第１７卷 第２期 四 川 轻 化 工 学 院 学 报 Ｖｏｌ．１７ Ｎｏ．２
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＩＣＨＵＡＮ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＯＦ
２００４年６月 ＬＩＧＨＴ ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＡＮＤ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ Ｊｕｎ．２００４ 文章编号：１００８－４３８Ｘ（２００４）０２－００７９－０４
吴华昌，邓静，吴晓莉，韩莎
（四川理工学院生物工程系 四川 自贡 ６４３０００）
钢锭模
摘要：文章概述了蛋白质工程常用策略和用这些策略来改造工业用酶的基本特性（包
括稳定性、活性、选择性和表面特性）及其在工业用酶中的应用，并对其发展做了展望。电触点
关键词：蛋白质工程；工业用酶；合理设计；定向进化
中图分类号：Q816 文献标识码：A
工业用酶在催化化学反应方面具有经济、高效、用途广等优点，已深入到人类生活的各个领域。但在粗放的工业条件下，如高温、高压、极端ｐＨ等，常常使酶的特性遭到破坏，其生产应用受到了极大的限制。８０年代出现的蛋白质工程为改造和设计工业用酶带来了契机。经过几十年的努力，蛋白质工程改造工业用酶的基本特性已取得了较大的成效。 １ 蛋白质工程常用策略
１．１ 合理设计
合理设计是蛋白质工程最早使用的技术，而且现在也在广泛的使用。要达到此目的要做好三个方面的工作。第一要用结晶学技术来获得蛋白质结晶体，然后利用ｘ－射线技术对晶体进行测量、分析，确定蛋白质的三维结构。第二借助计算机对蛋白质进行选择修饰，从氨基酸的化学结构预见空间结构，或通过人工智能等其它方法来确定蛋白质和功能的关系，到要修饰的位点。第三，通过对基因序列的了解，运用定点突变技术来进行碱基替换。通过此法来改变蛋白质的功能，但要想获得理想的蛋白质工程产物往往要经过多次分析，替换才能达到目的。 １．２ 定向进化
定向进化是蛋白质工程的新策略，它是在不需要事先了解蛋白质的空间结构的情况下通过模拟自然进
化机制，以改进的诱变技术结合确定进化方向的选择方法。因此它能解决合理设计所不能解决的问题，在工业生产中的应用越来越受到重视。定向进化是在待进化蛋白质基因的ＰＣＲ扩增反应中，利用ＴａｑＤＮＡ多聚酶不具有３’－５’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中引入突变，构建突变库，凭借定向选择方法，选出所需性质的蛋白质。定向进化实际就是随机突变加上选择，它与自然进化不同，整个过程都是在人为控制下进行的，并且还可以模拟真核细胞中ＤＮＡ 随机拼接这一蛋白质进化过程来加速蛋白质的优化。
２ 工业用酶基本特性的改造
２．１ 提高酶的稳定性
对于一个工业用酶来说首先要求它必须有足够的稳定性，其稳定性包括热稳定性、抗蛋白酶稳定性、抗氧化稳定性、在有机溶剂中的稳定性等。而其稳定性又受多种因素的影响，如：氨
收稿日期：２００３－１０－２７
bbzs
作者简介：吴华昌（１９７０－），男，四川人，硕士，讲师，主要从事非水相酶学方向研究。
80 四 川 轻 化 工 学 院 学 报 ２００４年６月 基酸序列、三维结构以及辅助因子等。一般可以通过突变引入二硫键，盐键等来提高酶的稳定性。另外有些
氨基酸能降低酶折叠的熵（如Ｐｒｏ），同时可以在蛋白质结构的刚性部分引进新的分子内作用力，也可提高酶的稳定性。还有些可以通过延长碳链来达到同样的效果。但不是所有这些方法都完全奏效，Ｙａｍａｇｕｃｈｌ等人［１］就想通过引入二硫键来提高Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ脂肪酶的热稳定性却未能取得预想的结果。
２．２ 提高酶的活性
酶活力的高低直接影响工业生产效率和生产成本。对于酶的活性中心及调控部位来说，一般只由少数的几个关键氨基酸残基在空间排列而成，酶活性会因为这些残基中的一个或几个的改变而发生很大的变化，另外工业中所用底物又相当复杂，因此要提高酶的活性就较困难，研究也表明，通常突变都会导致酶活力下降。但通过一些特定氨基酸残基的突变，可以提高突变体酶的活力。Ｍａｎｄｅｃｋｉ［２］对大肠杆菌碱性酯酶的活性位点旁边的Ｄ１０１进行突变，Ｄ１０１Ａ突变体酶的比活力上升了１５倍。现在人们正努力去探求酶催化机制，一旦搞清了酶的催化机制，那用蛋白质工程就能更有效的提高酶活。
２．３ 增强酶的选择性
酶的选择性是酶的重要特性之一。通过对酶结构及催化机制的分析发现酶与底物结合一般都有一个特异性口袋，由于口袋形状大小各异，口袋上连接的氨基酸种类及所带电荷又不同，其对底物的专一性
也不同。一般通过突变改变口袋的电荷，疏水性，立体结构来改变酶对底物的选择性。Ｗｅｉ等人［３］研究了几个脂肪酶的结构，发现其口袋的形式有三种（１）裂缝式（２）漏斗式（３）地道式。并通过替换不同氨基酸残基，使酶对脂肪链长的专一性发生了改变。
２．４ 改变酶的表面特性
很多重要的工业用酶都只作用于底物的表面。比纤维素酶和木聚糖酶都有一个协助酶与底物结合的连接区；脂肪酶只有在油水界面上才能发挥作用。因此弄清促使酶和底物相互作用的驱动力就显得尤为重要。研究发现Ｓａｖｉｎａｓｅ蛋白酶，Ｌｉｐｏｌａｓｅ 脂肪酶表面电荷的相互作用是促使酶对底物吸附的主要驱动力。Ｊｕｆｆｅｒ等人［４］用分子模型研究了角质脂肪酶及其突变体，发现吸附的自由能和蛋白质电荷之间存在线性关系。因此通过蛋白质工程改变酶表面电荷状况来影响酶的表面特性，达到改变酶对底物吸附特性。
总的说来，酶的稳定性、活性、选择性以及表面特性往往是相互联系的。有时在提高酶的稳定性时，其活性会下降。而提高其活性时，酶的选择性又有可能下降。因此要使一个酶能有较宽的适用范围，而其各方面的特性又不受大的影响，那就必须了解各特性之间的相互作用关系，在它们之间到一个平衡点。
３ 蛋白质工程在工业用酶中的应用
电子束焊接３．１ 脂肪酶
脂肪酶能催化酯的水解和合成，广泛用于洗涤剂的生产，油脂工业，有机合成，皮革及造纸工业。Ｂｅｅｒ等人［５］根据酶的Ｘ－射线结构建立一模型，并通过定点突变搞清楚了Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚｅａ脂肪酶的催化机制。Ｏｋｋｅｌｓ等人［６］通过定点突变使Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ａ 脂肪酶的比活力提高了４倍。Ｙａｍａｇｕｃｈｉ等人［７］将Ｃｙｓ二硫键引入Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｓａ 脂肪酶中，突变体的热稳定性提高了１２℃，酶的最适温度提高了１０℃。Ｐａｔｋａ 等人［８］发现Ｃａｎｄｉｄａ Ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ脂肪酶的Ｍ７２Ｌ突变体抗过氧辛酸氧化作用能力比野生型强。Ｋａｍｐｅｎ 等人［９］研究了Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ 脂肪酶的突变体对底物专一性的影响，发现把３５６位的Ｓｅｒ用Ｖａｌ来替换，其磷脂酶活性降低了１２倍。Ｅｇｍｏｎｄ等人［１０］研究了Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ｐｉｓｉ角质酶对阴离子的亲和性。发现通过Ｎ１７２Ｋ突变，酶表面带有更多的正电荷，同野生型角质酶相比，突变体稳定性更差。在１７和１９６位引入负电荷残基，则酶对阴离子表面剂活性剂十二烷基磺酸锂的稳定性提高。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｇｌｕｍａｅ 脂肪酶的１５４和１５０位的氨基酸残基用Ｐｒｏ替代，在Ｐ１位引入Ａｒｇ残基，酶的抗蛋白稳定性得到了提高。
第１７卷 第２期 吴华昌等：蛋白质工程在改造工业用酶中的应用 81 ３．２ 蛋白酶
蛋白酶在酶制剂市场中占的分额较大，其主要用于洗涤剂，制革和纺织。对枯草芽孢杆菌蛋白酶的蛋白质工程研究较多，对其结构和功能的关系也认识较深。一般蛋白质工程中出现的新方法，人们首先想到的就是用枯草杆菌作为实验菌株。我国的王凡强等人［１１］详尽概述了蛋白质工程对枯草杆菌蛋白酶各个方面进行改性的进展情况。Ｂｒｏｄｅ等人［１２］对枯草杆菌蛋白酶ＢＮＰ´的表面特征进行研究，发现在活性区域有较多负电荷的突变体其吸附力更弱，在洗涤中能更好的发挥作用。 ３．３ 淀粉酶
淀粉酶的使用范围极广，种类繁多，根据不同的需要可以选择不同种类的酶。α－淀粉酶主要用来生产麦芽糖糊精，葡萄糖淀粉酶催化糊精可得到葡萄糖，用β－淀粉酶可以得到麦芽糖，用葡萄糖异构酶可以将葡萄糖转化为果糖。而一般的淀粉酶催化都是在高温条件下进行的。应用蛋白质工程可提高酶的热稳定性。有人得到Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｍｉｓ α－淀粉酶的双突变体Ａ２０９Ｖ／Ｈ１３３Ｔ，酶在９０℃的半衰期延长了９倍。Ｍｉｔｃｈｉｎｓｏｎ等人用定点突变和高通量筛选的方法得到了一个突变体，其最适ｐＨ值提高了０．５～１．０。Ｇｌｏｒｉａ等人［１３］用Ｐｈｅ 或Ｔｙｒ来替换Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ α－淀粉酶２８９位的Ａｌａ，其具有了催化醇化反应的能力。Ｓｉｅｒｋｓ等人［１４］报道了通过改变葡萄糖淀粉酶活性位点的三个氨基酸残基，其作用于１，４－糖苷键相对于１，６－糖苷键的Ｋｃａｔ／Ｋｍ比值提高了３００倍。
３．４ 纤维素酶
纤维素酶现在已广泛地应用于医药、纺织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料等各个领域，其应用前景十分广阔。大多数工业用的纤维素酶都是葡萄糖苷内切酶，含有一个催化区和一个纤维素连接区。没有纤维素连接区则酶对于纤维素的活性很低。现在研究的重点是了解酶的吸附和活性之间的关系。有人对纤维素酶和蛋白酶进行了对照研究，发现纤维素酶的活性与吸附的强弱关系更大［１２］。Ｋｏｉｖｕｌａ等人［１５］对 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ的纤维二糖水解酶催化区域１６９位的氨基酸残基Ｔｒｙ进行了研究，发现其能协助葡萄糖环转换成更容易反应的构形。Ｈａｋａｍａｄａ等人［１６］用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的Ｇｌｕ１３７、Ａｓｎ１７９和Ａｓｐ１９４突变为Ｌｙｓ，其热稳定性得到了提高。Ｚｈａｎｇ等人［１７］专门研究了Ｔ．ｆｕｓｃａ纤维素酶Ｃｅ１６Ａ表面残基对底物专一性的影响，发觉突变体Ｒ２３７Ａ对羧甲基纤维素的活力提高了。后来他［１８］又研究了靠近活性位点残基对催化活性、底物专一性、配基连接亲和性的影响，４个残基（Ｈｉｓ１５９、Ａｒｇ２３７、 Ｌｙｓ２５９、Ｇｌｕ２６３）的７个突变体对羧甲基纤维素的活性都有所提高，其中Ｋ２５９Ｈ突变体的活性提高的最为显著。
３．５ 木聚糖酶
木聚糖酶可用于食品行业的焙烤，果汁处理，淀粉加工，动物饲料等，在制纸浆和造纸工业中主要用来减少漂白过程中化学药品的用量，从而减少对环境的污染。 Ｋａｎｅｋｏａ 等人［１９］研究Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ â－木聚糖酶Ｆ／１０，除去Ｄ１３３位或Ｓ１３５位残基，酶的动力学性质不变。同时除去这两个残基时，Ｋｍ 从２．０降到０．６，Ｋｃａｔ值从２０降到８．７，如果在双去除体中插入Ｑ１４０，Ｋｍ进一步降到０．３，Ｋｃａｔ降到３．８。Ａｔｓｕｓｈｉ 等人【２０】用Ｈｉｓ来替换此酶１２８位的Ｇｌｕ残基，发现与野生型相比，其突变体对ＰＮＰ－Ｘ２的亲和力提高了１０３倍。
４ 结论与展望
显然，蛋白质工程在提高工业用酶的基本特性以及赋予其新用途方面起着重要的作用。酶的合理设计需要了解酶的结构及功能的关系，使其应用受到了一定的限制。而酶的定向进化属于非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，因而大大的拓宽了蛋白质工程的研究和应用范围，特别是它能解决合理设计不能解决的问题，使我们能较快，较多的了解蛋白质的结构和功能之间的关系，为指导酶在工业中的应用奠定理论基础，为寻新的方法提供理论依据。目前定向进化的主要问题在于是否有高通量的筛选方法。筛选方法的发展是酶技术发展的基础，要想获得具有期望特性的酶就必须重视筛选方法的建立。
蛋白质工程改造工业用酶中，较为常见的做法是改变酶的热稳定性。早期的研究主要是了解影响酶热稳定性的结构特征，其突变较易成功、识别和证实。而对于改变酶活则较难，一是影响其活性的因素很多，再则我们对影响酶的参数，尤其是对大分子底物来说，了解还不多，在突变中往往容易使酶失活或酶活力下降。现在蛋白质工程对酶的改造涉及的特性越来越多，对稳定性
82 四 川 轻 化 工 学 院 学 报 ２００４年６月 的研究也从单一的热稳定性扩展到抗氧化稳定性，抗蛋白酶稳定性，在有机溶剂中的稳定性等各方面；对专一性也从改变底物专一性到改变立体专一性和位置专一性等方面。另外各种能够在极端环境（如高温、高压、高盐、高酸、高碱）应用的酶的出现为蛋白质工程改造工业用酶提供了新的来源。但是提高工业用酶的各方面特性对我们来说还是一个严峻的挑战，进一步研究酶的结构，了解酶的结构和功能的关系以及催化机制是我们以后研究的重点。
参考文献：
［１］ Ｙａｍａｇｕｃｈｌ Ｓ， Ｔａｋｅｕｃｈｔ Ｋ， Ｍａｓｅ Ｔｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎ ｅｘｔｒａ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ ｍｏｎｏ－ ａｎｄ ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐａｓｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｒｅｉｎ Ｅｎｇ．，
钻井泥浆泵１９９６，９：７８９－７９５．
［２］ Ｍａｎｄｅｃｋｉ Ｗ． Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｙｉｅｌｄｓ ｅｎｚｙｍｅｓ ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ Ｋｃａｔ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１９９１，４（７）：８０１－８０４．
［３］ Ｗｅｉ Ｙ， Ｓｃｈｏｔｔｅｌ Ｊ Ｌ， Ｄｅｒｅｗｅｎｄａ Ｕ， ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｖａｒｉａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｃａｂｉｅｓ ｅｓｔｅｒａｓｅ［Ｊ］． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， １９９５，（２）：２１８－２２３．
［４］ Ｊｕｆｆｅｒ Ａ Ｈ， Ａｒｇｏｓ Ｒ， Ｖｌｉｅｇ Ｊ Ｄ． Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｎｔｏ ｃｈａｒｇｅｄ ｓｕｒｆａｃｅｓ： ａ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ ａｐｐｒｏａｃｈ ｗｉｔｈ ｅｘｐｌｉｃｉｔ ｉｏｎｓ［Ｊ］． Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ Ｃｈｅｍ．， １９９６，１７：１７８３－ｌ ８０３．
［５］ Ｂｅｅｒ Ｈ Ｄ， Ｗｏｈｌｆａｈｒｔ Ｇ， ＭｃＣａｒｔｈｙ Ｊ Ｅ Ｇ， ｅ
ｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｆｕｎｇａｌ ｌｉｐａｓｅ ｕｓｉｎｇ ｃｏｍｐｕｔｅｒ－ａｉｄｅｄ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｍｕｔａｎｔｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １９９６，９：５０７－５１７．
［６］ Ｏｋｋｅｌｓ Ｊ Ｓ， Ｓｖｅｎｄｓｅｎ Ａ， Ｐａｔｋａｒ Ｓ Ａ， ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｌｉｐａｓｅ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ［Ｊ］．ｉｎ： Ｆ．Ｘ． Ｍａｌｃａｔａ （Ｅｄ．）， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ／ｗｉｔｈ Ｌｉｐａｓｅｓ， ＮＡＴＯＡＳＩ Ｓｅｒｉｅｓ， Ｓｅｒｉｅｓ Ｅ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９５，３１７： ２０３－２０７．
［７］ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｓ， Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ｋ， Ｍａｓｅ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎ ｅｘｔｒａ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉｉ ｍｏｎｏ－ ａｎｄ ｄｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｌｉｐａｓｅ［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｅｎｇ． ，１９９６，９：７８９－７９５．
塑料拖把头［８］ Ｐａｔｋａｒ Ｓ．， Ｖｉｎｄ Ｊ．， Ｋｅｌｓｔｒｕｐ Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ Ｂ ｌｉｐａｓｅ［Ｊ］． Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐｉｄｓ． １９９８， ９３： ９５－１０１．
［９］ Ｋａｍｐｅｎ Ｍ Ｄ， Ｓｉｍｏｎｓ Ｊ Ｗ Ｆ Ａ， Ｄｅｋｋｅｒ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ ｌｉｐａｓｅ ｓｔｒｏｎｇｌｙ ｄｅｐｅｎｄｓ ｏｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ Ｓｅｒ ｔｏ Ｖａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ［Ｊ］ ．Ｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓ． Ｌｉｐｉｄｓ， １９９８， ９３： ３９－４５． ［１０］ Ｅｇｍｏｎｄ Ｍ Ｒ， Ｖｌｉｅｇ Ｊ ｄ， Ｖｅｒｈｅｉｊ Ｈ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｌｉｐａｓｅｓ［Ｊ］． ｉｎ： Ｆ．Ｘ． Ｍａｌｃａｔａ （Ｅｄ．）， Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ／ｗｉｔｈ Ｌｉｐａｓｅｓ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １９９５，３１７： １９３－２０２．
［１１］ 王凡强， 马美荣， 王正祥，等． 枯草杆菌蛋白酶的基因工程改性．微生物学通报， ２０００，２７（３）：２１８－２２０． ［１２］ Ｂｒｏｄｅ Ｐ Ｆ， Ｅｒｗｉｎ Ｃ Ｒ， Ｒａｕｃｈ Ｄ Ｓ， ｅｔ ａｌ． Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ’ ｖａｒｉａｎｔｓ：
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｈｙｄｒｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｎ ｓｕｒｆａｃｅ－ｂｏｕｎｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｖｉａ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ３６：３１６２－３１６９． ［１３］ Ｇｌｏｒｉａ Ｓ Ｒ， Ｇａｂｒｉｅｌ Ｒ， Ｒｏｓａ Ｉ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ａ ｌｉｑｕｅｆｙｉｎｇ Ｋ－ａｍｙｌａｓｅ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９９， ４５３ ： １００－１０６．
［１４］ Ｓｉｅｒｋｓ Ｍ， Ｓｖｅｎｎｓｏｎ Ｂ． Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｓｔａｒｃｈ ｄｅｇｒａｄｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１９９４，７：１４７９－１４８４．
［１５］ Ｋｏｉｖｕｌａ Ａ， Ｒｅｉｎｉｋａｉｎｅｎ Ｔ， Ｒｕｏｈｏｎｅｎ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ＩＩ： ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎｅ １６９［Ｊ］． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．， １９９６，９：６９１－６９９．
［１６］ Ｈａｋａｍａｄａ Ｙ， Ｈａｔａｄａ Ｙ， Ｏｚａｗａ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｉｎｅ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｂｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒａｓ ｆｒｏｍ ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． Ｊａｐａｎ ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ２００１，１９５： ６７－７２．
［１７］ Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ Ｂ［Ｊ］． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９７，５７： １０１－１１３．
［１８］ Ｚｈａｎｇ Ｓ， Ｂａｒｒ Ｂ Ｋ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｄ Ｂ［Ｊ］． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０００，２６７：２４４－２５２．
［１９］ Ｋａｎｅｋｏａ Ｓ， Ｋｕｎｏｂ Ａ， Ｆｕｊｉｍｏｔｏｄ Ｚ， ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｄｕｌｅ １０ ｉｎ ａ ｆａｍｉｌｙ Ｆ／１０ ｘｙｌａｎａｓｅ ＦＸＹＮ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ Ｅ－８６ ｂｙ ｍｏｄｕ
ｌｅ ｓｈｕｆｆｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃｅｘ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｍｉ ａｎｄ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ，１９９９，４６０： ６１－６６． ［２０］ Ａｔｓｕｓｈｉ Ｋ， Ｄａｉｓｕｋｅ Ｓ， Ｓａｔｏｓｈｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－Ｌ－Ｄ－ｘｙｌｏｂｉｏｓｉｄｅ ｂｙ ｔｈｅ Ｅ１２８Ｈ ｍｕｔａｎｔ Ｆ／１０ ｘｙｌａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ Ｅ－８６ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ［Ｊ］． １９９９，４５０：２９９－３０５．
Reform of Industrial Enzymes by Protein Engineering
WU Hua-chang,DENG Jing, WU Xiao-li, HAN Sha
（Biotechnology Engineering Dept., Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000 ,China）Abstract: Strategies for protein engineering and using them to reforming basic properties of industrial enzyme including stability, activity, selectivity, surface properties are summarized. In addition, an application and prospects of industrial enzyme for protein engineering are discussed.
Key words: protein engineering; industrial enzyme; rational design; directed evolution
