1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理
蛋白酶在一定温度和pHnbva
值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。 3.试剂和溶液
3.1福林试剂的准备
于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15mi
n，以除去多余的溴（冷却后仍有绿需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。制得得试剂应呈金黄，贮存于棕瓶内。 使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L
称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。 3.3三c（CCl3.COOH）=0.4mol/L
称取三65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L
按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L
按GB601配制。
3.6 缓冲溶液
a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶
甲液 称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液 称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液 取甲液8mL，乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/l乳酸缓冲溶液。 c．硼酸缓冲溶液（pH=10.5），适用于碱性蛋白酶。
甲液 称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液 称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液 取甲液500mL，乙液400mL，混匀，用水稀释至1000mL。
3.7 10g/l酪素溶液
称取酪素10.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/l氢氧化钠溶液（若酸性蛋白酶则用浓乳酸2~3滴）湿润后，加入适量得各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入1000mL容量瓶，用适宜的pH值的缓冲溶液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为三天。
3.8 100μg/mL L-酪氨酸标准溶液
a．称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，准确至0.0002g，用1 mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/l盐酸定容至100mL，即得100μg/mL L-酪氨酸标准溶液。
4仪器和设备
4.1 恒温水浴tt42 40℃±0.2℃。
4.2分光光度计 应符合GB9721的规定。
5 分析步骤
5.1 标准曲线的绘制
a．L-酪氨酸标准溶液：按表A3配制。
表A3
管号 | 酪氨酸标准溶液的浓度 μg/mL | 取100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积 mL | 取水的体积 mL |
0 | 0 | 0 | 10 |
1 | 10 | 1 | 9 |
2 | 20 | 2 | 8 |
3 | 30 | 3 | 7 |
4 | 40 | 4 | 6 |
5 | 50 | 5 | 5 |
| | | |
b.分别取上述溶液各1.00mL（须做平行试验），各加0.4mol/l碳酸钠溶液5.0mL，福林试剂使用液1.00mL，置于40℃±0.2℃水浴中显20min，用分光光度计于波长680nm，10mm比皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度，以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（曲线应通过零点）。
根据作图或用回归方程，计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），既为吸光度常数K值。其K值应在95~100范围内。
5.2 测定
（1）待测酶液的制备
a.称取酶粉1~2g，精确至0.0002g（或取液体酶1.00mL），用少量该酶的缓冲液溶解，并用玻璃棒搅拌捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3~4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲溶液定容至刻度，摇匀。通过四层纱布过滤，滤液根据酶活力再用一次缓冲液稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液吸光值在0.25~0.40范围内）。
b.酶粉测定时，稀释倍数参考表4（液体酶液可参照表4稀释）。
表4
酶活单位 | 总倍数 | 第一次稀释 | 第二次稀释 |
2万 | 2000 | 数字式水表 2g—200mL（100粘尘滚轮倍） | 5mL—100mL（20倍） |
3万 | 2500 | 2g—500mL（250倍） | 5mL—50mL（10倍） |
4万 | 4000 | 2g—200mL（100倍） | 5mL—200mL（40倍） |
5万 8、10万 | 5000 10000 | 2g—500mL（250倍） 2g—500mL（250倍） | 5mL—100mL（20倍） 5mL—200mL（40倍） |
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（2）测定
a 先将酪素溶液放入40℃±0.2℃恒温水浴中，预热5min。
b 按下列程序操作
于660nm波长，用10mm比皿测其吸光度
c. 1.398和166蛋白酶，除反应与显温度为30±0.2℃外，其他操作同5.2，标准曲线也作同样处理。
5.3 计算X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n
式中，X—样品的酶活力，u /g（u/mL）；
A—样品平行试验的平均吸光度；
K—吸光常数 (K=97.09实验室测定值)
4—反应试剂的总体积，mL电量监控；
10—反应时间10min，以1min计；
n—稀释倍数
5.4 结果的允许差
平行试验相对误差不得超过3%。
需要准备的：麸皮，面粉，水，纱布，福林试剂，250ml三角瓶，每组10－15支试管，分光光度计，三，磷酸缓冲液或水，碳酸钠溶液，酪素，已传代好的试管斜面。
最好能镜检一下真菌菌丝的形态。
电伴热管缆试管A（空白） ↓ 加酶液1.00ml 40+0.2℃, 预热2min ↓ 加三2.00ml摇匀 40+0.2℃, 保温10min ↓ 加酪素1.00ml,摇匀 ↓ 取出静置10min,过滤 ↓ 取1.00ml滤液 ↓ 加碳酸钠溶液5.00ml ↓ 加福林试剂使用液1.00 ml 40+0.2℃,显20min | 试管B（酶试样，需作三个平行） ↓ 加酶液1.00ml 40+0.2℃, 预热2min ↓ 加酪素1.00ml,摇匀 40+0.2℃, 保温10min ↓ 加三2.00ml摇匀 ↓ 取出静置10min,过滤 ↓ 取1.00ml滤液 ↓ 加碳酸钠溶液5.00ml ↓ 加福林试剂使用液1.00 ml 40+0.2℃,显20min |
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