钱宗耀，刘河疆，张维维，帕尔哈提*
（新疆农业科学院农业质量标准与检测技术研究所； 农业部农产品质量安全风险评估实验室 乌鲁木齐 830091）
摘要：对市售九种豆类（鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆）中的脂肪酸组分进行含量测定研究，以十一烷酸甘油三酯为内标物，采用气相谱-质谱联用技术对各个样品中脂肪酸甲酯组分进行分析，辅助NIST检索工具鉴定各脂肪酸组分。通过本次试验建立内标法计算豆类中脂肪酸组分含量的方法。结果表明，本次试验的豆类样品脂肪酸组分及含量均有差异，其中青豆的总脂肪含量最高，鹰嘴豆的不饱和脂肪酸含量最高。通过软件分析相关性，其中各组分间除十五烷酸外，都具有很好的显著相关性，主成分分析获得前2个主成分可以解释全部变异的98%。聚类分析将九种豆类归入四大类。该实验方法前处理简便快捷，结果准确度高，分析时间较短，可为内标法测定脂肪酸含量的研究提供借鉴。 关键词：豆类；脂肪酸；气质联用；内标法；因子分析；聚类分析
中图分类号： 文献标识码：A 文章编号：
Determination of fatty acids and factor analysis from beans by gas chromatography mass spectrometry using internal standard Method
Qian Zongyao, Liu Hejiang, Zhang Weiwei, Paerhati*
(Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research, Xinjiang Academy of Agricultural Science, Laboratory of quality& safety risk assessment for agro-products(Urumqi),Ministry of agriculture, Xinjiang Urumqi 830091）
Abstract: Study on fatty acid composition in nine kinds of beans samples including chickpea、soybean、 green pea、colored kidney bean、dolichos lablab、pea、mung bean、Black bean、Red Bean. Use the compound C11:0 methyl ester for internal standard. The technology of gas separation of fatty acid methyl ester composition andcomposition analysis of NIST helper tools to retrieve chromatography-mass spectrometry. The results showed, Both fatty acid components and contents are differenc
e between nine kinds of beans samples of this experiment, It can be seen that green beans had the highest total fat content in those samples, chickpeas had the highest content of unsaturated fatty acids. Through software analysis, the correlation between the components of each group was very significant except C15:0, The first principal components obtained by factor analysis could account for 98% of all variations. The single linkage dendrograms based on principal component values divided the nine kinds of beans into four clusters. This method is simple and fast, the analytic time is short and the result is accurate, which can provide reference for the similar products fatty acid content determination.
Key words: beans; fatty acids; GC-MS; internal standard method; factor analysis; cluster analysis
当今社会人们对膳食结构的研究日益关注，对食品的要求也从生理需要向营养、食用健康等方面关注，豆类的品种很多，泛指所有能产生豆荚的豆科植物，是中国人的传统食品。各种豆类均含有人体必须的营养成分，有很高的食用和保健价值，可以提高人体的抵抗能
力，能有效降低心脏病和癌症的发病几率[1-2]，天然食物均含有各种不同的脂肪酸成分，脂肪酸有着重要的生理功能，是人类所需的营养之一，脂肪酸的种类很多，不同脂肪酸对人体的作用各不相同，单独讨论某种或某类脂肪酸的好坏是不科学的，脂肪酸不同比例的合理摄入在一定程度上关系着人体的健康，因此研究不同食品中脂肪酸组分具有很高的营养学价值，同时对各种样品中的脂肪酸含量的准确测定也是趋势。
目前根据豆类的营养素种类可将它们分为两大类。一类为高蛋白质、高脂肪豆类。另一种豆类则以碳水化合物含量高为特征，本次试验选择九种常见膳食豆类进行脂肪酸含量测定研究，较为系统的对多种豆类进行脂肪酸含量的比较，通过主成分分析和系统聚类分析进行研究。本次测定方法与传统方法相比较简便快捷，谱分离完全，专属性好，质谱具有准确的定性功能，可完全对脂肪酸组分进行定性。通过本研究可为豆类样品的脂肪酸含量检测提供可靠的试验依据。
1材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 试验对象
豆类：鹰嘴豆、黄豆、青豆、花芸豆、扁豆、豌豆、绿豆、黑豆、红豆：市售。
1.1.2 主要试剂
脂肪酸甲酯混合标准品（纯度≥99%）、十一烷酸甘油三酯（纯度≥99%，5.00mg/mL)：美国Sigma公司。
正己烷、甲醇：Fisher Scientific公司；氢氧化钾：天津盛奥化学试剂厂。
1.1.3 主要仪器
气相谱—质谱联用仪（配电子轰击离子源）：Perkin Elmer公司；分析天平：OHAUS公司；旋涡混合器 ：IKA公司。
1.2 试验方法
1.2.1 脂肪酸甲酯化
准确称取不同豆类样品的均匀粉末2.5 g 于试管中，加入内标溶液2.0 mL，加入5.0 mL
氢氧化钾-甲醇溶液（2.0 mol/L），漩涡混匀后，40 ℃水浴20 min进行脂肪酸甲酯化，冷却至室温后分别加入5.0 mL正己烷进行脂肪酸甲酯萃取，每个样品分别漩涡30 s后静置分层后，取上层有机相（正己烷）稀释后用微孔滤膜(0.45μm董振堂）过滤后装进样瓶进行气相谱—质谱仪器分析。
1.2.2 气相谱-质谱联用仪条件
谱柱：FFAP（30 m×0.25 mm×0.5 μm）；载气：氦气（99.999%）；流速：1.0 mL/min；进样：1.0 μL，分流比1:10；进样口温度：250 ℃；程序升温：初始温度80 ℃，以10 ℃/min升温至230 ℃，保持15 min；离子化方式：电子轰击（EI）；离子化能量：70 eV；离子源温度：230 ℃；传输线温度270 ℃；溶剂延迟：2 min；扫描范围：50～450 amu；扫描方式：全离子扫描（SCAN）。
1.2.3 豆类样品中脂肪酸组分定性分析
对混合脂肪酸标准进行全离子扫描分析，辅助NIST2011谱图库检索进行脂肪酸甲酯化合物质谱解析并确定各种脂肪酸甲酯的保留时间。通过保留时间及谱图检索匹配各种豆类脂肪酸的化学结构。
1.2.4 豆类样品中脂肪酸组分定量分析
对测试样品的谱图进行解析，通过以下内标法公式[3]进行计算：
； 视听剧场
式中：Xi—样品中脂肪酸甲酯i的含量%；Fi—脂肪酸甲酯i的响应因子；Ai—样品中脂肪酸甲酯i的峰面积；Ac11—样品加入内标物甲酯峰面积；Cc11—内标物浓度(mg/mL)；Vc11—样品加入内标物体积(mL)；1.0067—十一碳酸甘油三酯转化为甲酯的转换系数；m—样品的质量(mg)；Csi—混标中脂肪酸甲酯i的浓度(mg/mL)；Ac11—十一碳酸甲酯面积；Asi—脂肪酸甲酯i的峰面积。Cc11—混标中十一烷酸甲酯的浓度(mg/mL)。
1.2.5 统计分析方法
本次试验样品均称取动量矩3份，每个样品平行测定2次，取平均值进行数据分析，涉及相关统计分析、聚类分析和方差分析方法使用SPSS 22.0软件比较分析，置信区间为95%。
2 结果与分析
2.1 样品前处理方法的确定
目前脂肪酸的测定试验均需要进行样品的甲酯化反应，常规的甲酯化方法有法、三甲基氢氧化硫法（TMSH）法、重氮甲烷、盐酸-甲醇、硫酸-甲醇和氢氧化铵-甲醇等[4-5]，以上方法均有一定的局限性。本文采用氢氧化钾-甲醇法进行甲酯化反应，通过多次试验均证明效果较好[6-7]，该方法操作过程无危害、简单快速、重现性好。
2.2 脂肪酸甲酯标准品谱分析
将脂肪酸甲酯混合标准液进样，通过优化最佳的谱条件进行分析，由气-质联用仪工作站所得的谱图见图1。由标准谱图可见各组分分离情况良好，内标物与其他组分也相互没有干扰，已达到定性与定量测定分析的要求。
图1 脂肪酸甲酯混合标准总离子流谱图
2.3 谱仪器重现性试验
取同一样品重复测定3次，按试验步骤进行分析，其中各脂肪酸含量变异系数（CV）值均低于3%，表明本次试验的仪器稳定性较好，测定数据符合要求。
表1 重复性试验数据
序号 | 化学 成分 | 鹰嘴豆 |
重复测定值 | 平均值 | RSD（%） |
1 | C14:0 | 4.85 | 4.7 | 4.67 | 4.74 | 2.0 |
2 | C15:0 | 2.1 | 2.22 | 2.13 | 2.15 | 2.9 |
3 | C16:0 | 323.1 | 317.9 | 335.8桁架桥 | 325.6 | 2.8 |
4 | C17:0 | 1.29 | 1.24 | 1.28 | 1.27 | 2.1 |
5 | C18:0 | 70.5 | 71.0 | 74.2 | 71.9 | 2.8 |
6 | C18:1(Z) | 2013上海高考物理1338.2 | 1347.5 | 1361.6 | 1349.1 | 0.9 |
7 | C18:2(Z,Z) | 2725.4 | 2738.6 | 2741.6 | 2735.2 | 0.3 |
8 | C18:3 | 198.1 | 196.4 | 198.3 | 197.6 | 0.5 |
9 | C20:0 | 20.5 | 21.8 | 21.6 | 21.3 | 3.3 |
10 | C20:1 | 7.75 | 7.88 | 7.89 | 7.84 | 1.0 |
11 | C22:0 | 10.2 | 9.88 | 9.77 | 9.95 | 2.2 |
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