论著文章编号:100025404(2001)0921012203胃癌错配修复基因hML H1突变与微卫星DNA不稳的关系 房殿春，罗元辉，刘为纹 (第三军医大学附属西南医院全军消化专科中心，重庆400038)
提 要：目的 探讨胃癌错配修复基因hM LH1突变与微卫星不稳(MSI)的关系。方法 采用PCR为基础的方法检测MSI；采用二维DNA电泳和DNA测序技术检测hM LH1突变。结果 68例胃癌中检出hM LH1基因突变3例，突变率为4.4%。hM LH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。至少有1个位点发现MSI者17例(25.0%)。将MSI分为高频率MSI(MSI2H,≥2个位点)8例、低频率MSI(MSI2L，仅为1个位点)9例和MSI阴性(MSS)51例3组,4例hM LH1基因突变均发生于MSI2H组，而MSI2L和MSS组未见有突变者。结论 hM LH1基因突变仅是部分MSI发生的原因,MSI的发生可能还涉及到hM LH1以外错配修复基因改变。 关键词：胃癌;hM LH1突变；二维DNA电泳
中图法分类号:R342.3;R394;R735.2 文献标识码:A
R elationship betw een mismatching repair gene hML H1mutation and microsatellite in2 stability
F ANGDian2chun,LUO Y uan2hui,LI U Wei2wen(Department of
G astroenterology,S outhwest
H ospital,T hird M ilitary M edical University,Ch ongqing400038,China)
Abstract:Objective T o evaluate the role of hM LH1mutation in gastric carcinogenesis and to correlate hM LH1mutation with microsatellite in2 stability in gastric carcinomas.Methods hM LH1mutation was measured by tw o2dimentional DNA electrophoresis and DNA sequencing;MSI was analyzed by PCR2based methods.Re sults S ixty2eight cases of sporadic gastric carcinoma were studied for hM LH1mutation and MSI.hM LH1mu2 taions were detected in3(4.4%)gastric cancer.N o ass ociation was observed between hM LH1mutation and tum or size,differentiation,histological type,depth of invasion,metastasis or stages.By using five microsatellite markers,MSI in at least one locus was detected in17of68(25%)of the tum ors analyzed.hM LH1mutations were all detected in MSI2H(≥2loci,n=8),but no mutation was found in MSI2Low(only one locus,n=9) or MSS(tum or lacking MSI or stable,n=51).Conclusion hM LH1mutation is inv olved in carcinogenesis of s ome gastric cancer with MSI2H in the majority MSI cases in gastric tum ors may be due to defects in other genes responsible for DNA replication fidelity than the hM LH1.
K ey w ords:gastric carcinoma;hM LH1mutation;tw o2dimentional DNA electrophoresis
我们过去的研究表明，基因不稳在胃癌的发生中起重要作用。这种基因不稳涉及到两种不同的形式，亦即染体不稳和微卫星不稳(MSI)[1]。MSI是指由于复制错误引起的简单重复序列的改变，系错配修复(Mismatching repair gene,M MR)基因的突变所致。由于M MR基因的突变及功能异常造成DNA频发的复制错误(Replication errors,ERE)并不断积累，导致细胞的微卫星DNA序列发生改变。目前已分离和鉴定的M MR 基因主要有hMSH2、hM LH1、hPMS1和hPMS2，他们分别定位于染体2p21222、3p21、2q31233和7p22。业已证明,MSI阳性胃癌常伴有hM LH1启动子区的低甲基化和hM LH1表达的下调[2]，但与hM LH1突变的关系尚缺乏深入的研究。本研究应用二维DNA电泳及DNA测序技术对胃癌错配修复基因hM LH1突变进行检测，并探讨hM LH1突变与MSI的关系。 基金项目：国家自然科学基金资助项目(30070043)；全军“十五”科研基金重点资助项目(01Z075)
作者简介：房殿春(1951-)，男，吉林省长春市人，博士，主任医师，教授，主要从事胃粘膜病变的分子机制及防治方面的研究，发表论文200余
篇。电话:(023)68754124
收稿日期:2001207230；修回日期:20012082231 材料和方法
1.1 组织标本
68例胃癌及相应正常组织均为我院外科手术切除标本。标本切除后立即置-80℃冻存备用。每例组织行冰冻切片HE 染，以确定肿瘤细胞的丰度。DNA提取采用蛋白酶K消化，酚/氯仿提取法。68例胃癌中，男45例，女23例，年龄30～76岁，平均56.2岁。所有病人均无肿瘤家族史，亦未接受过放疗和化疗。
1.2 引物
参照文献[3]合成长PCR和短PCR引物，序列见表1。
1.3 长PCR扩增
随行夹具 应用LA PCR试剂盒(T akaRa,Otsu,Shiga,Japan)进行长PCR 扩增。PCR反应体积50μl，包括200～400ng基因组DNA，不同浓度引物(hM LH1基因外显子1～4正义和反义引物各0.16μm ol/L,5～10外显子正义和反义引物各0.125μm ol/L,11～13外显子正义和反义引物各0.094μm ol/L,14～19外显子正义和反义引物各0.125μm ol/L)。操作步骤按说明书进行。PCR反应条件94℃热启动2min，加T aq酶,94℃1min，然后98℃15s,69℃1min(每个循环递减0.5℃),68℃12min,×8个循环。接着96℃20s,68℃12min,×6个循环。然后96℃20s, 68℃12min(每个循环递减15s),×16个循环。最后,72℃反
2101第23卷第9期
2001年9月陈天蛋
第 三 军 医 大 学 学 报
ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AE
Vol.23,N o.9
Sep.2001麻醉系统
应10min。长PCR产物行0.5%琼脂糖凝胶电泳观察。
四水硝酸钙
表1 长PCR和短PCR所用引物
T ab1 Primer inform ation for long and short PCR for H ML H1 A.Primer pairs for long2distance PCR
Ex ons124
M LH124F G CG.G CT.AAG.CT A.C AG.CTG.AAG.G AA.G AA.CG T.G A a
M LH124R GG C.G AG.AC A.GG A.TT A.CT C.TG A.G AC.CT A.GG C.CC
Product size:10.8kb
Ex ons5210
M LH5210F G CG.CCC.CTT.GGG.ATT.AG T.AT C.T AT.CT C.T CT.ACT.GG M LH5210R G CG.CT C.AT C.T CT.TT C.AAA.G AG.G AG.AG C.CTG
Product size:10.5kb
Ex ons11213
M LH11213F CGG.CTT.TTT.CT C.CCC.CT C.CC A.CT A.T CT.AAG.G
M LH11213R GGG.TT A.G T A.AAG.G AA.G AG.G AG.CTT.G CC.C
Product size:8.7kb
Ex ons14219
M LH14219F GG T.G CT.TTG.G T C.AAT.G AA.G TG.GGG.TTG.G T A.G
M LH14219R G CG.CG C.G T A.TG T.TGG.T AC.ACT.TTG.T AT.AT C.AC A.C Product size=10.5kb
B.Primer pairs for sh ort PCR
Ex on Clam p b Product size T c m Primer sequence
1525864.13G C A.CTT.CCG.TTG.AG C.AT C 40CCG.TT A.AG T.CG T.AG C.CCT 24018738.14AT A.AAT.T AT.TTT.CTG.TTT
C AT.CCT.G CT.ACT.TTG.AGG
34023732.22GG A.AAA.TG A.G T A.AC A.TG A 2TG T.C AT.C AC.AGG.AGG.AT A 4221836.26ACC.C AG.C AG.TG A.G TT.TT
40G CC.C AA.AAT.AC A.TTT.C AG 54017030.19AT A.TT A.ATT.TG T.T AT.ATT
C AA.TTT.ACT.CT C.CC A.TG T
64022835.58TTT.C AA.G T A.CTT.CT A.TG A
ACT.TTG.T AG.AC A.AAT.CT C 719430.88G AC.AT C.T AG.TG T.G TG.TTT
40CCC.CTT.TTT.T CT.TTT.C AT 8521342.21G AC.AAT.AAA.T CC.TTG.TG T 50AAG.ATT.TTT.TT A.T AT.AGG 94024933.73TTT.G AG.TTT.TG A.G T A.TTT
TGG.G TG.TTT.CCT.G TG.AG T 105024041.47C AC.CCC.T C A.GG A.C AG.TTT
AC A.T CT.G TT.CCT.TG T.G AG
11.15014540.58AGG.T AA.TTG.TT C.T CT.CTT
G AA.G TG.AAC.TT C.ATG.CTT
11.24022460.81T CC.C AA.G AA.TG T.GG A.TG T
2AAA.GG C.CCC.AG A.G AA.G T A
12.14018444.53TTT.TTT.TTT.TTT.T AA.T AC.A
AAT.CTG.T AC.G AA.CC A.T CT
12.2836653.23TGG.AAG.T AG.TG A.T AA.GG T
40TG T.ACT.TTT.CCC.AAA.AGG 134027249.06AT C.TG C.ACT.T CC.TTT.T CT
AAA.ACC.TTG.G C A.G TT.G AG 144523548.94T AC.TT A.CCT.G TT.TTT.TGG
5G T A.G T A.G CT.CTG.CTT.G TT 154017929.97C AG.CTT.TT C.CTT.AAA.G T C
C AG.TTG.AAA.TG T.C AG.AAG
1626147.56CTT.G CT.CCT.T C A.TG T.T CT.TG 40AG A.AG T.AT A.AG A.ATG.G CT.G T C 174019947.01ATT.ATT.T CT.TG T.T CC.CTT
AAT.G CT.T AG.T AT.CTG.CCT 184521546.67CCT.ATT.TTG.AGG.T AT.TG A.AT
G CC.AG T.G TG.C AT.C AC.C A
1928243.43TG T.TGG.G AT.G C A.AAC.AGG 40AT C.CC A.C AG.TG C.AT A.AAT a:Underlined nucleotides represent nucleotides added to m odify melt2 ing tem peratures of the primers;b:G C clam ps are:50G C clam p, CG C.CCG.CCG.CCG.CCC.G CC.G CG.CCC.CG C.G CC.CG T.
CCC.G CC.G CC.CCC.G CC.CG;45G C clam p,CG C.CCG.CCG.
CG C.CCC.CG C.CCC.G TC.CCG.CCG.CCC.CCG.CCC.GG C.
CCG;40clam p,CG C.CCG CCG.CG C.CCC.G CG.CCC.GG C.
CCG.CCG.CCC.CCG.CCC.G;8clam p,CG T.CCC.G C;5clam p,
G CG.CG;2clam p,CG;CT M is given in%UF 1.4 多重短PCR扩增
取长PCR产物1μl作为模板，进行多重短PCR扩增。分为2个多重PCR组，组Ⅰ包括11对引物，组Ⅱ包括10对引物，每对引物终浓度见表2。PCR反应体积50μl，包括1×PCR bu ffer, 7mm ol/L MgCl2,0.25mm ol/L dNTPs,PCR反应条件94℃热启动3min，加T aq DNA多聚酶0.5U。然后94℃1min,52℃45s (每个循环递减1℃),72℃1min,×5个循环。然后94℃1 min,48℃45s,72℃1.5min(每个循环增加2s),×15个循环。然后94℃1min,38℃45s,72℃1.5min,×15个循环。最后72℃10min,98℃10min,45℃30min,37℃30min。
表2 多重短PCR分组及引物浓度
T ab2 Multiplex groups for short PCR
Multipex groupⅠMultipex groupⅡ
Ex on Final concentration(μm ol/L)Ex on Final concentration(μm ol/L)
11.10.3755 1.5
150.52 1.25
12.10.3757 1.75
170.54 1.625
80.37511.20.5
18 1.256 1.625
14 1.259 1.5
30.6251 1.25
100.62513 1.625
16 1.012.20.325
19 1.75
1.5 二维电泳
应用美国C BS Scientific C o.研制的DGGE电泳仪(S olana Beach,C A)进行二维电泳。将PCR产物与上样缓冲液9∶1混合，组Ⅰ取6.5μl，组Ⅱ取8.5μl混合后上样，在0.75mm厚10%聚丙烯酰胺凝胶，于电压140V、温度50℃条件下进行大小(size)分离7.5h。SY BR G reen染，紫外光下观察分离情况。然后将在120～420bp区的条带呈条形切下，放在预先制备好的1mm厚DGGE胶(含10%～6.5%逆浓度聚丙烯酰胺, 25%～70%尿素/甲酰胺)上方，用10%聚丙烯酰胺凝胶封闭后，于电压90～110V，温度56℃条件下电泳16h。凝胶SY BR
G reenⅠ和Ⅱ的混合液中染30min，紫外光下观察并照相。
1.6 DNA测序
对发现有异常DNA条带者应用ABI377测序仪(F oster City,
C A)进行DNA测序。乡村建设行动实施方案
1.7 微卫星不稳(MSI)的检测
包括5个微卫星位点:BAT25、BAT26、BAT40、D2S123、和D5S346。检测方法、步骤见文献[1]。与正常组织相比，若肿瘤组织出现泳动的条带即判断为MSI。根据每例肿瘤组织突变型微卫星位点的多少，将其分为高频率MSI(MSI2H,≥2个位点)、低频率MSI(MSI2L，仅为1个位点)和MSI阴性(MSS)3组。
2 结果
2.1 胃癌hM LH1突变率
经二维电泳发现异常者均表现为4条DNA带型，见图1。经DNA测序发现68例胃癌中有3例发生hM LH1突变，突变率为4.4%,hM LH1第226密码子CGG变为TGG，导致相应的精氨酸变为氨酸。hM LH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。
3101
第9期 房殿春，等.胃癌错配修复基因hM LH1突变与微卫星DNA不稳的关系
图1 应用二维DNA电泳检测胃癌错配修复基因hML H1突变
8,13和15外显子见4条带带型
Fig1 Detetion of mism atching rep air gene hML H1mutation in gastric cancer by tw o2dimentional DNA electrophoresis
F our2band pattern was observed at ex on8,13and15
2.2 MSI与hM LH1突变的关系
68例胃癌中至少有1个位点检出MSI者17例(25%)，其中属MSI2H8例(11.8%)、MSI2L9例(13.2%)和MSS51例(75%)。MSI与hM LH1突变的关系见表3，可见,hM LH1突变均发生于MSI2H组，而MSI2L和MSS组未发现有hM LH1突变者。
表3 MSI与hML H1突变的关系
T ab3 The relationship betw een MSI and hML H1mutation
MSI Status N o.of cases h M LH1mutation
MSI2H83
MSI2L90
理性主义
MSS510
3 讨论
错配修复基因hM LH1是遗传性非息肉性大肠癌(H NPCC)的易感基因，约50%H NPCC家系存在hM LH1的突变[4,5]。已有研究发现，部分家族性胃癌有hM LHl 胚系突变[6]，但散发性胃癌hM LH1的体细胞突变情况国内外尚缺乏深入研究。本研究采用二维电泳和DNA测序技术检测了68例胃癌组织错配修复基因hM LH1突变，检出突变3例，突变率为4.4%，提示hM LH1突变在散发性胃癌中并非常见。
我们过去的研究表明，部分胃癌表现MSI。我们首先根据胃癌MSI检出位点的多少，将胃癌分为高频率MSI(MSI2H)，低频率MSI(MSI2L)和无MSI(MSS)3组，结果发现MSI2H胃癌表现为高频率的TG F2βRⅡ、IG F2ⅡR、BAX、MSH3基因的移码突变和低频率的APC、MCC和DCC的杂合丢失，而MSI2L和MSS胃癌却表现为相反的结果。但MSI与hM LH1突变的关系尚缺乏深入的研究。本研究发现,3例hM LH1突变均发生于MSI2H胃癌，而MSI2L胃癌未发现有hM LH1突变者，提示hM LH1突变与部分MSI2H胃癌有关。但多数MSI2H胃癌并未发现有hM LH1突变，提示多数MSI2H胃癌可能是hM LH1以外的错配修复基因异常，或hM LH1基因的其它失活方式所致。业已发现，在晚期MSI2H胃癌常伴有hM LH1启动子区的高甲基化和hM LH1表达的下调[6]。因此进一步研究MSI2H胃癌hM LH1启动子区的甲基化状态、hM LH1的表达和其他错配修复基因改变，对揭示MSI2H胃癌的发生机制可能有重要意义。
hM LH1基因较大，含有19个外显子，以往检测hM LH1基因突变多采用SSCP方法、梯度变性胶电泳和DNA测序等技术，但这些技术需时长，工作量大，花费亦大，不适合大规模的突变分析[3]。二维凝
胶电泳是近年建立的新的基因突变分析方法[8,9]。本方法包括2步PCR扩增和2步电泳分离。即先行包括4对引物的长PCR扩增hM LH1基因的19个外显子的全长序列，再以长PCR产物为模板，进行2套多重短PCR扩增，然后先在非变性丙烯酰胺凝胶进行扩增片段大小分离，再在梯度变性胶上进行第2次分离。本研究采用二维电泳方法检测了hM LH1基因19个外显子突变，结果表明该法操作简便，无需复杂设备，所需的检测样品少，准确性和可重复性好，能在同1张电泳胶上同时观察hM LH1基因19个外显子突变，因此可降低工作量，并降低花费，不但可以用于科学研究，而且可以用于临床标本的检测。
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(编辑 谢义霞)
4101 第 三 军 医 大 学 学 报 第23卷
