流式细胞术概述
什么是流式细胞术？
流式细胞术是⼀种基于荧光的检测，从悬浮于溶液中的单个细胞就能同时测定多种特性，例如细胞计数和蛋⽩丰度。它是⼀种强⼤的⼯具，可实现细胞特性的快速、定量和准确测定，并且提供针对细胞异质性的卓越解读。 这是使⽤引导单个细胞流通过光源并测定各种波长中所产⽣的光能散射和发射的仪器实现的。研究⼈员使⽤具有不同激发和发射特性的荧光分⼦，以便能够合并、检测和区分它们，从⽽在单个细胞中获得多个读数。这些荧光分⼦可以附接到靶向特定蛋⽩或蛋⽩修饰的抗体上，或者它们可作为染料直接结合细胞组分。 何时使⽤流式细胞术
流式细胞术是⼀种⾼度通⽤的应⽤，可提供简单的单靶标读数或复杂的亚表型分析以及细胞信号转导分析。由于流式细胞术依赖于悬浮液中的细胞，为让细胞能够流过照明源，其与细胞作为单细胞悬浮液（例如，⽩细胞）⾃然存在的⽣物样品极易相容。然⽽，黏附细胞甚⾄是组织样品都可能被流式细胞术 当作单细胞悬浮液进⾏解离和分析。
流式细胞术⾮常适合于需要在单个细胞⽔平上获得定量信息，从⽽获得细胞⽔平和/或细胞⽔平的理解。正在分析的定量信息可提供有关给定类型细胞的数量、该细胞类型中存在的特定蛋⽩的数量或该蛋⽩的功能活性的见解，举⼏个⽰例。由于可同时收集多个读数，流式细胞术还能实现某细胞⽔平下各读数之间的相关性。
将此技术与蛋⽩印迹法等不可逆地将细胞组合成单个读数的应⽤形成对⽐。流式细胞术允许研究⼈员提出复杂的问题，例如，在作⽤下，3种免疫细胞类型中的 2 个关键信号转导通路的活性如何变化，并在⼏⼩时内通过标记和在流式细胞分析仪上运⾏单个样品来得到答案。对于相同的问题，使⽤蛋⽩印迹法则需要数天时间才能得到答案。
但并⾮所有⽣物学研究问题都能使⽤流式细胞术解决。组织中细胞的空间分布⽆法使⽤流式细胞术进⾏评估，因为需要在分析前将样品解离为单细胞悬浮液。对于该分析，优先使⽤免疫组织化学法或组织免疫荧光法。精细亚细胞分析更适合通过荧光和/或共聚焦显微镜进⾏的分析，但成像流式细胞分析仪在这⽅⾯取得迅速进展。基因突变或⼤规模 mRNA 分析更适合使⽤测序仪器进⾏。但是，当涉及快速细胞⽔平定量时，极少有测定法能够超越流式细胞术。
使⽤流式细胞术进⾏快速免疫表型分析
在细胞⽣物学中，流式细胞术的⼀种常见⽤途就是检测和定量样品中存在的细胞类型。由于不同的细胞类型在其表⾯上表达的蛋⽩不同，因此可实现细胞检测。抗体可特异性靶向这些蛋⽩，有效添加⼀个彩⾊标记，从⽽区分⼀种细胞类型与另⼀种细胞类型。
该过程称为免疫表型分析，使研究⼈员能够理解和监测某种异质细胞中存在的细胞类型的数量和百分⽐。免疫表型分析有益于表征免疫系统的各种组分，因为这些细胞存在于⾎液的悬浮液中，并且差异表⾯蛋⽩的特征极其明确。 [图⽚上传失败...(image-ff297a-1650293981092)]
⼈外周⾎单核细胞 (PBMC) 可以使⽤免疫表型分析分为各种细胞类型。在此实验中，使⽤靶向细胞表⾯的 CD3、CD4 和 CD8 蛋⽩的抗体检测T 细胞并进⼀步细分为 2 种主要亚。CD3 是⼀种在所有 T 细胞中均表达的蛋⽩，它将 T 细胞与其他⽩细胞（中间、粉⾊细胞）区分开来。⼀旦选择了 T 细胞，CD4+ 和 CD8+ 细胞就很容易区分。该实验还使⽤了⼀种死活细胞鉴定染料，以便从分析中排除死细胞（左图）。
尼龙扣免疫表型分析通过抗体荧光标记来实现，这⼀过程称为偶联。当靶向不同蛋⽩的抗体与发不同颜⾊荧光的染料偶联时，即使流式细胞分析仪同时检测到它们，也可对其进⾏独⽴分析。同时添加多种抗体的过程称为多重分析。多重分析只能同时涉及 2 种抗体或可延伸⾄多组抗体。这些抗体组能够实现单
个样品内多种免疫细胞类型的免疫表型分析，并且能够提供有关各种关键免疫细胞类型（例如 T 细胞、B 细胞和单核细胞）亚的更深⼊理解。
流式细胞术是精选⽤于免疫表型分析的⽅法，因为它⾮常快，每秒能定量数千个细胞。实验设置只需不到 30 分钟的时间，并且在单次检测中检测多个读数的能⼒意味着可在不到⼀⼩时的时间内标记、运⾏和分析样品。将此技术与蛋⽩印迹法进⾏对⽐，在蛋⽩印迹法中，不同细胞只能使⽤道闸广告机
基于抗体的富集步骤进⾏分析，以选择性纯化细胞。相⽐之下，这会增加已经很漫长的检测的时间，并且不提供细胞⽔平分析，从⽽⽆法评估纯化细胞中的异质性。
使⽤流式细胞术进⾏表型分析的另⼀个优势在于，该⽅法适合活细胞。因此，⼀些仪器能够在进⾏后续实验分析后，保留特定的细胞。此功能通常仅限于被称为分选仪的仪器。
荧光激活细胞分选法 (FACS)
琴谱架可实时使⽤正在通过流式细胞分析仪测定的特性，以在物理⽅⾯将细胞分选进不同的容器中。该过程需要⼀种称为细胞分选仪的特殊型流式细胞分析仪，且该过程称为荧光激活细胞分选法 (FACS)。特定荧光读数或读数集将定义为将该细胞放在⼀个特定容器中的临界值。这些读数可能来⾃细胞内的荧光蛋⽩，或者来⾃标记细胞的荧光抗体。FACS 中常使⽤暴露在细胞表⾯上的免疫表型标记物，因为
可以在细胞活着时使⽤抗体标记这些标记物。研究⼈员通常倾向于对活细胞进⾏分选，以便可使⽤经隔离的细胞进⾏后续实验。
使⽤胞内流式细胞术进⾏信号转导研究
⼤多数关键⽣物过程都发⽣在细胞内。因此，虽然细胞表⾯上的蛋⽩可以⽤来检测细胞类型，但胞内蛋⽩的丰度和活性可驱动⼏乎所有的细胞过程。对胞内蛋⽩进⾏定量的能⼒可提供对细胞⽣物学的机制见解，并能发现疾病状态下的异常活动。
各蛋⽩的数量并不是细胞能够进⾏调节和进⾏⽣物活动的唯⼀⽅法。当细胞需要传递来⾃细胞表⾯受体的信号时或在细胞本⾝内各种条件的刺激下，翻译后修饰 (PTM) 通常是永久性保存该信号的⼀种关键⽅法。PTM 在定义蛋⽩的基因序列中未编码，⽽是在蛋⽩翻译后发⽣的改变。PTM 通常包括通过添加⼀个⼩分⼦（例如磷酸盐、⼄酰基或甲基）来修饰蛋⽩内的单个氨基酸。PTM 还可包括添加⼀个⼩蛋⽩，例如泛素，或甚⾄是特定氨基酸序列蛋⽩的裂解物。
PTM 的⽬的通常是改变蛋⽩的活性、稳定性或功能，并且 PTM 中的原理就是磷酸化。磷酸化是细胞信号转导级联中研究最透彻的修饰。在磷酸化过程中，磷酸基被添加到蛋⽩内的氨基酸（通常是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）上。氨基酸的磷酸化（有时与其他同时发⽣的磷酸化事件相结合）通常会改变蛋⽩的功能。酶磷酸化可以作为激发酶的开关，从⽽使其能够作⽤于其特异底物。该酶的功能可能是
磷酸化⼀系列靶蛋⽩，从⽽启⽤或禁⽤其在细胞内的功能。磷酸化具有以下优点，即让细胞能够使已合成的现有关键功能蛋⽩进⾏某项活动，但在需要进⾏这项活动前，需保持此蛋⽩处于失活状态。当信号提⽰细胞需要进⾏这项活动时，细胞⽆需耗费时间来制造执⾏该项活动所需的酶和蛋⽩，⽽只需使⽤快速磷酸化级联来打开“开启”开关。
抗体具有特异性，因此仅当某蛋⽩在特定氨基酸上被磷酸化时，它们才能够结合该蛋⽩。如果蛋⽩仅在某个氨基酸上被磷酸化后才能发挥功能，那么抗体结合的量就是细胞内该蛋⽩功能活性的直接读数。这些抗体称为磷酸化特异性抗体，它们为研究⼈员提供了强⼤的⼯具来了解某种实验处理可能对细胞⽣物活性产⽣的影响。它们能够发现特异性改变⽣物学过程的复合物，这通常是识别潜在药物的第⼀步。
使⽤磷酸化特异性抗体通过流式细胞术可轻松检测磷酸化活动。实际上，凭借其灵敏度、定量和细胞⽔平数据采集，流式细胞术⾮常适合于细胞中磷酸化的分析。这种⽅法称为“磷酸化流式细胞术”，以将其与活细胞流式细胞术区分开来。进⾏此区分的原因在于⼏乎所有的蛋⽩磷酸化都发⽣在细胞内这⼀事实，甚⾄对于跨过细胞膜的那些蛋⽩也是如此。因此，使⽤磷酸化特异性抗体必然需要这样⼀个实验步骤，从⽽让抗体能够跨过质膜并到达细胞内的靶标。此外，必须固定细胞以阻⽌其⽣物活性并防⽌磷酸化⽔平在实验过程中发⽣变化。虽然在活细胞流式细胞术中不使⽤固定和通透，但是这些步骤很简单，并且不需要改变流式细胞分析仪即可对⼀般性的磷酸化或蛋⽩⽔平进⾏胞内检测。
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使⽤ Phospho-Stat6 (Tyr641) (D8S9Y) Rabbit mAb (Alexa Fluor 647 Conjugate) #10205 （实线）或浓度匹配的 Rabbit (DA1E)mAb IgG XP Isotype Control (Alexa Fluor 647 Conjugate) #2985 （虚线）对未经（蓝⾊）或已经 hIL-4（10 ng/ml，10 分钟；绿⾊）处理的 ACHN 细胞进⾏流式细胞分析。
流式细胞术如何⼯作？
流式细胞分析仪仪器简介
在流式细胞术中使⽤的仪器称为流式细胞分析仪，通常缩写为“细胞分析仪”。流式细胞分析仪由⼀个⽤于进⾏细胞处理的流体系统和⼀个包括数据采集信号检测器和处理器的光学系统组成。专为 FACS 设计的仪器还包含⼀个细胞分选组件，该组件可将细胞引导到不同的捕获容器中。®®®
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橡胶闸阀
流式细胞术系统和关键组件⽰意图
流体系统设计⽤于⽣成单细胞的均匀流，以确保当细胞被⽤于检测的光源照射时，能够进⾏适当分析。
这通过使⽤加压管将细胞从样品管注⼊流室中来完成。从容器（通常是⼀根试管或⼀块多孔板）中抽取细胞样品，并将其注⼊流动液体（称为鞘液）层流中间的流室中。通过⼀个称为流体动⼒学聚焦的流程，鞘液可帮助缩窄细胞流，从⽽将细胞组织成⼀⾏⼤致单⾏的流线。⼀些细胞分析仪还使⽤声学聚焦来进⼀步对齐细胞。这可实现在细胞通过细胞分析仪中的光学系统时进⾏同等照亮和检测。
如果流体系统未经过充分校准，或者正在进⾏分析的样品中的细胞数量过多，那么在流经光学系统时，细胞会发⽣混杂和重叠现象，从⽽妨碍适当的单细胞分析。为了降低这种现象发⽣的可能性，许多流式细胞分析仪都能让⽤户更改流速或样品注⼊鞘液的速度。通过减缓注射速率，同时保持鞘液流量恒定，⽤户能够拉⼤密集样品中细胞的间距，并重新让细胞流通过检测器。
流式细胞分析仪的光学系统包括照明源、过滤器、透镜和收集光学器件。照明源常包括 1 个或多个激光束，且每个激光器发射的光波长不同。激光器会照亮流经细胞分析仪的细胞或其他物体，并收集散射激光和荧光发射。通过流式细胞分析仪定量两种光散射活动。前向散射源于平⾏于激光束的光的衍射，并且通常是从激光器前⾯通过的物体⼤⼩的⼀个因⼦。侧向散射源于与激光束成 90° 的光的折射，并且会根据物体的复杂性和光密度差异⽽发⽣改变。来⾃物体的荧光发射经常源于正在检测中使⽤的荧光染料，但也可能由细胞内的⾃发荧光所引起或源于物体本⾝（在使⽤荧光微珠的情况下）。散射光和荧光发射的强度或数量通过光电⼆极管 (PD) 或光电倍增管 (PMTS) 来定量，其可将光⼦转换成可以显⽰和分析的数值。有多种不同的检测器，因此可单独定量光散射和发射荧光的不同波长。
检测器不区分各种光波长，⽽是通过放置在光路径中的过滤器来将光限制在所需波长范围内。营养米
流式细胞术检测的⼯作原理：抗体、荧光团和细胞染料的重要性
为了通过流式细胞术分析特定靶标，对细胞组分进⾏荧光标记。这可以通过使⽤单独的荧光分⼦（例如，细胞染料）或荧光团标记的抗体（直接偶联抗体或使⽤偶联⼆抗）来完成
流式细胞术中抗体的使⽤
抗体是许多⽣物检测中的关键⼯具，在流式细胞术中也不例外。抗体具有特异性结合单个蛋⽩或蛋⽩修饰的能⼒，并且可作为⼀种⽅法来标记那些⽤于进⾏检测的靶标。通过标记⽬的靶标，研究⼈员可以评估各种细胞类型、疾病状态、条件、发育阶段或其他⽣物模型中蛋⽩的丰度或活性。
与不同蛋⽩结合的抗体不会相互⼲扰，因此，可以使⽤多种抗体同时检测多个靶标。这称为多重分析。抗体数量的限制是独⽴于其他抗体测定每种抗体的能⼒。在流式细胞术中，这种差分测定使⽤称为荧光团的荧光分⼦来完成。成功的实验要求具有⾼度特异性和经验证的抗体以及可靠的荧光团。
流式细胞术中荧光团的使⽤
荧光团的共同特性是能够发射与⽤于照亮染料的光相⽐波长更长的光。例如，如果使⽤蓝⾊激光器来
照亮称为绿⾊荧光蛋⽩ (GFP) 的分⼦，那么蛋⽩会吸收蓝光并发射绿光。被吸收的光与被发射的光之间的波长差异称为斯托克斯位移。
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被荧光团吸收的光与被发射的光之间的波长差异称为斯托克斯位移。
就是这种位移让⼈们能够准确定量来⾃荧光团的光，因为它能够过滤来⾃激发源的光的波长。激发源总是⽐从正在分析的荧光团中发射的荧光更亮些，并且如果这种光⽆法移除，那么它将会强烈影响检测器。
荧光染料吸收的光的范围称为“激发”光谱，⽽激发时其发出的荧光称为“发射”光谱。激发和发射光谱针对所有常见染料提供，并呈曲线显⽰各波长下吸收或发射的光量。
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所显⽰的针对多种荧光团的发射光谱常⽤于流式细胞术中。光谱的 x 轴通常表⽰波长，y 轴表⽰发射强度。
细胞分析仪过滤和区分那些荧光团的能⼒。
颜⾊补偿
在多⾊流式细胞术中，荧光团的发射光谱会互相渗透。这种渗透称作光谱重叠，这意味着⼀些被检测到并归因于⼀个荧光团的光线实际上完全来⾃另⼀个荧光团（如下图所⽰）。如果不考虑此因素，该信号可能导致⽣物系统或实验结果的误解。校正此光谱重叠的过程称为“补偿”。补偿包括根据⼀个特定荧光团来确定发送到“错误”检测器的光量，然后减去每个受影响检测器报告的数值。可以通过单独运⾏每个荧光团和测定每个检测器中的光，或者通过运⾏“荧光减⼀”实验（在此实验中，每次减⼀个荧光团）来确定渗透量。然后，补偿包括根据所有染料的已知贡献来对检测到的光进⾏数学校正。例如，假设通常由检测器 #1 测定的荧光团信号中有 5% 正在通过检测器 #2 进⾏定量。然后通过计算检测器 #1 报告的信号的 5% 并减去检测器 #2 报告的信号百分⽐，补偿将适⽤于每个细胞。必须对每个细胞都应⽤这种⽅法，因为每个细胞具备的来⾃存疑荧光团的信号量各不相同。取决于流式细胞分析仪，颜⾊补偿可以通过定义特定荧光控制⾃动计算，或者在采集数据后⼿动应⽤。
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当来⾃⼀种染料的荧光发射渗透到到另⼀种染料的检测光谱中时，这称为光谱重叠或渗透。渗透要求进⾏数学补偿，以去除污染染料引起的荧光，如以上箭头所⽰。
⾯板设计
在单个实验中结合多种抗体时，需要进⾏适当的⾯板设计来确保⽣成可⽤数据。建议搭配使⽤最亮的荧光团与结合最低丰度抗原的抗体。在系统内有背景噪声的情况下，这会增强细胞分析仪准确检测和量化来⾃抗体的信号的能⼒。其次，应选择具有不同激发波长或⼴泛分离的发射光谱的荧光团，以最⼤程度地减少光谱重叠。这将确保可区分来⾃各抗体的荧光，并减少或补偿需求。随着⾯板中抗体数量的增加，维持光谱分离变得更加困难。超低碳钢
串联染料
串联染料（例如 APC-Cy 7、PerCP-Cy 5）的使⽤可进⼀步增加在单个实验中使⽤的颜⾊数量。⼀般来说，串联染料会增加激发波长和发射波长之间的位移。从⽽允许在荧光团的激发波长相同的情况下，使⽤更多抗体。串联染料使⽤⼀种称作荧光共振能量转移 (FRET) 的效应。在FRET 期间，第⼀个荧光团在特定波长时被激发，并且在达到其最⼤能量状态时，能量被转移到第⼆个荧光团上，从⽽导致第⼆个荧光团的光⼦发射波长⽐单独从第⼀个荧光团获得的要⼤。PE 和 APC 均⼴泛⽤于⽣成与各种花菁染料联合使⽤的串联染料，例如 Cy 5 或 Cy 7。使⽤串联染料进⾏颜⾊补偿可能更具挑战性，并且在应⽤不当时，可能会导致伪影。适当的补偿控制将会降低实验中误解数据的风险。
流式细胞术样品制备
针对流式细胞分析进⾏的样品制备是⼀个关键步骤，并且需要针对每种检测或抗体进⾏优化。⼀般来说，抗体结合⽬的分⼦的效率很⼤程度上依赖于实验步骤的条件（例如，固定和通透⽅法）。最佳实验步骤可能是细胞内分⼦位置、表位确认和可访问性，以及抗体结合⾮预期表位的潜⼒的⼀个函数。
染⾊、通透和固定
针对细胞分析且基于抗体的标记⽅法⼤体上可分为细胞表⾯或胞内抗原染⾊。虽然细胞表⾯染⾊可以在活细胞上进⾏，但胞内染⾊需固定和通透细胞。固定可确保在固定时保持细胞状态，防⽌在标记和分析细胞的整个过程中发⽣变化。⼀种常见且有效的固定剂是甲醛，其通过蛋⽩交联进⾏固定，⽽细胞膜仍完好⽆损。进⾏通透以使抗体能够通过细胞膜，从⽽结合胞内分⼦。通透剂的选择对于检测中使⽤的抗体的特异性和功能具有显著影响。通常使⽤甲醇等溶剂或 Triton™ X-100 或皂素等去垢剂实现通透。使⽤皂素进⾏的通透最不彻底；它通过结合胆固醇在质膜中形成孔道，但不会通透胞内膜结构，例如核膜或线粒体膜。Triton™ X-100 和甲醇能够充分通透⼤多数胞内膜，从⽽提供最彻底的通透。然⽽，甲醇可能会破坏表位，⼀些抗体（包括⼀些表⾯标记物）在进⾏甲醇通透后不起作⽤。
⼀些抗体在各种固定和通透条件下均起作⽤，⽽另⼀些则需要⼀套有限的试剂才能正确进⾏结合。这必须根据经验确定，在⼀种新实验步骤中使⽤⼀种抗体时，应进⾏仔细测试。
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