摘要
作为功能性材料的壳聚糖、脱乙酰壳聚糖，由于其一系列独特的性质作为固定化酶载体材料已经广泛应用于酿酒工业、制糖工业、渔业、废水处理、环境污染的定点测控等研究领域。固定化酶比游离酶具有多方面的优点。本文以多孔壳聚糖球为载体，戊二醛为交联剂制备固定化胰蛋白酶，研究了多孔壳聚糖球载体的制备条件、固定化反应中戊二醛浓度、给酶量、pH值、温度、固定化时间对固定化胰蛋白酶活力的影响。并进一步对固定化胰蛋白酶的性质，固定化胰蛋白酶水解鲢鱼蛋白的条件，以及鲢鱼蛋白的水解度，水解产物中可溶性蛋白得率，氮溶指数进行了研究。 通过研究确定了制备多孔壳聚糖球载体的最佳条件为：壳聚糖浓度3％，凝结液为：4％NaOH：95％乙醇(4：1)，室温处理3h。固定化胰蛋白酶的条件为：每克载体加入交联剂(用pH值7．0缓冲液配制戊二醛)5mL，浓度为0．50％，活化温度为25℃，150rpm条件下振荡活化2h，酶液的浓度为7mg／mL(用pH 7．0缓冲液配制)，加酶量5mL／g载体，固定化温度15"C，150rpm振荡固定化24h。在此条件下固定化胰蛋白酶活力472．39u／g 固定化酶，固定化效率42．9％。固定化胰蛋白酶的最适反应温度范围30"C---60"C，游离胰蛋白酶的最适反应温度50"C；·固定化胰蛋白酶的最适pH值范围7．0"--'9．0，游离胰蛋白酶最适pH值范围7．0"--'7．5。固定化胰蛋白酶的热稳定性和pH值稳定性比游离酶有所提高。固定化酶的Km值为9．89mg／mL，游离酶的米氏常数Km值为8．99mg／mL。利用固定化胰蛋白酶水解鱼肉蛋白，重复4次后，其活力为初始活力的46．06％。以20％的鲢鱼蛋白为底物，水解时间120min，温度 40"C，最大水解度8．73％，可溶性蛋白得率69．55％，水解物的氮溶指数62．24％。
关键词：壳聚糖；胰蛋白酶；固定化酶；鲢鱼蛋白
ABSTRACT
Chitin and Chitosan as ftmctional materials have a unique set of charaeteristies．Immobilized enzyme with chitosan嬲carder have been widely used in wine industry,sugar industry,fisheries，and for wastewater treatment，the fixed point pollution control and SO on．In this paper,immobil-ized
chitosan beads嬲carrier
trypsin was prepared using porous
and glutaraldehyde as CROSS-
linking agent．The conditions of preparation porous ehitosan beads，the effects of the concentration of both enzyme and reagent，the pn value of the solution，the temperature，and the reaction．time on the activity in the whole immobilize process were studied．We also researched the character of immobilized trypsin，the condition of hydrolysis silver carp，the degree of hydrolysis，the soluble protein yield and the nitrogen dissolved index．
ehitosan beads are as According to仃ial，the optimum condition of prepare porous
Was 3％，cross linking solution was 4％NaOH：95％ethanol，following：concentration of ehitosan
glomerat-ing time was 3h；the optimum immobilize condition was pH 7．0，concentration of
glutaraldehyde0．5％，concentration of trypsin 7mg／mL，temperature 1 50C，and reaction time 24h．At this
condition the activity of immobilized trypsin was 472．39u／g wet particles，immobilized efficiency Was 42．9％．The results indicated that the immobilized trypsin displayed the optimum activity at pH7．0--。9．0，temperature 30 oC'--'60 oC and Km values 9．89mg／mL．And free trypsin showed the optimum activity at pH 7．O～7．5，temperature 50 oC and Km value 8．99mg／mL．Compared、析th free trypsin,the immobilized trypsin had better stability in thermal
Was hydrolyzed by immobilized trypsin which was reused and pH storage．Silver carp protein
4 times，
the activity of the immobilized trypsin remained 46．06％．Optimum temperature Was 40 oC，the d
egree of hydrolysis was 8．73％，the soluble protein yield Was 69．55％and the nitrogen dissolved index Was 62．24％．
Keywords：Chitosan；trypsin；immobilized enzyme；silver carp protein
发表论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明
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一、发表论文
。蛋白酶的固定化及其在生物活性物质开发中应用的研究进展，食品科学，20008，02
光电限位开关
(29)：466—471．
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一．
第一章前言
1．1课题研究的背景
1．1．1胰蛋白酶结构及催化机理
胰蛋白酶是一种动物来源的蛋白水解酶(尤以动物的胰脏含量最丰富)，属于内肽酶。它易溶于水，不溶于氯仿、乙醇、乙醚等有机溶剂，分子量为23800，等电点为10．5，其单一肽链含有233个氨基酸残基和六对二硫键(如图卜1所示)。
图1．1胰蛋白酶的三维结构图，其活性中心由三种氨基酸组成：SerAsp
His
胰蛋白酶专一地水解赖氨酸与精氨酸羧基形成的肽键，活性按多肽、酰胺、酯的顺序递减。胰蛋白酶属于水溶性蛋白质，在溶解状态下与底物溶液形成的均相反应体系中表现出高的催化活性，在医药、食品工业等领域有广泛的应用‘1’21，还在蛋白质的序列分析，多肽的酶促合成以及亲和吸附分离等方面有广泛的应用前景【31。但是未经固定化的胰蛋白酶在溶液中稳定性差，容易发生消化反应，使酶催化反应难以控制，催化效率下降，不利于产物的提纯精制，导致生产成本高。因此固定化胰蛋白酶的研究具有重要的意义。
1．1．2蛋白酶的简介
酶是一类生物催化剂，能够催化构成细胞代谢的所有反应，生物体内形形的化学反
应均是在酶催化下进行的。到目前为止，人们已从生物体(动物、植物以及细菌等微生
物)中分离、鉴定出2000多种酶。它的主要成分为蛋白质，还有一些辅助成份是由非蛋
白质结构，如金属离子：钠(Na+)、钾(K+)、镁(Mg+)、锌(Zn2+)、铜(Cu2+)、铁(Fe2+)
1
第一章前言
等，以及有机化合物：VC、VB、vA等一类的维生素物质构成。它们起到辅助酶蛋白催化底
物作用。若缺少这些成份，酶蛋白的催化活性将大大降低，甚至不能起催化作用。因此，人们将酶蛋白加辅助因子这两部分结合体，称为全酶。同一般催化剂相比，酶有以下几个特点：①催化效率高，酶可在常温常压下操作，不需要高温高压和强烈的酸碱度；⑦专一性强，对底物具有高度的特异性，也就是说，一种酶只能作用于一种底物或一类化合物；
◎反应条件温和，酶本身为蛋白质，它对化学品、温度、pH都十分敏感，故可用简单的办
二维液相谱’
电热手套法来控制反应进程；④酶的活性是可以调节控制的。
自复位保险丝虽然酶在生物体内能够催化许多化学反应，但用作工业催化剂仍存在缺陷【4】。因为酶是由蛋白质组成的，其高级结构对所处的环境十分敏感。一般情况下，对热、强酸、强碱、有机溶剂等均不够稳定，在存放、反应中容易失活，酶中常常带有杂蛋白及有物质，易造成产物被污染，难以分离提纯，限制了酶促反应的广泛应用。在本世纪六十年代发展起来的酶固定化技术既克服了上述不足【5】，又在一定程度上保持了酶特有的催化活性，从而成为生物技术中最为活跃的研究领域之一。1971年第一届国际酶工程会议正式对固定化酶[61下定义为：固定化酶(Immobilization ofenzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
1．1．3蛋白酶的固定化原
则
为了最大限度发挥固定化酶的优势，并避免其缺陷。通过几十年的探索研究，人们已经总结出了一套酶固定化的遵循原则川，具体如下：
①必须注意维持酶的正常构象。酶蛋白的活性中心与空间构象密切相关。因此，在酶的固定化过程中，要维持酶的正常构象，保证酶的活性，做到不伤及酶的活性中心；网络证件
⑦固定化酶应能有效回收储藏再利用。所以酶与载体必须有一定的结合强度，利于反复使用；
③固定化应有利于生产自动化，连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械
洗衣机模具
强度，不能因机械搅拌或其他作用力而破碎或脱
落；’
④固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近以及产物的扩散；
⑤固定化酶载体应有较好的稳定性，不与底物、产物或反应液发生化学反应；
⑥固定化酶的制备步骤应相对简单易行，以利于工业生产。
1．1．4固定化酶的性质∞一
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酶在水溶液中以自由的游离状态存在，但是固定化后酶分子便从游离状态变为牢固结
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