巨噬细胞EP3特异性敲除小鼠组织表达谱鉴定及巨噬细胞 过表达小鼠鉴定
摘要：EP3是前列腺素PGE2的四个受体之一，也是PGE2信号通路中主要的通过与Gi偶联蛋白，抑制腺苷酸环化酶的活性，降低胞内cAMP的溶度以及升高胞内Ca2+的溶度，从而引起多种生理病理反应，包括血管平滑肌收缩、动脉粥样硬化、炎症反应等。为了利用小鼠模型对巨噬细胞EP3基因的生理活性进行研究，轮转期间，主要进行了巨噬细胞EP3特异性敲除小鼠组织表达谱鉴定及巨噬细胞过表达小鼠鉴定，以便为进一步的实验研究提供可靠的小鼠模型。 关键词：EP3，基因型鉴定，表达谱检测；
1、研究背景
1.1 EP3受体
EP3受体是前列素（PGE）四个受体之一，是由PTGER3基因编码的蛋白，小鼠EP3的结构研究中，发现通过机体内C端选择性剪切的作用，产生了三种亚型，这三种亚型结合到不同的G蛋白偶联受体上，从而激活不同的第二信使通路。这三个亚型共同部分是由1005个核苷酸组成，编码335个氨基酸残基，再加上C末端编码的不同氨基酸残基。由于小鼠中它们的氨基酸序列同源性达到80%以上，他们分别被编 码为EP3α、β、γ。[1,2]
图1 Sequences of the C-terminal domains created by alternative splicing are shown.(ICHIKA WA, Y. SUGIMOTO and S. TANAKA, Proc. Jpn. Acad., Ser. B 86 (2010))[3]
EP3通过与G i蛋白偶联抑制胞内cAMP的合成及上调胞内Ca2+的浓度（图2）。此外，EP3通过G13蛋白偶联激活GTPase Rho的活性（图3）。[4]基于EP3的此种分子功能使EP3有着广泛的生理生化功能，涉及到消化、神经系统，肾脏的冲吸收和子宫收缩活动等以上的机制，使EP3有着广泛的生理生化功能，涉及到消化、神经系统，肾脏的冲吸收和子宫收缩活动等。
图2 图3
1.2 EP3与血栓栓塞
在已有的研究中，EP3可以通过结合到Gi上，从而抑制腺苷酸环化酶的作用，降低血小板的聚集[5,6]。在机体发生免疫的情况下，我们已经知道PGE2介导的发热中EP3的表达是必需的[7]，发现EP3在脑梗塞中也起着重要的作用，ONO-AE-248是EP3选择性的激动剂[8]，在MCAO模型中发生剂量依赖性的梗塞面积增大，同时加重NMDA诱导的毒性作用[9]。利用EP3-/-小鼠，检测了EP3对血小板的凝集作用，在EP3-/-小鼠中，PGE2在低浓度下的聚集作用消失，而利用EP3特异激动剂ONO-AE-248可以加强血小板的凝聚作用，这可以说明PGE2通过EP3可以调节血小板的聚集[10].在EP3-/-小鼠中，流血时间显著增强，在注射花生四烯酸引起的急性血栓性栓塞症中，相对野生型小鼠的死亡率显著下降，野生型的小鼠注射花生四烯酸后会发生肺动脉血栓形成以及肺泡出血，而在EP3-/-小鼠中这两个症状都很难发现。相似的，在EP3-/-小鼠中，在血管外膜周围花生四烯酸引起的颈静脉血管内血栓形成并未发生[11]。在动脉粥样硬化的研究中，，低浓度PGE2作用于EP3受体增强其它激动剂刺激的血小板活化；在ApoE和EP3双敲除小鼠体内，当动脉粥样硬化斑块机械性破裂后，斑块处产生的PGE2通过血小板上的EP3促进血栓形成[12,13]。此外，有研究表明，EP3激动剂通过Katp 通道的开放可以保护心脏的I/R损伤[14,15,16,17]，同时，心脏中特异性的过表达EP3可以减弱I/R损伤产生的心肌衰弱[18].
1.3 EP3与炎症
EP3在炎症过程中具有重要的生理作用。Morimoto[19]等人利用花生四烯酸分别在EP3四种受体缺失的小鼠中诱导炎症，发现只有EP3-/-的小鼠表现出炎症反应显著下降的现象。此外，利用PGE2在以上四种模型小鼠中进行炎症诱导，结果只有EP3-/-小鼠不能增强血管通透性。进一步实验表明，在EP选择性受体激动剂刺激下，也只有EP3受体特异性激动剂能够诱导血管通透性的增强，表明PGE2-EP3通路在炎症发生过程中具有重要的介导作用。
最近有研究表明，EP3在炎症扩张过程中具有作用。Morimoto 等人利用EP3-/-小鼠进行研究，阐明了PGE2通过EP3介导柱细胞胞内Gi的上升使柱细胞分泌组胺，诱导血管渗透压升高，IL-6促进neutrophil 聚集，从而导致炎症的扩张。（图4）[20]
图4 PGE2 acts on the EP3 receptor of nearby mast cells, and triggers degranulation and cytokine (IL-6) production. Histamine released by degranulation induces hyperpermeability, and IL-6 promotes neutrophil recruitment, leading to inflammatory swelling.
2、试验材料与方法
2.1.1巨噬细胞EP3特异性敲除的小鼠（mac-EP3 lys Cre+）建立
为了建立特异性基因敲除的小鼠，实验中利用Cre/LoxP系统对基因进行特定敲除。其原理是cre基因编码的Cre酶能对一对LoxP基因进行特异性剪切，如在WT小鼠的基因（基因型结构如图5a）的某一基因两侧插入一对LoxP基因，形成flox小鼠（基因基因型结构图5b).当小鼠体内有Cre酶的表达，那么两侧带有LoxP的基因被特异性敲除从而形成某基因特异性敲除的小鼠（基因型结构如图5 c）
Ptger 3 WT mice
a
Ptger 3flox mice
b
Ptger 3Δ mice
c
图5 EP3不同基因型结构图示(Michael Lazarus et al,2007)
为了建立EP3的小鼠，首先我们将EP3 Flox/Flox 小鼠与lys cre阳性的小鼠杂交，会得到EP3flox/wt基因型，若母代的Cre小鼠只有一条染体上有Cre阳性，那么子代就不一定会得到Cre基因，EP3则不会被切掉，获得的子代有EP3 Flox/Wt Cre+，将获得的子代自交，进行基因型鉴定。另一方面，对于EP3Flox/Flox Cre阴性的小鼠进行自交传代保种。其基因型鉴定体系如下：
表1区分EP3 Wt和EP3 Flox 条带扩增体系
ptger3+11189 10uM AGACTGATGTTTGCCCCTTG压铸机料筒的设计
ptger3+11591 10uM CCGAGAAACCCTTACCTCCT
tail DNA(30～50ng/ul) 3ul 94°C 3min
10×Buffer 2ul 94°C 30sec
2.5mM dNTP Mix 1.6ul 60°C 30sec
ptger3+11189 primer 0.4ul 72°C 1min
木材旋切机ptger3+11591 primer 0.4ul 40 cycles
ExTaq(Takara) 0.1ul 72°C 5mi n
water 12.5ul 4°C Pause
表2 鉴定EP3 KO 和EP3 Flox/Wt条带扩增体系
ptger3+10006 GGGCGATGGAGAGCAGAGC
ptger3+11591 CCGAGAAACCCTTACCTCCT
tail DNA(30～50ng/ul) 3ul 94°C 3min
2×GCBuffer 10ul 94°C 30sec
2.5mM dNTP Mix 1.6ul 55°C 30sec
ptger3+10006 primer 0.4ul 72°C 1min
ptger3+11591 primer 0.4ul 30 cycles
Primer starｌ 0.2ul 72°C 5min
water 4.5ul 4°C Pause
表4鉴定Macrophage Cre阳性的扩增体系
prCre-F 10uM AGGTGTAGAGAAGGCACTCAGC
prCre-R 10uM CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
prMEH-F 10uM AAGTGAGTTTGCATGGCGCAGC
prMEH-R 10uM CCCTTTAGCCCCTTCCCTCTG
Pcr mix 10 ul 95°C 5min
Primer prCre-F 0.375ul 95°C 30sec
Primer prCre-R 0.375ul 63°C 1min
工艺品加工设备
疏水二氧化硅
山药去皮机Primer prMEH-F 0.375ul 72°C 1min
挤压件
Primer prMEH-R 0.375ul 35°C cycle
Water 7.5ul 72°C 5min
模板1ul 10 pause
2.1.2 巨噬细胞EP3过表达小鼠的建立
为了建立巨噬细胞EP3 过表达（EP3 overexperess）的小鼠，首先利用构建的含有EP3基因的表达载体（pRP.ExBi-CD68 promoter-EP3a-IRES-eGFP)导入C57BL/6小鼠中（此工作由Cyagen生物公司完成）。由于从公司只拿到7只巨噬细胞EP3过表达的小鼠，我们先挑取A、C、E三只小鼠与C57BL/6小鼠杂交，然后得到的子代进行自交，以扩大巨噬细胞EP3过表达的小鼠体系，将获得的子代自交，进行基因型鉴定。鉴定体系如下：
表5鉴定EP3 overexpress基因型的扩增体系
primer F1 CTAGGACTCCGTTTGCACCCAT
primer R1 CGCAGTCGTCGGTAGTACTTGACA
Internal control primer F CAACCACTTACAAGAGACCCGTA
Internal control primer R GAGCCCTTAGAAATAACGTTCACC
2xPCR Mix 10ul 95℃ 5min
F1 0.5ul 94℃ 30s
R1 0.5ul 62℃ 30s
IF 0.5ul 72℃ 30s
IR 0.5ul 40cycle
ddH2O 6ul 72℃ 5min
DNA 2ul 10℃ forever
2.2小鼠DNA的提取
1. 将小鼠编号时剪下的脚趾装入EP管中并离心至管底，每管加500ul Lysis
buffer+3ul proteinase K，55℃过夜裂解。
2. 过夜裂解后，离心12000g、10min，取上清至另一EP管中加入500ul苯酚/氯仿/异丙醇（25:24:1），剧烈震荡后，室温静置5min。
3. 将静置液离心12000g、10min，吸取上层液于新EP管中，加入500ul-20℃预冷的无水乙醇，剧烈震荡后，冰上静置5min。
4. 静置结束后离心12000g、10min，可见少许白沉淀于管底，去上清，室温晾干。
5. 晾干后，向管中加入适量的ddH2O,55℃金属锅中煮20m。
6.PCR扩增：将提取的DNA按照相应的体系进行扩增，最后进行DNA凝胶电泳，进行DNA鉴定。
