LncRNA的qPCR引物如何设计？在设计的时候有没有需要特别注意的地⽅？如何能设计出最好的qPCR引物。基于这些问题，总结⾃⼰10年qPCR引物设计经验分享给⼤家。
LncRNA的qPCR引物相⽐于编码基因，是要复杂。导致其复杂的原因并不是引物设计原则上有特别之处，⽽是在于有太多的LncRNA数据库，数据库之间往往没有关联，且不同数据库的维护也不尽相同。今天的⽂章分两块：LncRNA数据库介绍和LncRNA引物设计注意事项。 LncRNA数据库介绍
1、NCBI RefSeq
NCBI不多做介绍，通常LncRNA信息我们参考RefSeq数据库中的数据，RefSeq数据库中的数据参考数据，是经过⼈⼯审核，其数据信息可信，注释全⾯。RefSeq数据库中LncRNA的命名通常是NR_或者XR_开头，后⾯加数字，其外显⼦信息位置，数量信息⾮常完整。 2、Ensembl
陈迪网球相同的LncRNA，Ensembl数据库中信息往往要⽐NCBI多很多，特别是转录本数量。且数据变化⾮常快
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且变化会很⼤，可能昨天浏览这个数据库中某个LncRNA只有2个转录本，隔天再去看的时候，可能就变成3个甚⾄更多。NCBI就不同，尽管更新频率也⾮常的快，但是LncRNA的变化通常很⼩，转录本数量基本不变化，序列变化的可能性也⾮常的⼩。 image
3、UCSC
UCSC数据库的LncRNA数据个⼈认为更新相对较慢，但有些LncRNA名称如uc001ylu就需要前往UCSC数据库查询其序列信息。UCSC Genome Browser可以根据基因组的位置、基因ID、转录本等信息进⾏浏览查询。
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4、RNAcentral
RNAcentral 整合了包括 Ensembl、GENCODE、Greengenes、HGNC、LNCipedia、lncRNAdb、miRbase、NONCODE、RDP、RefSeq、Rfam、SILVA 在内的多个数据库。
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5、NONCODE
NONCODE是⼀款综合性的数据库，该数据库是⼀个⽐较全⾯的ncRNA相关注释的数据库，尤其是lncRNA信息，不仅⽀持常⽤lncRNA的Name、NONCODE Gene ID（例如：NONHSAG036681.2）搜索，部分lncRNA⽀持其他数据库名字进⾏搜索。该数据库⽬前收⼊了很多物种，主要是动物⽅⾯的，包括⼈、⼩⿏、⼤⿏、奶⽜、鸡、果蝇、斑马鱼、线⾍、酵母、拟南芥、⿊猩猩、⼤猩猩、恒河猴、复⿏、鸭嘴兽、猩猩。数据库包含信息丰富，包括表达、功能、与疾病关系、染⾊体位置、序列保守性等，并可进⾏序列Blast搜索，同时⽀持数据下载。
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6、Lncipedia
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LNCipedia数据库整合了多个⼈类（Human）LncRNA数据库信息，很⼤程度上解决了LncRNA数据库各⾃为政的问题，这些数据库包括LncRNAdb、Broad Institute、Ensembl、Gencode、Refseq、NONCODE、FANTOM，同时还包括Nielsen, Hangauer等多篇⽂献中发现的LncRNA信息。⽬前已经更新到5.2版本，包括127,802 转录本序列和 56,946 条基因。
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7、Lncrnadb
该数据库可以查询类似LINC00066, NCRNA00066名称的LncRNA。lncRNAdb数据库是⼀个真核⽣物的lncRNA综合数据库。它包括特异的序列结构信息，如转录本、基因组位置、表达、亚细胞定位和保守位点以及相关的功能和疾病。
数据库介绍总结：前⾯提到LncRNA的qPCR引物设计相⽐与编码基因确实要难，其原因就体现在LncRNA的数据库是在太多，⽽我们设计得到的qPCR引物通常都需要进⾏引物特异性⽐对，最好⽤的莫过于NCBI Primer-Blast，但是在特异性⽐对可供选择的⽐对数据库都只是NCBI，其他LncRNA数据
库⽆法选择。接下来，⼩编就分享下⾮NCBI RefSeq来源的LncRNA的qPCR引物设计应该怎么做？
LncRNA 的qPCR引物设计注意事项
LncRNA的qPCR引物设计最主要的三个原则：跨外显⼦设计，特异性⽐对，引物位置。
1、跨外显⼦设计
跨外显⼦设计的⽬的就是避免基因组的污染，跨外显⼦设计有两种办法，具体见⽰意图：
（1）正向F引物和反向R引物落在不同的外显⼦上
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此处注意：（a）如果产物⼤⼩允许，正向F引物和反向R引物可以落在不同的外显⼦上；（b）如果正向F引物和反向R引物只能落在两个相邻的外显⼦上，那优先选择内含⼦最⼤的两个外显⼦上。
（2）正向引物或者反向引物跨了两个外显⼦
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此处注意：（a）如果能选择（1）就不要选择（2）⽅法设计，（2）设计⽅法引物位置受限，设计得到的引物参数可能不是最优。（b）如果选择（2）⽅法设计，那跨两个外显⼦的引物的3端序列不要跨第⼆个外显⼦太多序列，建议不要超过6个碱基，否则就相当于没有跨外显⼦设计。
2、特异性⽐对
从上述数据库中查到LncRNA的序列信息后，建议先使⽤NCBI进⾏⽐对，简单做⼀个核苷酸⽐对和基因组⽐对。核苷酸⽐对的⽬的是看看这条LncRNA有没有与NCBI RefSeq同源性较⾼的序列信息。如果有，可能涉及到需要判断他们是否是同⼀条基因的问题。基因组⽐对的⽬的是简单判断其外显⼦个数组成，因为有些LncRNA数据库可能没有提供外显⼦数量信息和外显⼦位置信息。⽐对其实就是⼀个不同数据库之间LncRNA 信息的转换，当统⼀后，那LncRNA引物设计就容易许多。
3、引物位置
引物尽量不要落在LncRNA序列两端100bp序列以内，原因是防⽌两端序列不准确。曾经碰到⼀个⽼师，⾃⼰使⽤RACE验证Ensembl数据库中的LncRNA序列，发现两端序列有缺失。
4、同源区设计
本⼈设计qPCR引物通常都选择在同源区设计，检测其总RNA情况，具体根据各⾃实验要求⽽定。这
⾥不多做展开介绍。
