发表时间：2011-06-10T13:30:19.450Z 来源：《中外健康文摘》2011年第13期供稿作者：宋艳荣刘爱翔
[导读] 目的研究临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌的OXA-23、OXA-24耐药基因研究。
宋艳荣刘爱翔（邢台医学高等专科学校河北邢台 054000）道士塔教案
【中图分类号】R378 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)13-0068-03万向联轴器
【摘要】目的研究临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌的OXA-23、OXA-24耐药基因研究。方法用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度（MIC值）；PCR检测OXA-23、OXA-24耐药基因，并对扩增出的基因测序比对。结果 90株鲍氏不动杆菌，均为多重耐药菌株，其中同时对5种抗生素耐药的占81.6%；检出6株携带OXA-23基因（全部对美罗培南和亚安培南耐药）、均未检出OXA-24基。结论某医院流行产OXA-23型酶的菌株，需要采取措施防止其进一步传播。 【关键词】鲍曼不动杆菌多重耐药耐药基因
鲍曼不动杆菌广泛存在于医院环境中，如呼吸机设备、消毒液、透析机、水龙头等[1]，是最常见的条件波纹钢管
致病菌之一，可以引起多种医院感染，如肺炎、伤口感染、败血症和脑膜炎等。随着抗生素的广泛使用，多重耐药鲍曼不动杆菌不断发展。因此，研究鲍曼不动杆菌多重耐药分子机制，可为合理选择抗生素，采取有效措施防止耐药株进一步扩散提供理论依据。本研究对2004年1月～2008年7月临床分离的90株鲍曼不动杆菌的耐药谱进行了测定，对OXA-23、OXA-24耐药基因进行了检测。 1 材料与方法
1.1 实验菌株
滑线变阻器
2004年1月至2008年7月分别从河北省8家医院ICU室、呼吸内科、神经外科、急诊科等收集到90株鲍氏不动杆菌，其中痰液标本82株、分泌物3株、尿液2株、咽拭子1株、耳分泌物1株、脓液1株。采用法国生物梅里埃(API) 公司生产的VITEK-32型全自动微生物分析仪及配套试剂盒对细菌进行鉴定。
1.2 试剂和主要仪器
抗生素：美罗培南（MEM）、亚胺培南(IPM)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、左氧氟沙星(LEV)、头孢他啶（CAZ）、阿米卡星（AKN）、头孢哌酮/舒巴坦（CFP/SB）购自中国药品生物制品检定所；DNA分子量Maker、dNTP、Taq DNA聚合酶等分子生物学试剂，均购自Sigma公司；PCR引物由博迈德科技发展有限责任公司合成，胶回收试剂盒购自Promega公司。
主要仪器：台式低温高速离心机（江苏省太仓医疗器械厂），WGP-300型电热恒温培养箱（重庆万达仪器有限公司），HBPX220型PCR仪（Hybaid公司），凝胶成像系统（上海复日科技有限公司）
1.3 MIC测定
采用WHO推荐的微量液体稀释法进行抗生素的最小抑菌浓度（MIC）测定，根据美国临床实验室标准委员会（CLSI）[2]标准判断结果。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853和肺炎克雷伯ATCC70060作为质控菌。
1.4 基因PCR检测
检测目的基因引物序列见表1。
表1 目的基因引物序列及产物
基因检测： PCR反应体系均为50 μl：10 ×PCR反应缓冲液5 μl、2.5 mmol/L dNTP 4 μl、10 μmol/L 上、下游引物各2 μl、Taq DNA 聚合酶1.0 U、DNA模板100 ng。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃25 s，50 ℃ 45 s， 72 ℃ 90 s，30 个循环；72 ℃延伸10 min。
1.5 测序和数据处理
对扩增阳性株PCR产物进行测序（上海生工）和序列比对（用软件DNAMAN 5.2.2）。采用SPSS13.0统计分析软件进行数据分析，
P<0.05即为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 标本类型
90株鲍曼不动杆菌中，来源于痰标本最多，为82株，占91.2%；其他标本依次为分泌物3株（3.3%），尿液2株（2.2%）。
2.2 病区分布
90株鲍曼不动杆菌中，分离自ICU最多，为30株，占33.2%；其他依次为呼吸内科18株（20.0%）、神经外科病房7株（7.8%）、急诊科6株（6.7%）等。
刀述仁
2.3 MIC法药敏结果
美罗培南（MEM）、亚胺培南(IPM)敏感率分别为58.9%、51.1%，头孢哌酮/舒巴坦（CFP/SB）敏感率为30.0%、左氧氟沙星(LEV)敏感率为21.1%、哌拉西林/他唑巴坦(TZP)敏感率20.0%、阿米卡星（AKN）、头孢他啶（CAZ）敏感率分别为16.7%和15.6%。详见表 2。
表2 鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药谱（数量，%） 2.4 耐药基因扩增结果
采用特异性引物对90株鲍曼不动杆菌分离株进行耐药基因扩增，扩增产物经1.3%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察特异性条带。结果有10株OXA-23基因阳性，阳性率为10%；未扩增出OXA-24耐药基因。耐药基因型代表性菌株PCR扩增产物电泳结果见Fig.1。 Fig.1 The PCR product of OXA-23 gene run on 1.3 % (w/v) agarose gel electrophoresis M:Markers; 4、5、8、9、11、12: A.baumannii lsolates 3 讨论工作重在到位
β-内酰胺酶基因是鲍曼不动杆菌最主要的耐药基因，包括超广谱β-内酰胺酶类（属A类，包括TEM-型、SHV-型、SIM-型、PER-型等基因）、金属酶类（属B类，包括IMP和VIM基因）、OXA型酶（属
D类）等[2,3]。OXA-23型酶，水解青霉素和头孢菌素、碳青霉烯，使菌株产生对亚胺培南类抗生素的耐药性[4]。鲍曼不动杆菌主要分布于重症监护病房(ICU)，占33.2%，其他依次为呼吸内科18株（20.0%）、神经外科病房7株（7.8%）、急诊科6株（6.7%）等，并且在所有标本类型中痰标本的检出率最高，占91.2%。鲍曼不动杆菌的耐药谱广，不易被抗菌药物所清除，感染后非常棘手，特别是对那些免疫功能低下的危重患者将会导致非常严重的后果。D类碳青霉烯酶对亚胺培南、头孢噻肟、头孢他啶的水解活性较低，但常同时合并外膜通透下降和(或)主动外排系统增强等，因此耐药性较强[4]。故对OXA-23型β-内酰胺酶基因流行病区，应及时采取有效措施，防止高耐药和多重耐药株的进一步传播，以免给今后的带来困难。也对医院不合理用药提出警告，在不动杆菌引起感染时, 必须合理使用抗菌药, 避免多重耐药现象再次发生。在医院间转移病人时必须注意鉴定和追踪耐药不动杆菌[5]。
参考文献
[1]Guenthner SH, Hendly JO, Wenzel RP. Gram-negative bacilli as nontransient flora on the hands of hospital personnel [J]. J Clin Microbiol, 1987, 25: 488-490.
[2]傅爱玲, 袭燕, 李希华.20株多药耐药鲍氏不动杆菌β-内酰胺酶基因研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2008, 18(5): 622-625.
[3]何崇旻, 葛庚芝. 不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素机制的研究进展[J].中国医学文摘·内科学，2005，26(1):121-123.
[4]Livermore DM, Woodford N. Carbapenemases: a problem in waiting? [J]. Curr Opin Microbiol, 2000, 3 (5): 489-495.
[5]Lua PL, Huang LY, Lian ST. How carbapenem-resistant Acinetobacter spp. established in a newly constructed hospital [J]. Int J Antimicrob Agents, 2008, 31: 463-466.
