慢病毒介导稳定高表达Cx32的Huh7细胞系建立及其对细胞增殖的影响 纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静
【摘 要】Aim To construct a lentiviral vector for stable delivery of the connexin32 (Cx32) gene in human hepatocellular carcinoma cell line Huh7,and also to detect its effect on cell proliferation.Methods Human Cx32 gene sequence was obtained by whole gene synthesis and amplified by PCR,and was then inserted into LV5-GFP lentiviral vector to construct the recombinant plasmid LV5-GFP-hCx32.Following identified by restriction endonuclease digestion and DNA sequencing,this plasmid together with lentiviral package plasmid was transfected into 293T cells to produce the lentiviral particles,and the viral titer was assessed under fluorescent microscope.Targeted Huh7 cells were infected with the lentivirus (LV5-hCx32 and LV5-NC),and the infected cells after selection with puromycin were amplified and cultured.The expression and localization of Cx32 were detected by real-time RT-PCR,Western blot and immunofluorescence assay,respectively.The gap junction (GJ) function between adjacent cells was measured by dye transfer assay.The Huh7 cell prolifer
ation capacity was determined by MTT and colony formation assays.Results The results of double enzyme digestion and DNA sequencing proved that the recombinant lentiviral vector LV5-GFP-hCx32 was successfully constructed.After packing in 293T cells,the recombinant lentivirus LV5-GFP-hCx32 with virus drops to 3 × 1011 TU · L-1 was obtained.Huh7 cells transiently infected with the lentivirus LV5-GFP-hCx32 remarkably over-expressed Cx32 at both mRNA and protein levels.Moreover,Cx32 expression was also significantly up-regulated in stably transfected Huh7 cells,and the presence of enhanced functional GJ in intact cells could be detected due to an increased amount of Cx32 protein along the plasma membrane at cell-cell contacts.Compared to LV5-NC group,the proliferation ability in Huh7 cells with recombinant Cx32 declined (P ＜ 0.05).Conclusions The lentiviral vector over-expressing Cx32 gene is successfully constructed,and can stably transfect Huh7 cells to yield sustained over-expression of exogenous Cx32 gene,thus eventually inhibits cell proliferation.%目的 构建LV5-hCx32慢病毒表达载体,获得稳定高表达人缝隙连接蛋白32(connexin32,Cx32)的Huh7人肝癌细胞系,并研究Cx32对Huh7细胞增殖的影响.方法 采用全基因合成法并经PCR扩增得到Cx32基因 新海岩三部曲
序列,将所得目的片段克隆到LV5-GFP载体上,获得重组慢病毒质粒LV5-GFP-hCx32,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,与慢病毒包装质粒系统共转染293T细胞中,包装成重组慢病毒颗粒,经荧光显微镜测定重组慢病毒滴度.将慢病毒载体LV5-hCx32和LV5-NC感染Huh7细胞,嘌呤霉素筛选出细胞阳性克隆并扩大培养.qRT-PCR、Western blot和免疫荧光法分析Cx32的表达及定位;细胞接种荧光示踪法检测细胞缝隙连接(gap junction,GJ)功能;MTT法及克隆形成实验观察细胞增殖能力的变化.结果 双酶切及测序结果表明LV5-GFP-hCx32慢病毒载体构建成功,经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为3×1011TU·L-1的重组慢病毒LV5-GFP-hCx32,慢病毒瞬时感染后的Huh7细胞中Cx32 mRNA和蛋白表达水平明显增多,筛选后建立的稳定转染细胞系中Cx32也稳定高表达,并且部分表达于细胞膜,形成有功能性的GJ.过表达Cx32的Huh7细胞增殖能力减弱(P＜0.05).结论 成功构建Cx32基因过表达慢病毒载体,该载体能够稳定感染Huh7细胞,使外源基因Cx32过表达并抑制细胞的增殖能力. 【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2018(034)002
【总页数】6页(P284-289)
【关键词】肝细胞癌;缝隙连接蛋白32;慢病毒;载体构建;稳定转染;靶点
【作 者】纪玉婷;杨燕;郑荣生;张吴琼;刘静
成绩管理系统
【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004;蚌埠医学院第一附属医院肿瘤内科,安徽蚌埠233004
【正文语种】中 文
【中图分类】R329.24;R373.9;R735.7;R735.702.2;R977.6
消化道肿瘤是人类面临的重大难题，原发性肝癌是消化系统肿瘤的重要构成，其中约90%为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。HCC全球发病率及死亡率均居于前列，起病隐匿，初期症状不典型，一经发现多进展为中晚期，且增殖旺盛、侵袭迁移能力强，手段有限，这些导致其预后极差，现状不容乐观。因此，寻HCC的新靶点具有重要的临床价值及科学意义[1]。研究发现，HCC的发生发展和缝隙连接蛋白(connexin，
Cx)功能异常有关[2]。Cx作为缝隙连接(gap junction，GJ)的结构蛋白，可以通过GJ依赖性和非GJ依赖性方式，对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起重要的调控作用[3]。Cx32 是人类肝脏中主要表达的Cx亚型蛋白，也是肝细胞GJ的主要组分[2]。一般认为Cx32为肿瘤抑制基因[4]，肝细胞的癌变过程伴随有Cx32的减少或缺失[5]；而向HCC细胞过表达Cx32，肿瘤细胞生长、增殖和转移能力呈负性调控[6]。但研究同时发现，Cx32在细胞质的异位蓄积也会促进HCC的进展[7]。此外，近年来也有资料显示，Cx在某些情况下可能有利于肿瘤的进展[3]。可见Cx32与HCC生物学行为之间的关系及分子机制尚需进一步阐明。本研究通过构建LV5-hCx32慢病毒载体，并将其导入人肝癌Huh7细胞系，建立稳定过表达Cx32的Huh7细胞株，不仅为进一步研究Cx32及其组成的GJ在HCC中的生物学功能提供有力的工具，也将为基于Cx的靶点药物研究奠定实验基础。
1 材料与方法
1.1 材料 大肠杆菌TOP10、人胚肾293T细胞及人肝癌细胞Huh7由本实验室保存；LV5-GFP及包装质粒(pGag /Pol、pRev、pVSV-G)购自苏州吉玛基因股份有限公司；NotⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA连接酶及DNA marker购于Fermentas公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒
陈gc提取试剂盒、普通DNA产物回收试剂盒均购自天根生化科技有限公司；TRIzol、Lipofectamine 2000、Opti-MEM、DAPI及钙黄绿素(calcein-AM)购于Invitrogen公司；Cx32、GAPDH引物由苏州吉玛基因股份有限公司合成；逆转录试剂盒及PCR所用酶、buffer、dNTP等均购于Promega公司；DMEM干粉、胎牛血清及胰蛋白酶购自Gibco公司；无水乙醇、异丙醇、溴化乙锭、Polybrene、嘌呤霉素、MTT、结晶紫及鼠抗人Cx32抗体购于Sigma公司；鼠抗人β-actin单克隆抗体、HRP及FITC标记的二抗购自Amersham公司；BSA蛋白定量试剂盒及丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺均为Bio-Rad公司产品；ECL-plus化学发光试剂盒购自Millipore公司。
1.2 方法
1.2.1 目的基因片段的获取和扩增 参照GenBank中人Cx32 mRNA的CDS全长序列(NM_001097642.2)，利用全基因合成方法获得基因片段，由苏州吉玛基因股份有限公司合成，并在目的基因上、下游引物分别加上NotⅠ和Bam HⅠ及保护碱基，以此为模板进行PCR扩增。反应条件为：95℃ 预变性3 min，94℃ 变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 个循环；最后72℃延伸5 min，扩增片段经琼脂糖凝胶电泳并切胶回收。
1.2.2 LV5-GFP-hCx32重组质粒构建扩增和鉴定 使用NotⅠ和Bam HⅠ分别双酶切目的基因hCx32及LV5空载体，DNA连接酶在连接缓冲液中22℃连接2 h。连接后的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，收集转化后的菌液，涂布在含50 mg·L-1氨苄青霉素的LB培养皿上，37℃倒置培养12～16 h，挑取阳性菌落，扩增进行质粒酶切鉴定，小量抽提质粒，送苏州吉码基因股份有限公司测序鉴定，获取重组质粒LV5-hCx32。
1.2.3 重组慢病毒及阴性对照慢病毒的包装和浓缩 转染前24 h，将生长状态良好的293T细胞胰酶消化，重悬接种于15 cm培养皿中，待细胞密度达到50%时，将重组慢病毒质粒LV5-hCx32和包装质粒经Lipofectamine 2000共转染至293T细胞中，用无血清DMEM培养基培养6 h后，换成含10% FBS的DMEM培养基培养。72 h后收集病毒上清液，4℃、4 000 r·min-1离心4 min；低速离心后，用0.45 μm过滤器过滤，滤液经4℃、20 000 r·min-1超速离心2 h，收集浓缩液-80℃保存。重组慢病毒颗粒命名为LV5-GFP-hCx32，用上述相同方法获得阴性对照LV5-NC慢病毒颗粒。
1.2.4 病毒滴度测定 293T细胞培养至80%～90%融合，胰酶消化重悬细胞，按每孔0.5×105～1×105的密度接种至96孔板，每孔体积100 μL，培养24 h。取慢病毒原液10～2
0 μL，用10% FBS的DMEM 培养液10倍稀释3～5个梯度，吸去96孔板中的培养液，每孔加入500 μL稀释的病毒液，同时设立空白对照组，于37℃、5% CO2培养24 h；吸弃96 孔板中的稀释病毒液，每孔加入 1 mL 10% FBS的DMEM培养液，37℃、5% CO2继续培养 24 h。通过荧光显微镜计数荧光细胞，结合稀释倍数计算病毒滴度。
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1.2.5 重组慢病毒及阴性对照慢病毒转染目的细胞Huh7 将对数生长期的Huh7细胞，以2.5×105/孔密度接种于24孔板，每孔0.5 mL，培养24 h后，细胞融合率达40%～60%，吸去细胞上清，加入培养基360 μL、40 μL不同梯度的病毒液(慢病毒原液达1011 TU·L-1)及5 mg·L-1的Polybrene，每组3个复孔，以Lipofectamine 2000将质粒感染Huh7细胞，8～12 h后观察细胞状态，待细胞状态与未感染组无明显差异时，24 h后更换为新鲜培养基培养，72 h 后荧光显微镜下观察荧光表达情况，确认目的细胞的感染方法和感染参数。
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