6783重庆医学2020年12月第49卷第23期论著㊃基础研究d o i:10.3969/j.i s s n.1671-8348.2020.23.003
网络首发h t t p s://k n s.c n k i.n e t/k c m s/d e t a i l/50.1097.R.20201116.1138.010.h t m l(2020-11-16)
吴天鸽1，黄文君1ә，冯嘉轩2
聂耳与国歌(1.吉林大学第二医院输血科，长春130000;2.长春中医药大学临床医学院实验中心，长春130000)
[摘要]目的探讨三氯醋酸(T C A)/丙酮沉淀法与硫酸铵沉淀法去除血浆高丰度蛋白的效果㊂方法选取2017年6月至2019年6月长春市中心血站采集的O型R H D阳性新鲜冰冻血浆12例，组成4个样品并分别编号为A1㊁A2㊁B1㊁B2㊂采用T C A/丙酮沉淀法去除A1㊁A2样品血浆中高丰度蛋白，硫酸铵沉淀法去除B1㊁B2样品血浆中高丰度蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)验证血浆中高丰度蛋白去除的效果㊂C l e a n-u p K i t去除蛋白质中干扰物质，并采用S D S-P A G E和双向电泳(2-D E)验证C l e a n-u p K i t的效果㊂结果银染的S D S-P A G E胶图显示,T C A/丙酮沉淀法与硫 酸铵沉淀法均可有效去除血浆高丰度蛋白，但与硫酸铵沉淀法相比,T C A/丙酮沉淀法的S D S-P A G E条带更清晰㊂S D S-P A G E和2-D E显示两种方法去除清蛋白的血浆C l e a n-u p K i t后对去除血浆中其他干扰物质效果并不明显㊂结论 T C A/丙酮沉淀法去除血浆高丰度蛋白的效果更好，且去除血浆中清蛋白后的血浆C l e a n-u p K i t对去除效果无显著影响，可直接进行2-D E㊁图像分析及质谱检测分析㊂
[关键词]三氯醋酸/丙酮沉淀法；饱和硫酸铵沉淀法；血浆；高丰度蛋白
[中图法分类号] R446.11[文献标识码] A[文章编号]1671-8348(2020)23-3876-04 C o m p a r a t i v e s t u d y o n t h e e f f e c t o f T C A/a c e t o n e-p r e c i p i t a t i o n a n d a m m o n i u m
s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n i n r e m o v i n g p l a s m a h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n
WU T i a n g e1,HU A N G W e n j u n1ә,F E N G J i a x u a n2
(1.D e p a r t m e n t o f B l o o d T r a n s f u s i o n,t h e S e c o n d H o s p i t a l o f J i l i n U n i v e r s i t y,C h a n g c h u n,
J i l i n130000,C h i n a;2.E x p e r i m e n t a l C e n t e r o f C l i n i c a l M e d i c a l C o l l e g e,C h a n g c h u n
U n i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a l C h i n e s e M e d i c i n e,C h a n g c h u n,J i l i n130000,C h i n a)
[A b s t r a c t]O b j e c t i v e T o e x p l o r e t h e d i f f e r e n c e i n t h e e f f e c t o f t r i c h l o r o a c e t i c a c i d(T C A)/a c e t o n e p r e-c i p i t a t i o n a n d a mm o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n o n t h e r e m o v a l o f p l a s m a h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n.M e t h o d s T h e s u b j e c t s w e r e s e l e c t e d f r o m12c a s e s o f O-t y p e R H D-p o s i t i v e f r e s h f r o z e n b l o o d c o l l e c t e d f r o m t h e b l o o d s t a t i o n f r o m J u n e2017t o J u n e2019.4s a m p l e s w e r e c o m p o s e d a n d n u m b e r e d A1,A2,B1a n d B2r e s p e c t i v e l y. T h e h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n i n t h e p l a s m a o f A1a n d A2s a m p l e s w a s r e m o v e d b y T C A/a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n. w h i c h o f B1a n d B2s a m p l e s w a s r e m o v e d b y a mm o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n.S D S-P A G E w a s p e r f o r m e d t o v e r i f y t h e e f f e c t i v e n e s s o f h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n r e m o v a l i n p l a s m a.T h e C l e a n-u p K i t r e m o v e s i n t e r f e r i n g s u b s t a n c e s f r o m p r o t e i n s a n d i t s e f f e c t v a l i d a t e d u s i n g S D S-P A G E a n d t w o-d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s(2-D E).R e s u l t s S i l v e r-s t a i n e d S D S-P A G E g e l s h o w s t h a t b o t h T C A/a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n a n d a mm o n i u m s u l-f a t e p r e c i p i t a t i o n c a n e f f e c t i v e l y r e m o v e p l a s m a
h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n,b u t c o m p a r e d w i t h a mm o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n,t h e b e l t s o f T C A/a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n S D S-P A G E i s c l e a r e r.A f t e r C l e a n u p a f t e r r e m o v i n g p l a s m a a l b u m i n w i t h t h e t w o m e t h o d s,S D S-P A G E a n d2-D E s u g g e s t e d t h a t t h e e f f e c t o f r e m o v i n g o t h e r i n t e r-f e r i n g s u b s t a n c e s i n p l a s m a i s n o t o b v i o u s.C o n c l u s i o n T C A/a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n m e t h o d h a s a b e t t e r e f f e c t o n r e m o v i n g p l a s m a h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n,a n d C l e a n u p K i t a f t e r r e m o v i n g h a s n o s i g n i f i c a n t e f f e c t o n t h e r e m o v a l e f f e c t,a n d c a n d i r e c t l y p e r f o r m2-D E,i m a g e a n a l y s i s a n d m a s s s p e c t r o m e t r y d e t e c t i o n.
[K e y w o r d s]t r i c h l o r o a c e t i c a c i d/a c e t o n e p r e c i p i t a t i o n m e t h o d;s a t u r a t e d a mm o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i-o n m e t h o d;p l a s m a;h i g h-a b u n d a n c e p r o t e i n
蛋白质组学的第一步就是纯化来自细胞或组织的蛋白质及其分离[1-2]㊂因为清蛋白在血浆中含量约
作者简介：吴天鸽(1988-)，主管技师，硕士，主要从事医学检验研究㊂ә通信作者,E-m a i l:c h e n g f e920123@163.c o m㊂
占55%，进行蛋白质组学二维凝胶电泳(2D-G E)分析时，特别是标本量比较少时，受到其高丰度蛋白的遮蔽影响，较难发现低丰度蛋白点[3-4]㊂故而，怎样将血浆所含的高丰度蛋白去除，使低丰度蛋白富集，提高灵敏度是进行蛋白质组学2D-G E分析的关键步骤之一㊂三氯醋酸(T C A)/丙酮沉淀法和饱和硫酸铵沉淀法是目前去除血浆高丰度蛋白较为成熟的技术[5-7]，但关于二者的去除效果及C l e a n-u p K i t后效果比较的研究较少㊂本研究采用T C A/丙酮沉淀法㊁硫酸铵沉淀法对血浆进行高丰度蛋白去除，并采用C l e a n-u p K i t去除血浆中其他干扰物质，运用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(S D S-P A G E)㊁双向电泳(2-D E)对去除效果进行评价㊂
1材料与方法
1.1试剂及设备
S D S(美国S i g m a-A l d r i c h公司),T C A㊁丙酮(北京盖利精细化学品有限公司),I P G b u f f e r(p H4~7，美国A m e r s h a m B i o s c i e n c e公司),H E P E S㊁蛋白M a r k e r㊁D T T㊁过硫酸胺丙烯酰胺㊁溴乙锭㊁琼脂糖(北京鼎国公司)，甲ˑ丙烯酰胺(上海生工生物公司)，尿素(博越生物公司)，溴酚蓝(美国S i g m a公司)，蛋白质纯化试剂盒(美国G E公司),TW E E N-20(美国T h e r m o公司),37%甲醛(北京盖利精细化学品有限公司)㊂D NM-9602G酶标仪(北京普朗新技术有限公司),D H G-9101-2S A电热恒温鼓风干燥箱(上海三发科学仪器有限公司),-80ħ超低温冰箱(和利制冷设备有限公司)，恒温金
属浴(上海五相仪器仪表有限公司)，平板离心机(上海机械研究所)，凝胶图像分析系统(上海天能公司)㊂
1.2方法
1.2.1样品准备
选取2017年6月至2019年6月长春市中心血站采集的O型R H D阳性新鲜冰冻血浆12例，每袋血浆取40μL，每3袋血清等体积混合，组成4个样品并分别编号为:A1㊁A2㊁B1㊁B2㊂将所有样品放置于-80ħ待分离检测，采用T C A/丙酮沉淀法去除A1㊁A2样品血浆中高丰度蛋白，采用硫酸铵沉淀法去除B1㊁B2样品血浆中高丰度蛋白㊂
1.2.2 T C A/丙酮沉淀法[5,8]
将置于-80ħ保存的血清样品于37ħ水浴融化,4ħ12000r/m i n离心5m i n，取20μL上清液加入E P管中㊂向装有样品的E P管中加入8μL T C A 和72μL冷丙酮(或4倍体积冷丙酮含10%T C A)㊂将E P管放入-20ħ冰箱，放置90m i n㊂4ħ15000ˑg离心20m i n，将上清液移入新的E P管中，再加入1m L冷丙酮，沉淀蛋白，离心弃上清液用P B S 溶解沉淀㊂将预冷的丙酮加入E P管中，清洗沉淀, E P管在冰上放置15m i n㊂再次4ħ15000ˑg离心20m i n㊂用再水化液溶解蛋白(现用现配)，溶解后的蛋白置于4ħ短时间保存㊂
1.2.3饱和硫酸铵沉淀法[9-10]
20μL血浆样品+80μL P B S+900μL3.9 mm o l/L硫酸铵㊂放置4ħ冰箱，静止3h㊂15700ˑg4ħ离心15m i n㊂加入1m L55%饱和度的硫酸铵㊂放置于4ħ冰箱,15m i n㊂15700ˑg4ħ离心15m i n㊂上清液移入新的E P管(分离出清蛋白)㊂沉淀加入35%饱和度硫酸铵500μL㊂放置于4ħ冰箱,15m i n㊂15700ˑg4ħ离心15m i n㊂上清液移入新的E P管(分离出球蛋白)㊂沉淀放置-20ħ冻存[分离出的清蛋白和球蛋白分离用20%冷T C A(1m L液体加250μL T C A)沉淀过夜]㊂15700ˑg4ħ离心20m i n，弃上清液㊂加入20μL冷丙酮㊂离心，弃上清液，干燥㊂分离出的清蛋白㊁球蛋白和剩余蛋白用140㊁100㊁40μL的再水化溶液溶解㊂1.2.4S D S-P A G E
配制凝胶，进行电泳，最后硝酸银染㊂
1.2.5 C l e a n-u p K i t
采用C l e a n-u p K i t去除蛋白质中干扰物质，操作参考(美国G E公司)蛋白纯化试剂盒说明书㊂S D S-P A G E和2-D E验证C l e a n-u p K i t是否去除了蛋白质中干扰物质㊂测定血浆蛋白浓度,S D S-P A G E，胶条的再水化及蛋白上样，等电聚焦(I E F)，平衡I P G胶条，最后考马斯亮蓝染㊂广州市蓝天中学>阎刚平
1.3观察指标
两种方法去除血浆高丰度蛋白的效果：银染的S D S-P A G E胶图观察蛋白胶带，分别比较经不同方法去除高丰度蛋白的血浆样品中的清蛋白㊁下层沉淀蛋白条带的差异㊂C l e a n-u p K i t去除血浆蛋白质中干扰物质的效果:S D S-P A G E分析C l e a n-u p K i t前后的血浆蛋白考马斯亮蓝S D S-P A G E胶图，分别比较清蛋白㊁下层沉淀蛋白条带的差异㊂采用2-D E获得蛋白2D图像，比较C l e a n-u p K i t前后不同方法检测的血浆蛋白的图像变化㊂
2结果
2.1两种方法去除血浆高丰度蛋白的效果
与条带1比较,A1㊁A2㊁B1㊁B2样品中的清蛋白和下层沉淀蛋白胶带蛋白浓度明显更低，且A1㊁A2样品的条带清晰度更高，见图1㊂
M：标志物;1：血浆;2:A1清蛋白;3:A1下层沉淀蛋白;4:A2清蛋白;5:A2下层沉淀蛋白;6:B1清蛋白;7:B1下层沉淀蛋白;8:B2清蛋白;9:B2下层沉淀蛋白㊂
图1银染的S D S-P A G E胶图
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重庆医学2020年12月第49卷第23期
2.2 C l e a n -u p K
i t 前后血浆蛋白S D S -P A G E 分析T C A /丙酮沉淀法去除血浆清蛋白C l e a n -u p K
i t 后(泳道4)相比于未C l e a n -u p K
i t 的条带(泳道3)，剩余的蛋白浓度降低，种类不丰富，不利于分析㊂而硫
酸铵沉淀法去除血浆清蛋白C l e a n -u p K i t 后(泳道7)相比于未C l e a n -u p K
i t 的条带(泳道6)，蛋白浓度和种类去除不明显，见图2㊂
2.3 C l e a n -u p K i t 前后血浆蛋白2-D E 分析T C A /丙酮沉淀法去除清蛋白后的血浆经C l e a n -u p K i t 后相比于未C l e a n -u p K
i t ，有些蛋白质点更清晰，而有些蛋白质点不清晰，见图3A ㊁B ㊂与此相类
似，硫酸铵沉淀法去除清蛋白后的血浆经C l e a n -u p
K i t 后与未C l e a n -u p K
i t 相比，效果差别不明显，见图3C ㊁D ㊂
M ：标志物;1：血浆;2:T C A /丙酮沉淀法的清蛋白;3:T C A /丙酮沉淀法的下层沉淀蛋白;4:T C A /丙酮沉淀法C l e a n -u p K
i t 后的下层沉淀蛋白;5：饱和硫酸铵沉淀法的清蛋白;6:
饱和硫酸铵沉淀法的下层沉淀蛋白;7：饱和硫酸铵沉淀法C l e a n -u p K
i t 后的下层沉淀蛋白㊂图2 考马斯亮蓝S D S -P A G E
胶图
A :T C A /丙酮沉淀法C l e a n -u p K i t 前;
B :T
C A /丙酮沉淀法C l e a n -u p K i t 后;C ：硫酸铵沉淀法C l e a n -u p K i t 前;
D ：硫酸铵沉淀法C l e a n -u p
K i t 后㊂
网络辅导图3 血浆蛋白2-D E 分析
3 讨 论
蛋白质组学研究能够有效识别蛋白,
而蛋白水平的表达㊁修饰水平的变化与临床疾病息息相关[
11-12]
，尤其是血浆蛋白的分析在临床疾病诊断及进展㊁预后
评估中均有重大意义[13
]㊂因此，如何安全地分离相应
蛋白并对其进行识别㊁定位成为临床血浆蛋白检测关注的焦点㊂蛋白组分离技术是实现蛋白组学研究的基础，之后才能应用一维和二维凝胶电泳和谱等分析，分离技术也对分析的结果直接产生影响
[11
]㊂尽管
蛋白组学分析的技术现已较为成熟，但由于血浆蛋白是由极为复杂㊁丰富的蛋白构成，其中高丰度的蛋白动态范围较大，会一定程度影响低丰度蛋白的检测，尤其是标本量较小时㊂以2D -G E 分析为例，血浆中高丰度的蛋白会一定程度遮蔽低丰度蛋白，因此部分低丰度的蛋白点未能被发现㊂分离血浆高丰度蛋白是富集低丰度蛋白的关键之一，也是提高临床检验敏感度的关键点之一㊂
本研究采用了T C A
2018年刘伯温全年资料
/丙酮沉淀法㊁硫酸铵沉淀法对血浆进行高丰度蛋白去除，采用银染的S D S -P A G E 胶图观察去除高丰度蛋白后的血浆样品的清蛋白和下层沉淀蛋白水平，结果提示经过T C A /丙酮沉淀法的血浆蛋白显像效果更清晰，且条带更为丰富㊂为了进一步探究干扰物质对血浆丰度蛋白去除效果的影
响，研究也对两种去除方法去除后的血浆蛋白样品进行C l e a n -u p K
i t 去除血浆蛋白质中干扰物质，考马斯亮蓝S D S -P A G E 显示T C A /丙酮沉淀法去除血浆清蛋白C l e a n -u p K
i t 后能有效降低蛋白的浓度，但是蛋白条带的丰富度减少㊂而硫酸铵沉淀法C l e a n -u p K i t 前后蛋白浓度和种类均无j 显著差异㊂而通过蛋白质2D 图像分析显示C l e a n -u p K
i t 对两种方式去除丰度蛋白的血浆样品均无显著影响，这也提示在实际检验中不需要C l e a n -u p K
i t ，可直接进行2-D E ㊁图像分析及质谱检测分析，从而简化实验步骤，节约实验成本㊂C H E N 等
[14]
分别利用0~20%的T C A
/丙酮溶液优化血浆中清蛋白的去除方法，发现10%的T C A
/丙酮溶液效果最佳㊂但有研究优化实验得出用4倍样品体积的60%T C A
/丙酮溶液去除血浆中高丰度蛋白质的效果最为理想[
1]
㊂本研究采用4倍体积冷丙酮含10%T C A 去除血浆中高丰度蛋白质,
其效果通过与研究报道[5,14
]中的图像条带显示结果类似，但本研
究尚未设置对照研究，未明确不同T C A /丙酮溶液梯度及体积对血浆高丰度蛋白去除的效果，仍需进一步深入研究㊂
综上所述,T C A
/丙酮沉淀法去除高丰度蛋白比硫酸铵沉淀法去除高丰度蛋白特异性较好㊂
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(收稿日期:2020-03-16修回日期:2020-07-17)
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