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(一) 原理 蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度 , 以及蛋白质分子带有的电荷。如改变这两个因素 ,蛋白质就容易沉淀折出。引起蛋白质沉淀的主要方法有
(1) 盐析 , 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出 , 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及 pH 值不同 ;
(2) 生物碱以及某些酸类 , 徐湘婷 下载在 pH 值小于等 电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀 ;
(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等 , 在 pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀 ;
(4) 有机溶剂如酒精、 甲醇、丙酮等 , 对水的亲和力很大 , 能破坏蛋白质水化膜 , 在等电点时使蛋白质沉淀。 辛酸 (caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合 并将其沉淀下来 ,IgG 则溶于上清液中 , 再用硫酸镀盐析 , 即可达到纯化 IgG 的目的。
辛酸 -硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法 , 利用该方法纯化单克 隆抗体 , 回收率和纯度都可达 80% 以上。
(二) 试剂和器材
1. 试剂
(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。称 (NH4)2S04(AR)400~425 克 , 以 50 ℃ ~80 ℃蒸馆水东方女郎 500ml溶解 , 搅拌 2O min, 趁热过滤。冷却后以浓氨水 (15M NH40H) 调 pH 值至 7.4 。配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液 : A 液 ,0.06M NaAc: 无水 NaAc0.49218g 加蒸馆水至 100ml
B 液 ,0.06M HAc: 冰醋酸 0.344ml 加蒸馆水至 100ml
应用液 : 取上述 A 液 59ml 与 B 液 41ml 昆合 , 用 5M NaOH 调 pH 值至 4.80.
(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液 (PBS). 取 Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至 100Om1
(5) 含 137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的 pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取 Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 知网、 KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至 100Oml
2. 器材 普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器 , 紫外分光光度计、天平 ; 透析袋、塑料夹、精密 pH 试纸 ; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
（三) 操作步骤
方案一 ( 硫酸铵沉淀法 )
1. 腹水 4 ℃ 12000 rpm 离心 15min, 去除杂质。
2. 取 1 份腹水与 2 份醋酸盐缓冲液混合 , 室温搅拌下逐滴加入正辛酸 33 μ l/ml 腹水。
3. 室温混合 30min
4. 4 ℃静置 2h 以上 , 使其充分沉淀。
5. 4 ℃ ,12000 rpm 离心 3Omin, 弃沉淀。
6. 上清经砂芯漏斗或 125 μm 的尼龙网过滤后 , 加入 1/10 体积的 0.1M pH 7.4 Pbs , 用 2M NaOH 调 pH 值至 7.4.
7. 冰浴下于 30min 内加入 0.277g/ml 的硫酸铵 , 使成 45％饱和度。
8. 4 ℃静置 1h 以上。蓝潮痕
9. 4 ℃ ,10000 rpm 离心 30min, 弃上清。
10. 昂达vx610w时尚版沉淀用适量含 137mM NaC1 、 2.6mM KCl 、 0.2mM EDTA 的 pH 7.4 PBS 溶解 , 于 50~100 倍体积的上述 PBS 中 4 ℃透析过夜。
11. 取少量透析后样品适当稀释后 , 以紫外分光光度计检测蛋白含量 ,SDSPAGE 检测抗体纯度。
方案二 ( 饱和硫酸铵溶液沉淀法 ) 1~5 同方案一。
6. 上清经砂芯漏斗或 125 μ m 的尼龙网过滤后 , 于 50 倍体积的 0.01M pH7.4 PBS 中 4 ℃透析 6h 7. 在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。
8. 4 ℃静置 1h 以上 0 9.4 ℃ ,10000 rpm 离心 3Omin, 弃上清。
10. 沉淀用适量含 137mM NaCl 、 2.6mM KC1 、 0.2mM EDTA 的 pH7.4PBS 溶解 , 于 50~100 倍体积的上述 PBS 中 4 ℃透析过夜。
11. 取少量透析后样品适当稀释后 , 以紫外分光光度计检测蛋白含量 ,SDSPAGE 检测抗体纯度。
(四) 注意事项
1. 无论是含有单克隆抗体的腹水还是细胞培养上清 , 均含有脂蛋白、脂质、细胞 碎片等杂质 , 必须预先去除。通常采用过滤的方法去除脂质和大的颗粒 , 用离心的方法 去除细胞碎片和大的蛋白聚合物 ; 如果材料里含有大量脂质 , 还必须用二氧化硅粉或玻 璃纤维吸附等将其去除。
2. 盐析时 , 溶液中的蛋白浓度对沉淀有双重影响。蛋白浓度愈高 , 沉淀所需的盐 饱和度极限愈低 , 但杂蛋白的共沉作用也随之增加。因此 , 在盐析时血清和腹水都应作 适当稀释 , 一般血清作倍比稀释 , 腹水作 2 倍稀释。
3. 辛酸 -硫酸铵法还可以用来纯化血清中的抗体 , 此时辛酸用量因抗体来源不同而稍有变化 , 人血清为 70 μ/ml, 兔血清为 75 μ/ml, 小鼠血清为 40 μ/ ml 。
4.pH 值对盐析的影响 : 抗体的溶解度与 pH 值和盐浓度有密切关系 , 选择适当的 pH 值可大大提高对单克隆抗体的沉淀效果。通常溶液的 pH 值与目标蛋白的等电点相 等时 , 沉淀效果最好 , 另外 , 硫酸铵在水中显酸性 , 为防止对蛋白质的破坏 , 应将溶液的 pH 值调至中性。
5. 该法主要用于 IgG1 和 IgG2b 的纯化 , 对 IgA 和 IgG3 的回收率及纯化效果都较差。蛋白质经硫酸铵沉淀、离心分离后 , 沉淀中含有硫酸铵 , 在此状态下冷冻保存 ,蛋白质比较稳定。若需进一步处理，首先需要除盐，方法可选择透析，凝胶过滤等。
