metK基因起始密码子弱化方案
1、把SacB-apra插入metK上游基因组：
A．将杨俊杰提供的pMD18T-simple-metK用BssHI进行酶切，回收，补平。 B．将黄鹤老师提供的带城市生活2008SacB-apra质粒进行PstI酶切，回收SacB-apra片段，4000bp，切平。
C．把上述两个平端片段进行连接，构建成质粒pMD18TSMS。
D．将pMD18TSMS用SwaI酶切，回收5700bp左右片段。回收片段PCR targeting，完成第一次重组，apr平板初筛，并对重组菌株进行PCR验证。 验证引物为：AprYZ-F: CGCTGCATCTTGCCGAGTTG（孙周通有）和metK TTG-B，应得到720bp左右的片段。 词牌名 春
2、利用pMD18T-simple-metK的载体进行定点突变：A． TTG成长与成功突变引物
metK-TTG-F：
GGTGATATTAAATTTGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCG
metK TTG-B：
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B． GTG突变引物
metK-GTG-F三中全会报告：
GGTGATATTAAATGTGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCG
metK GTG-B王惠五：
CGGACTCGGACGTAAAAAGGTGTTTTGC广告学CACATTTAATATCACC
C．PCR产物用DpnI酶切消化，消化产物直接进行转化。挑选转化子，送测序。 3、SacB-apr第二次重组：测序正确的转化子用SwaI酶切，酶切得到1700 bp左右片段，回收，对第一次重组菌株进行PCR targeting，用10%蔗糖平板初筛，并用metK-YZ-F、metK-
YZ-R（杨俊杰有）进行PCR验证，阳性重组子可以得到1700 bp左右片段。PCR产物直接测序。
其中1和2可以同时进行。
合成的引物：
metK-TTG-F：
GGTGATATTAAATTTGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCG
metK TTG-B：
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metK-GTG-F：
GGTGATATTAAATGTGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCG
metK GTG-B：
CGGACTCGGACGTAAAAAGGTGTTTTGCCACATTTAATATCACC
