起的疾病有重要影响。因此，构建可靠的h2s供体对研究其在生物体系中的功能具有重要的意义。羰基硫化物(cos)是一种气体分子，在化学生物学中具有独特的应用，已有研究表明cos可在全身广泛存在的碳酸酐酶(ca)作用下水解为h2s，因此，通过采用释放cos并进一步在ca的作用下转化为h2s的策略，可以为选择性释放h2s提供新的途径。

技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种可靠的h2s供体—香豆素前药以及该前药的制备方法和用途。
5.本发明上述目的通过如下技术方案实现：
6.一种香豆素前药，其化学结构如式(1)所示：
7.8.或该前药药学上可接受的盐、对映异构体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶体。
9.一种上述香豆素前药的制备方法，包括如下步骤：
10.(1)向间二苯酚和邻苯二甲酸酐混合物中加入三氯化铝，室温搅拌，经傅-克酰基化反应得到化合物(ⅰ)；
11.(2)向化合物(ⅰ)与间羟基苯基哌嗪的混合物中加入三氟乙酸，回流反应得到化合物(ⅱ)；
12.(3)向7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，再加入化合物(ⅱ)，发生酰胺缩合反应再经过柱层析得到化合物(ⅲ)；
13.(4)将对硝基苯酚的氢氧化钠溶液加入到硫光气中，在冰浴条件下反应得到化合物(ⅳ)；
14.(5)4-二甲氨基苯甲醛经硼氢化钠还原得到化合物(
ⅴ
)；
15.(6)化合物(ⅳ)与化合物(
ⅴ
)在碱性环境中缩合反应再经过柱层析得到化合物(ⅵ)；
16.(7)以化合物(ⅲ)和化合物(ⅵ)为原料，在碱性环境中经酯交换反应再经过柱层析得到所示化合物1；
17.上述步骤(1)至(7)的反应路线以及化合物(ⅰ)至(ⅵ)的结构如下：
[0018][0019]
优选地，步骤(1)中反应溶剂为甲苯或苯。
[0020]
优选地，步骤(3)中柱层析的洗脱剂为体积比40:1的二氯甲烷/甲醇混合溶剂。
[0021]
优选地，步骤(4)中氢氧化钠溶液的质量浓度为5％，反应溶剂为氯仿。
[0022]
优选地，步骤(6)中反应溶剂为无水的n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃；碱性环境由三乙胺、n,n-二异丙基乙胺或吡啶提供；柱层析的洗脱剂为体积比50:1的石油醚/乙酸乙酯。
[0023]
优选地，步骤(7)中反应溶剂为无水的n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃；碱性环境由三乙胺、n,n-二异丙基乙胺或吡啶提供；柱层析的洗脱剂为体积比1:1的石油醚/乙酸乙酯。
[0024]
上述香豆素前药用于光照条件下逐渐释放出香豆素-罗丹明体系实现荧光信号比率型变化的用途；其中，光照波长为405nm。
[0025]
上述香豆素前药用作h2s供体的用途。
[0026]
优选地，所述香豆素前药在405nm光照触发下释放出羰基硫化物，经碳酸酐酶水解生成h2s，构建新型光控释放的硫化氢供体分子。
[0027]
有益效果：
[0028]
本发明提供的香豆素前药在适当的条件下可以释放出h2s气体。该前药在405nm光照触发下释放出cos，经ca水解生成了h2s，可以用于构建新型光控释放的硫化氢供体分子。
附图说明
[0029]
图1为化合物1在405nm光照下(a)不同时刻的荧光光谱图和(b)荧光强度比值i525/i470；图2中(a)为h2s释放标准曲线，(b)为化合物1在光照下检测到释放的h2s。
具体实施方式
[0030]
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
[0031]
除另有说明外，从商业供应商处购买的所有化学品均按原样使用。所有溶剂均为试剂级，必要时通过标准方法纯化和干燥。所有反应均在可视化的硅胶板(gf-254)上进行薄层谱(tlc)监测。在brukeravance-300仪器上测定1h nmr谱图，使用cdcl3、cd3od或dmso-d6为溶剂，记录的化学位移(δ)为四甲基硅烷(tms)的百万分率(ppm)。质谱由advion expression lcms型质谱仪(esi-ms)、water q-tof型质谱仪(hrms)测定。
[0032]
实施例1：
[0033]
2-(2,4-二羟基苯甲酰基)苯甲酸(i)的合成
[0034][0035]
在氮气保护下，将间二苯酚(1.10g，10.0mmol)和邻苯二甲酸酐(1.48g，10.0mmol)溶于50ml硝基苯中，然后加入无水三氯化铝(2.93g，22.0mmol)，在室温下搅拌12小时。tlc监测反应完全后，将反应混合物边搅拌边倒入30ml正己烷和40ml 0.5m盐酸的两相溶液中。体系搅拌2小时后，析出橙黄沉淀，过滤后得到粗产物。然后，使用二氯甲烷/甲醇(15:1，v/v)作为洗脱剂，通过柱层析纯化，得到橙固体化合物(ⅰ)(2.50g，97％)。
[0036]
产物结构表征如下：
[0037]1h nmr(300mhz,methanol-d4)δ8.13(dd,j＝7.7,1.5hz,1h),7.75
–
7.63(m,2h),7.41(dd,j＝7.4,1.4hz,1h),6.97(d,j＝8.8hz,1h),6.36(d,j＝2.4hz,1h),6.26(dd,j＝8.8,2.3hz,1h)；esi-m/z:259.05[m+h]
+
.
[0038]
实施例2：
[0039]
2-(3-氧代-6-哌嗪-1-基)-3h-黄原-9-基)苯甲酸(ii)的合成：
[0040][0041]
将化合物(i)(2.50g，9.68mmol)溶解在40ml三氟乙酸中，然后将间羟基苯基哌嗪(1.73g，9.68mmol)加入上述混合物中，将反应混合物加热至回流36小时。tlc监测反应完全后，减压蒸出溶剂，通过柱层析进一步纯化，二氯甲烷/甲醇(10:1，v/v)为洗脱剂，得到红固体化合物(ii)(2.91g，75％)。
[0042]
产物结构表征如下：
[0043]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.16(s,1h),8.76(s,1h),8.00(d,j＝7.4hz,1h),7.83
–
7.70(m,2h),7.25(d,j＝7.4hz,1h),6.91(d,j＝2.4hz,1h),6.78(dd,j＝8.9,2.5hz,1h),6.68(d,j＝1.4hz,1h),6.62
–
6.54(m,3h),3.47(s,4h),3.44(s,4h).esi-m/z:401.14[m+h]
+
.
[0044]
实施例3：
[0045]
2-(6-(4-(7-二乙氨基)-2-氧代-2h-铬-3-羰基)哌嗪-1-基)-3-氧代-3h-黄原-9-基)苯甲酸(ⅲ)的合成：
[0046][0047]
在氮气保护下，将7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸(1.52g，5.83mmol)溶解在60ml无水n，n-二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.09g，7.00mmol)和4-二甲氨基吡啶(0.35g，2.91mmol)，在室温下将混合物搅拌30分钟之后添加化合物(ⅱ)(2.80g，7mmol)并搅拌过夜。tlc监测反应完全后，反应液加水淬灭，乙酸乙酯萃取三次，有机相依次用饱和碳酸氢钠溶液、饱和氯化铵溶液、饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，粗产物通过柱层析进一步纯化，二氯甲烷/甲醇(40:1，v/v)为洗脱剂，得到红固体化合物(ⅲ)(1.60g,43％)。
[0048]
产物结构表征如下：
[0049]1h nmr(300mhz,dmso-d6)δ10.12(s,1h),8.02(s,1h),7.98(s,1h),7.82
–
7.68(m,2h),7.50(d,j＝9.0hz,1h),7.26(d,j＝7.6hz,1h),6.83(s,1h),6.76(d,j＝9.0hz,2h),6.68(s,1h),6.56(d,j＝5.4hz,4h),3.71(s,2h),3.53
–
3.36(m,10h),1.13(t,j＝7.0hz,6h).esi-m/z:644.23[m+h]
+
.
[0050]
实施例4：
[0051]
4-硝基苯基硫代氯甲酸酯(ⅳ)的合成：
[0052][0053]
将4-硝基苯酚(0.93g,6.70mmol)溶于5％naoh(6ml)溶液中，在冰浴下将混合液缓
慢滴加到硫光气(0.51ml，6.70mmol)的氯仿(4ml)溶液中，反应体系在0-5℃下搅拌1小时后，分离出氯仿层，并用稀盐酸和水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离纯化，洗脱剂用石油醚/乙酸乙酯(10:1，v/v)，得到淡黄固体化合物(ⅳ)(1.23g,85％)。
[0054]
产物结构表征如下：
[0055]1hnmr(300mhz,chloroform-d)δ8.41
–
8.31(m,2h),7.53
–
7.43(m,2h).
[0056]
实施例5：
[0057]
4-(二甲氨基)苄醇(
ⅴ
)的合成：
[0058][0059]
将4-二甲氨基苯甲醛(1.00g，6.70mmol)溶解于6ml无水甲醇中，冰浴，搅拌下分批加入硼氢化钠(0.28g，7.37mmol)，室温反应1小时。tlc监测反应完全后，将反应混合物倒入冰水中淬灭，搅拌0.5小时，然后用二氯甲烷萃取三次，无水硫酸钠干燥，浓缩，真空干燥得浅黄油状物(
ⅴ
)(0.99g，98％)。
[0060]
实施例6：
[0061]
o-(4-(二甲基氨基)苄基)o-(4-硝基苯基)硫代碳酸酯(ⅵ)的合成：
[0062][0063]
将化合物(ⅳ)(1.20g,5.51mmol)溶于无水二氯甲烷中，加入n，n-二异丙基乙胺(0.71g,5.51mmol)，然后缓慢加入化合物(
ⅴ
)(0.76g,5.01mmol)。在在0℃下反应半小时后，在30℃下回流反应5小时。tlc监测反应完全后，在减压下蒸发溶剂，通过柱层析进一步纯化，石油醚/乙酸乙酯(50:1，v/v)为洗脱剂，得到棕固体化合物(ⅵ)(1.20g,72％)。
[0064]
产物结构表征如下：
[0065]1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ8.30
–
8.22(m,2h),7.38
–
7.32(m,2h),7.25(d,j＝3.3hz,2h),6.69(d,j＝8.2hz,2h),4.16(s,2h),2.95(s,6h).esi-m/z:333.08[m+h]
+
.
[0066]
实施例7：
[0067]
o-(3'-(4-(7-二乙氨基)-2-氧代-2h-铬-3-羰基)哌嗪-1-基)-3-氧代-3h-螺[异苯并呋喃-1，9'-黄原]-6'-基)o-(4-(二甲基氨基)苄基)硫代碳酸酯(1)的合成：
[0068][0069]
将化合物(ⅲ)(1.00g，1.55mmol)溶于15ml无水二氯甲烷中，加入三乙胺(0.17g,1.71mmol)，然后缓慢加入化合物(ⅵ)(0.57g，1.71mmol)，在室温下搅拌反应混合物24小时。tlc监测应完全后，在减压下蒸发溶剂，通过柱层析进一步纯化，石油醚/乙酸乙酯(1:1，v/v)为洗脱剂，得到黄化合物1(0.79g，61％)。
[0070]
产物结构表征如下：
[0071]1h nmr(300mhz,chloroform-d)δ8.01(dd,j＝7.4,4.0hz,1h),7.91(s,1h),7.64(dt,j＝10.6,6.3hz,2h),7.31(d,j＝8.9hz,1h),7.22(d,j＝2.1hz,1h),7.14(dd,j＝15.2,4.7hz,2h),6.82
–
6.78(m,1h),6.72
–
6.57(m,8h),6.48(d,j＝2.4hz,1h),4.14(s,2h),3.90(s,2h),3.57(s,2h),3.44(d,j＝7.1hz,4h),3.34(s,4h),2.95(s,6h),1.22(d,j＝7.0hz,6h).hrms(esi):found 837.2880(c
37h32
n2o9s5[m+h]
+
requires 837.2880).
[0072]
实施例8：生物活性评价
[0073]
1、化合物的光谱学性质
[0074]
配制化合物1的母液(10mm在dmso(国药集团化学试剂有限公司)中)，取4μl母液于1.5ml ep管中，加入10mm pbs缓冲液(gibco c10010500bt pbs 7.4(1x)，含5％peg(国药集团化学试剂有限公司))，稀释到10μm。试液在405nm点光源(uv固化灯405nm，中山市古镇言西早照明电器厂)下进行光照测试，以配制化合物1待测液的初始时刻为零时刻进行计时，在光照后1min、3min、5min、8min、10min、15min、20min、30min时刻取200μl待测液于96孔板(whb-96-02)中，用molecular devices spectramaxi3多功能酶标仪测试荧光光谱。
[0075]
荧光光谱的实验结果见图1，(a)图表示化合物1在光照前的发射峰只有一个，在470nm左右，这与香豆素的发射光谱一致。(b)图表示光照下的i
525
/i
470
，化合物1的470nm发射峰逐渐减弱，新的发射峰红移到525nm-540nm，这与罗丹明的发射光谱一致。(激发波长设置为410nm，狭缝宽度2.5nm，发射波长扫描区间为350-600nm，波长间隔10nm)。
[0076]
实验结果表明，当化合物1呈内酯环结构时，fret效应关闭，测试的荧光光谱主要是能量供体分子的。而在光照时，化合物1逐渐释放出游离的羧基，fret体系开放，此时测得的荧光光谱与受体分子的一致，比率型信号也直观地反映出光照前后的荧光信号变化。
[0077]
2、亚甲蓝法测定h2s释放
[0078]
2.1绘制h2s标准曲线
[0079]
首先称取120.20mg的na2s
·
9h2o(毕得医药)，在100ml容量瓶中使用pbs配制浓度为5mm的na2s母液。分别吸取50、100、200、400、600、800、1000、1500μl的na2s母液，添加到50ml的容量瓶中，加入pbs并定容，得到5、10、20、40、60、80、100、150μm的na2s标准稀释液。吸取200μl溶液于1.5ml ep管中，使用市售h2s含量测定试剂盒(yx-c-c000,sinobestbio,china)检测h2s含量。测试步骤如下：依次向ep管中加入200μl醋酸锌(1％,w/v)，600μl n,n-二甲基-对苯二胺硫酸盐(0.2％w/v于20％h2so4溶液中)和50μl氯化铁(10％w/v于0.2％h2so4溶液)，充分震荡混匀，12000rpm离心10分钟，取200μl于96孔板中(corning#3599)，25℃静置25分钟，用molecular devices spectramaxi3多功能酶标仪测定665nm处吸光度，实验平行重复三次，绘制h2s标准曲线，见图2(a)。
[0080]
3.2测定化合物1的h2s释放
[0081]
配制化合物1的母液(10mm在dmso中)，取4μl母液于1.5ml ep管中，加入4ml含有碳酸酐酶ca(上海贤鼎生物科技有限公司)(0.5mg/ml)的pbs缓冲液(ph7.4，含5％peg)，稀释到100μm。设置对照组，加入相同体积的不含ca的pbs缓冲液。取200μl的稀释液加入96孔板中，在黑暗环境下用405nm点光源进行光照。光照10min后，取出200μl待测液于1.5ml ep管中，使用上述步骤按照h2s含量测定试剂盒检测h2s含量，静置25min后，测定665nm下的吸光度值，实验平行重复三次，代入标准曲线得到h2s浓度。
[0082]
实验结果见图2(b)，结果显示，在光照10min后，取100μm化合物1待测液检测到20.53μm h2s，说明化合物1可以释放h2s。对照组没有检测到h2s，进一步说明是光照触发分子先释放出了cos，再水解生成了h2s。
[0083]
综上所述，本发明的化合物1在405nm光照下可以释放出fret体系，实现比率型的荧光信号变化，同时，光照触发cos的释放，进而水解生成h2s，为构建新型光控释放的硫化氢供体分子提供了一种新思路。
[0084]
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

技术特征：

1.一种香豆素前药，其化学结构如式(1)所示：或该前药药学上可接受的盐、对映异构体、立体异构体、水合物、溶剂合物或多晶体。2.一种权利要求1所述香豆素前药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)向间二苯酚和邻苯二甲酸酐混合物中加入三氯化铝，室温搅拌，经傅-克酰基化反应得到化合物(ⅰ)；(2)向化合物(ⅰ)与间羟基苯基哌嗪的混合物中加入三氟乙酸，回流反应得到化合物(ⅱ)；(3)向7-(二乙基氨基)香豆素-3-羧酸中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶，再加入化合物(ⅱ)，发生酰胺缩合反应再经过柱层析得到化合物(ⅲ)；(4)将对硝基苯酚的氢氧化钠溶液加入到硫光气中，在冰浴条件下反应得到化合物(ⅳ)；(5)4-二甲氨基苯甲醛经硼氢化钠还原得到化合物(
ⅴ
)；(6)化合物(ⅳ)与化合物(
ⅴ
)在碱性环境中缩合反应再经过柱层析得到化合物(ⅵ)；(7)以化合物(ⅲ)和化合物(ⅵ)为原料，在碱性环境中经酯交换反应再经过柱层析得到所示化合物1；上述步骤(1)至(7)的反应路线以及化合物(ⅰ)至(ⅵ)的结构如下：3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中反应溶剂为甲苯或苯。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中柱层析的洗脱剂为体积比40:1的二氯甲烷/甲醇混合溶剂。5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中氢氧化钠溶液的质量浓度为5％，反应溶剂为氯仿。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(6)中反应溶剂为无水的n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃；碱性环境由三乙胺、n,n-二异丙基乙胺或吡啶提供；柱层析的洗脱剂为体积比50:1的石油醚/乙酸乙酯。7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(7)中反应溶剂为无水的n,n-二甲基甲酰胺、二氯甲烷或四氢呋喃；碱性环境由三乙胺、n,n-二异丙基乙胺或吡啶提供；柱层析的洗脱剂为体积比1:1的石油醚/乙酸乙酯。8.权利要求1所述的香豆素前药用于光照条件下逐渐释放出香豆素-罗丹明体系实现荧光信号比率型变化的用途；其中，光照波长为405nm。9.权利要求1所述的香豆素前药用作h2s供体的用途。10.根据权利要求9所述的用途，所述香豆素前药在405nm光照触发下释放出羰基硫化物，经碳酸酐酶水解生成h2s，构建新型光控释放的硫化氢供体分子。

技术总结

本发明公开了一种香豆素前药及其制备方法和用途，该香豆素前药的化学结构如式(1)所示。本发明提供的香豆素前药在适当的条件下可以释放出H2S气体。该前药在405nm光照触发下释放出COS，经CA水解生成了H2S，可以用于构建新型光控释放的硫化氢供体分子。型光控释放的硫化氢供体分子。型光控释放的硫化氢供体分子。型光控释放的硫化氢供体分子。