实验三 Sephadex G-25凝胶层析法脱盐和离子交换柱层析分离菠萝蛋白酶 一、Sephadex G-25凝胶层析法脱盐
（一）目的和要求
开关量信号掌握凝胶层析法的原理及操作技术。
（二）原理
凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatography）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20 世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
下面主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。
葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/g干胶。市售有G–10、G–5、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。
葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择
使用。一般说Sephadex G–l0～50通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G–75～200用以分离各类蛋白质。
（三）实验材料
（1）实验一所提的菠萝蛋白酶粗提样品
Sephadex G-25，1% BaCl全局消息钩子2溶液
（2）实验设备
层析柱 (1.0x 25cm，1 x 10cm) 、恒流泵、自动部分收集器（х4组）、紫外检测仪，小试管架（4个）
（3）玻璃器皿
烧杯（250mL 3个х4组 ）、胶头滴管卡（2个х4组）、试管夹（1个х4组）、收集器的指管（40个х4组），铁架台（4个），10mL量筒（1个х4组）
（四）操作方法
（1）凝胶溶胀：取5g Sephadex G-25凝胶加200mL蒸馏水充分溶胀（室温6h或在沸水浴中溶胀2h）后，除去细小颗粒，再加入与凝胶等体积的蒸馏水，除气后装柱。
添加到距柱顶2-3cm高度后，剪一圆形滤纸（比柱内径略小一些），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于（2）装柱与平衡：取层析柱1支（1cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口，加入1、4柱长的蒸馏水。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒部分，按体积比1：1左右搅拌成悬浮液，用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。凝胶表面，以免在加样时打乱凝胶层。以3倍柱体积的水流过凝胶柱，以平衡凝胶。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。平衡的同时打开紫外检测仪，让平衡液流经光路。
（3）上样：凝胶平衡后，调节紫外检测仪的T100和A0，用滴管吸除去凝胶柱上面的溶液，待液面与凝胶表面相切时，将盐析所得1mL样品小心加到凝胶柱表面（用于脱盐的上样体积可为柱体积的10%～25%），让蛋白样品溶液慢慢浸入凝胶内，迅速在凝胶柱面上加水1-2cm，连接上恒流泵进行洗脱，控制流速为0.5mL/min左右。待有蛋白样品流出后用试管收集洗脱液，每10min接1管，并记录随时间变化的A值。
（4）每管溶液中，加入2滴BaCl2试剂，若呈现白沉淀说明它含有硫酸铵。
结果处理
根据实验结果，列表，按管记录白沉淀量（以+表示多少）。分析样品脱盐效果。
二 柱层析技术分离纯化菠萝蛋白酶粗提液
一、目的
学习利用离子交换树脂柱层析技术进一步纯化的的原理和实验技能。
二、原理
菠萝蛋白酶的等电点为9.4，为了缩短提纯时间，防止或减少自身降解，采用阴离子交换层析的方法，使其作为第一个洗脱峰被洗脱下来而得到纯化。
三.实验材料
（1）菠萝蛋白酶脱盐后的样品 , 阴离子交换树脂
（2）实验设备 :
层析柱 (1.5 x 20cm，1 x 10cm) 、恒流泵、自动部分收集器（х4组）紫外检测仪、水浴箱、752- 紫外可见分光光度计
（3）玻璃器皿
烧杯（250mL 2个х4组 ）、胶头滴管（2个х4组）、试管夹（1个х4组）、收集器的指管（40个х4组），铁架台（4个）、小试管架（4个）
（4）实验试剂
1 柱层析试剂：pH6.0 PBS 0.02moL/L 1000 mL
2 测酶活试剂和蛋白测定试剂见实验一 :
四、操作步骤：
1.地球仪制作方法简单 树脂预处理：称取所需的量，放于0.5自救手环mol/L NaOH溶液，浸泡0.5h左右，不时搅拌。抽滤，以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将树脂浸泡于0.5Mol/L HCl中0.5h，同样抽滤液至近中性。再将树脂浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。将处理的树脂放入0.02Mol/L pH 6.0 PB液中（即起始缓冲液），静止0.5h
2. 装柱：将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，再将处理的树脂沿管壁缓慢倒入柱中。拧开螺旋夹，使流速至0.5ml/min，剪一圆形滤纸（略小于柱内径），从柱的上端轻轻放入，使其沉降于树脂表面。 继续用恒流泵加缓冲溶液平衡。同时打开紫外检测仪，让平衡液流经光路。
3. 上样全自动烫金机与洗脱：平衡后，调节紫外检测仪的T100和A0，将柱的上端打开，用吸管将柱上面的缓冲液吸出，留一薄层液面。沿管壁缓缓加入3mL样品，拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中后，迅速加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，连接上恒流泵进行洗脱，控制流速为0.5mL/min左右。待有蛋白样品流出后用试管收集洗脱液，每10min接1管，并记录随时间变化的A值。
4.将蛋白的洗脱液收集后记录体积，装于透析袋中扎紧，并在放有PEG4000的平皿上浓缩
棒材矫直机
到2mL左右，倒出记录体积，并定容于3mL收集于小试管中，即得到纯化酶液，分别检测酶活和蛋白。
五、结果处理：
（1）以洗脱体积为横坐标，吸光度为纵坐标作图，画出洗脱曲线
（2）根据粗酶和纯酶的酶活和蛋白含量测定结果，测定：①比活力②回收率③纯化倍数
