慢病毒Tet-On系统调控Notch1-EGFP融合蛋白在PC12细胞中表达的研究 刘永敏;段萍;黄春田;李博;韩雪飞;许燕;鄢文海;邢莹
【摘 要】目的:构建Tet-On系统调控的人源性Notch1胞内段(NICD)和EGFP融合蛋白的慢病毒真核表达载体,并探讨Notch1-EGFP在PC12细胞中的表达条件.方法:采用RT-PCR从人胎盘组织中获得NICD的cDNA,利用PCR扩增pEGFP-Cl质粒中EGFP的编码序列,两者均定向克隆到pcDNA3.1(+)质粒中组成Notch1-EGFP片段,将该片段进一步酶切回收,并定向克隆到pLVX-Tight-puro载体获得pLVX-Notch1-EGFP.将构建好的质粒进行病毒包装并感染PC12细胞,抗性筛选2周.在不同时间点和不同浓度Dox作用下,用荧光显微镜观察EGFP表达,流式细胞术检测Notch1表达.结果:酶切和DNA测序均证实pLVX-Notch1-EGFP质粒构建成功.镜下可见感染后的PC12细胞在500 ng/ml Dox诱导36 h时90％以上细胞均表达EGFP.流式细胞术检测Notch1表达结果显示,随着Dox浓度增加,Notch1阳性细胞百分比逐渐增加；随着Dox诱导时间延长,Notch1阳性细胞百分比逐渐增高,到36h时达到最高(81.5％).结论:成功构建携带Notch1-EGFP融合蛋白的Tet-On调控的慢病毒真核表达载体,实现在PC12细胞中调控Notch1-EGFP融合蛋白的表达.
【期刊名称】《中国应用生理学杂志》
【年(卷),期】2012上海中考数学2013(029)003
【总页数】6页(P232-237)
【关键词】Notch1;可诱导的慢病毒;Tet-On系统;PC12细胞
【作 者】刘永敏;段萍;黄春田;李博;韩雪飞;许燕;鄢文海;邢莹
【作者单位】郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学病理生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学病理生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;郑州大学病理生理学教研室,河南郑州450001;郑州大学干细胞研究中心,河南郑州450001;新乡医学院生理学教研室,河南新乡453003
【正文语种】中 文
【中图分类】Q28n-二甲基亚硝胺
Notch信号是一个在进化过程中高度保守的信号通路，Notch基因在许多组织细胞中都有表达，包括中枢神经系统、胰腺、造血细胞等，它编码一种跨膜受体蛋白，参与调节各种细胞分化及发育的信号转导途径［1-3］。Notch信号通路的失调与多种神经系统肿瘤形成密切相关。
在体内Notch信号通路始终处于一个动态调控过程中，因此建立一个可调控的研究体系有利于研究Notch信号通路在不同时间点的作用差异。在可调控的真核生物基因表达系统中，四环素调控系统被认为是目前最为理想的选择，该系统具有严密性、特异性、高效性、低毒性等优点，被广泛地应用到生物医学研究中。
在本研究中我们构建Tet-on调控的携带增强型绿荧光蛋白（EGFP）的人源性 Notch1胞内段（Notch1 intracellular domain，NICD）融合蛋白的慢病毒真核表达载体，并探讨四环素基因表达系统调控Notch1-EGFP在大鼠嗜铬细胞瘤细胞系（PC12细胞）细胞中表达的时间和浓度的量效关系，为研究Notch信号通路的作用提供一条更灵活更科学的途径。
1 材料与方法
office97
可持续发展的内涵基恩乐队1.1 材料
1.1.1 人体胎盘组织 正常人胎盘组织取自河南省人民医院，根据国务院《医疗机构管理条例》规定，患者签写知情同意书，符合伦理学标准。
1.1.2 试剂 大肠杆菌 JM109、pEGFP-C1质粒、pcDNA 3.1（＋）载体、PC12细胞为本实验室常规保存、pLVX-Tight-Puro载体，pLVX-Tet-On Advanced及Lenti-XTM HTX Packaging System载体购自ClonTech公司，总RNA提取试剂盒（Trizol）购自北京天根公司，cDNA第一链试剂盒购自formatas公司，限制性内切酶 BamH I、EcoR I、Nhe I、Xba I、T4连接酶、DNA Marker（1kb，DL2000，DL1000）、PCR premix购 自Takara公司，DNA凝胶回收试剂盒、高纯度质粒抽提试剂盒购自Axygen公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司（英国），琼脂粉购自 Genehk公司，G418购自 Genview公司，嘌呤霉素购自 Solabio公司，流式破膜固定试剂盒、PE Mouse Anti-Mouse Notch1购自BD公司，盐酸强力霉素购自上海楷洋生物有限公司。 1.2 pcDNA3.1-Notch1真核表达载体的构建
根据 Notch1（NM-017617.3）的功能编码区序列和pcDNA3.1（＋）载体的多克隆位点，选择BamHI和XbaI酶切位点作为酶切位点设计引物，引物由上海生物工程有限公司合成Notch1-F：5＇CGCGGATCCATGCGCAAGCGCCGGCGGCAGCAT3＇；Notch1-R：5＇ACGTCTAGACACGTCTGCCTGGCTCGG3＇，下划线部分分别表示BamHI和XbaI的酶切位点。参照总RNA提取试剂盒（Trizol）说明抽提人胎盘组织的总RNA，用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒反转录cDNA第一链，PCR扩增Notch1胞内段（NICD）cDNA。PCR反应体系总体积 50μl，其中含模板 cDNA 2μl，2×Premix 25μl，Notch1-F 1μl，Notch1-R 1μl，灭菌双蒸水21μl。PCR反应条件：94℃，预变性 5 min；进入循环：94℃1min，60℃ 90 s，72℃ 90 s，共 30个循环；72℃延伸10min。扩增反应结束后PCR终产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用无水乙醇纯化PCR产物。将带有酶切位点PCR产物用BamH I和XbaI进行双酶切，回收目的基因片段，将 pcDNA3.1（＋）载体进行相应的酶切，回收线性化载体。将载体与目的基因按摩尔比1∶5连接过夜，将上述连接产物转化感受态菌 JM109，涂板，，挑选阳性克隆进行 BamH I和XbaI双酶切鉴定并送上海生物公司测序。鉴定正确的克隆命名为pcDNA3.1-Notch1。中央党校
1.3 pcDNA3.1-Notch1-EGFP载体的构建
以pEGFP-C1为模板进行PCR扩增EGFP基因，扩增产物为744 bp。EGFP扩增引物为：EGFP-F：5＇GGGCCCTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3＇；EGFP-R：5＇GGGCCCGCTAGCGAATTCTTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGT 3＇，下划线部分分别为 XbaI、NheI和EcoRI的酶切位点，EcoRI为引入的验证酶切位点。PCR反应体系40μl，其中含模板质粒 pEGFP-C1 2 μl，Premix 20μl，EGFP-F 1μl，EGFP-R 1μl，灭菌双蒸水16μl。PCR反应条件：94℃，预变性5min；进入三温循环：94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 30 s，共 30个循环；72℃延伸10min。将纯化后的PCR产物经XbaI和NheI双酶切产生两个同尾粘末端，回收目的片段。以XbaI酶切 pcDNA3.1-Notch1，DNA凝胶电泳回收载体片段。T4 DNA连接酶连接上述EGFP和线性化pcDNA3.1-Notch1。连接产物转化感受态大肠杆菌JM109细胞，涂板，过夜培养。挑单克隆做菌落PCR，挑选EGFP扩增阳性克隆进一步提取质粒，用EcoR I和BamH I双酶切，DNA凝胶电泳，根据酶切后片段长度判段EGFP的连接方向。鉴定正向连接的克隆命名为pcDNA3.1-Notch1-EGFP。
1.4 pLVX-Notch1-EGFP载体的构建
用EcoR I和 BamH I双酶切 pcDNA3.1-Notch1-EGFP，DNA凝胶电泳并胶回收Notch1-GF
P片段。用EcoR I和BamH I双酶切pLVX-Tight-Puro载体，DNA凝胶电泳并胶回收线性化载体。将线性化的pLVXTight-Puro载体和Notch1-EGFP片段用T4连接酶连接，连接产物转化感受态JM109后涂板培养。挑单克隆做菌落PCR，挑选EGFP扩增阳性克隆送生物公司测序。测序正确的载体命名为pLVX-Notch1-EGFP。
1.5 慢病毒包装
包装前24 h，分别接种4～5×106个293T细胞到2个100mm培养皿中。按照慢病毒包装试剂盒（Lenti-XTM HTX Packaging System，Clontech）说明书，分别包装 Tet-On调控系统的反应质粒（pLVX-Tight-Puro-NICD-EGFP）和调控质粒（pLVX-Tet-On Advanced），准备两个 1.5 ml的 EP管 A、B，A管加入557μl的 Xfect Reation Buffer，36μl Lenti-X HTX Packaging Mix，7μg的目的质粒，B管加入592.5μl Xfect Reaction和 7.5μl Xfect polymer，涡旋混匀，将 B管的试剂逐滴加入A管中，涡旋混匀，室温孵育10 min，将A管液体逐滴加到293T细胞中，轻轻晃动培养皿使之混匀，放入培养箱中37℃、5%CO2孵育8 h后换新鲜培养基，再培养36 h收获病毒上清，500×g离心10 min去除细胞碎片。病毒上清可马上用于感染，或分装置于-80℃保存。
1.6 慢病毒感染PC12及抗性筛选
感染前24 h接种2×105 cells／well的 PC12细胞于六孔板，病毒感染时细胞50%～70%融合。按照1∶1的比例每孔各加pLVX-Tight-Puro-NICD-EGFP和pLVX-Tet-On Advanced病毒上清400μl，并各加入终浓度为4μg／ml的 polybrene。感染 8～12 h后，吸出原培养基，换为终浓度为 600μg／ml G418和 1.5μg／ml嘌呤霉素培养基进行筛选。之后每3天更换一次抗性培养基，连续筛选14 d，命名该细胞为PC12-Notch1细胞。
1.7 Dox调控Notch1-EGFP的表达
接种1×104 cells／well的 PC12-Notch1细胞于24孔板，分为 Dox（＋）组和 Dox（-）组，每组设 5个平行样，在Dox（＋）组培养基中加入终浓度为500μg／ml Dox，Dox（-）组不加 Dox。观察荧光前进行 DAPI核染，在培养基中加入 DAPI（终浓度为 50 g／ml），37℃、5%CO2孵育2 h后弃去培养基，PBS洗两遍。分别在 Dox加入后的 0 h、12 h、24 h、36 h和 48 h于荧光倒置显微镜下观察EGFP表达和DAPI核染，计算EGFP阳性细胞百分比（EGFP阳性细胞数／DAPI阳性细胞数×100%）。
1.8 流式细胞术检测Notch1表达
1.8.1 检测Dox诱导下不同时间点的Notch1表达接种1×104 cells／well的 PC12-Notch1细胞于 24孔板，共5组，每组三个平行样，均加入终浓度为500 ng／ml Dox，分别在加入 Dox后的 0 h、12 h、24 h、36 h和48 h收集细胞，按照流式破膜固定试剂盒的步骤处理，上机检测Notch1的表达量及表达Notch1的阳性细胞百分比。独立实验重复三次。
1.8.2 检测不同Dox浓度诱导下的Notch1表达接种1×104 cells／well的 PC12-Notch1细胞于 24孔板，分别用不同浓度Dox诱导，终浓度分别为0 ng／ml、100 ng／ml、500 ng／ml、1μg／ml、5μg／ml和 10μg／ml。每个浓度设三个平行样。诱导36 h后收集细胞，按照流式破膜固定试剂盒的步骤处理 PC12-Notch1细胞，上机检测 Notch1的表达量及表达Notch1的阳性细胞百分比。独立实验重复三次。
1.9 统计学分析
所有数据以均数±标准差（±s）表示，统计处理用SPSS 13.0软件进行独立样本t检验。
