逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr）
实验方法原理
提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。 实验材料
组织 细胞
试剂、试剂盒
RNA提取试剂 dNTP混合物 Taq DNA聚合酶 第一链cDNA合成试剂盒
仪器、耗材stkx
离心管 离心机 水浴锅 PCR管 电泳仪 凝胶图像分析系统
移液管 移液 离心管盒
实验步骤
一、总RNA的提取
二、cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
燕京大学现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1． 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 ul。在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；
2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；
3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM） 2 ul；
下游引物（10 pM） 2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul） 1 ul。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；
4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；
5． 于70℃加热15 min以终止反应；
6．将管插入冰中，加入RNase H 1 ul ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
三、PCR
1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；
2．加入适量的ddH2O，使总体积达50 ul。轻轻混匀，离心；
3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
注意事项
1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；
国网技术学院2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反
应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；
4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；
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5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶处理RNA； 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。
6．反转录酶的选择
（1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃；
（2）禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃；
华硕n80>路易斯康（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构；
（4）MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
7．合成cDNA引物的选择
（1） 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
（2） Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3'端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，
故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
（3）特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3'端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。
