施维松;陈瑞爱;张晓楠;詹烜子;唐兆新
【摘 要】使用浓度为0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％和0.6％的二乙烯亚胺(BEI)37℃灭活禽流感病毒(Re-5株)24h,经灭活效果检测BEI浓度≥0.5％可以完全灭活病毒.0.5％的BEI和0.2％的甲醛灭活禽流感病毒,以相同配方制备疫苗,免疫效力比较研究结果显示,按照规程要求免疫21d后采血HI效价分别为8.35log2和7.66log2,BEI灭活疫苗的抗体水平要高于甲醛灭活疫苗.本研究为禽流感灭活疫苗灭活工艺研究提供了依据. 【期刊名称】《中国兽医杂志》
【年(卷),期】2012(048)008
青岛滨海职业学院【总页数】3页(P21-23)
【关键词】禽流感病毒;BEI;灭活疫苗;免疫效果
【作 者】施维松;陈瑞爱;张晓楠;詹烜子;唐兆新
【作者单位】广东省兽用生物制品生物工程技术研究与应用企业重点实验室,广东肇庆526238;肇庆大华农生物药品有限公司,广东肇庆526238;广东省兽用生物制品生物工程技术研究与应用企业重点实验室,广东肇庆526238;肇庆大华农生物药品有限公司,广东肇庆526238;肇庆大华农生物药品有限公司,广东肇庆526238;肇庆大华农生物药品有限公司,广东肇庆526238;广东省兽用生物制品生物工程技术研究与应用企业重点实验室,广东肇庆526238;肇庆大华农生物药品有限公司,广东肇庆526238
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.65+9.5
禽流感（AI）是由A型流感病毒引起的一种以侵害呼吸系统为主的疾病，是危害禽类健康的重要传染病之一。该病给养禽业带来了巨大的经济损失，同时也对人类健康带来严重威胁。AI的防控研究具有重要的经济学和公共卫生意义。
疫苗免疫是我国AI防控禽流感传播的重要途径。我国从20世纪90年代开始禽流感病毒（AIV）灭活疫苗研究，其中H5N1亚型重组病毒株的AIV灭活疫苗已经广泛应用，具有良
好的免疫效果，在H5N1亚型禽流感的防控中起到了重要的作用。国内的禽流感灭活疫苗的生产工艺中，灭活过程都是使用甲醛溶液作为灭活剂，其灭活能达到很好的效果，但是甲醛灭活不仅灭活了病毒也破坏了病原体的免疫原性，并且甲醛灭活时间比较长，易受温度、pH值、浓度、是否存在有机物、病原体的种类和含氮量等因素影响，残留的游离甲醛，若随疫苗注入机体后，会产生应激性反应。所以需要寻更加安全可靠的灭活剂进行病毒的灭活。BEI是一种烷化剂，对病毒具有很强的灭活作用，其作用原理是破坏微生物核酸，而不影响其蛋白质成分，并保持病毒抗原性［1-2］。本试验通过使用不同终浓度的BEI和不同的灭活时间、温度对AIV进行灭活，确定BEI的灭活条件，并制备疫苗进行免疫试验，结果表明，该灭活苗安全、可靠，其免疫原性明显优于甲醛灭活疫苗。
1 材料与方法
创新的国度1.1 抗原 禽流感H5N1亚型（Re-5株）抗原由肇庆大华农生物药品有限公司生产；禽流感H5N1亚型（Re-5株）诊断抗原，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
1.2 试验动物与鸡胚 3～4周龄SPF鸡及10日龄鸡胚，均购自新兴大华农禽蛋有限公司SPF实验动物中心。
1.3 主要试剂 二乙烯亚胺（BEI），购自TCI公司；硫代硫酸钠，购自 Alfa公司；PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、RNAiso plus总 RNA提取试剂、dNTP和Ex Taq，均购自TaKaRa公司；PCR引物由Invitrogen公司合成。
1.4 BEI的配制 用0.2mol／L NaOH溶液配制浓度为0.1mol／L BEI溶液［3］。
1.5 抗原灭活 在负压生产区，根据病毒液的量分别加入终浓度为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%的BEI，至于37℃恒温摇床中（120r／min），分别灭活1，2，4，8，12，18，24h后，加 BEI用量10%硫代硫酸钠终止反应。
1.6 灭活效果检测 灭后样品按照生产规程灭活检验要求接SPF鸡胚，孵育后72h检测血凝价，并盲传一代，检测血凝价。
1.7 血凝（HA）试验 取灭活前后的病毒液，按照中国兽药典红细胞凝集试验（CVP3／2010／FL／010）分别测定HA。
1.8 灭后病毒完整性 常规方法扩增病毒，提取RNA，反转录获得cDNA。根据GenBank AIV核苷酸序列设计并合成HA引物，上游引物：5′-aaaatggagagaatagtgctt-3′，下 游 引 物：
5′-ctacaatctgaactcaataaat-3′，HA基因片段总长度为1720bp。
竹直锥大象虫
1.9 BEI灭活疫苗制备 按照规程规定，油水比例2∶1进行乳化，分装备用。sem扫描电子显微镜
1.10 BEI灭活疫苗安全性检验 60羽SPF鸡随机分为6组，每组10羽，其中1、2、3、4、5组用5批BEI灭活疫苗安全性评价，每羽鸡胸部肌肉注射2 mL。6组空白对照组，不接种。
1.11 BEI灭活疫苗效力试验 110羽SPF鸡随机分为11组，每组10羽，1～5组用于5批BEI（0.5%）灭活疫苗免疫接种，6～10组用于对应的甲醛（0.2%）灭活对照组疫苗的免疫接种，11组作为空白对照组，比较BEI灭活疫苗的免疫效果。每羽鸡胸部肌肉注射0.3mL，免疫后14d、21d逐羽采血分离血清，进行HI抗体检测。
2 结果
2.1 BEI灭活抗原结果 不同浓度BEI 37℃灭活抗原不同时间点取样，进行灭活效果检测，结果BEI终浓度≥0.5%，病毒能够完全灭活，重复3次结果保持一致（见表1）。
表1 不同浓度BEI灭活禽流感病毒结果注：血凝检测结果为0，判定为“-”，病毒已完全灭活；
血凝检测结果不为0，判定为“＋”，病毒未完全灭活灭活浓度（%） 灭活时间（h）1 2 4 81218 240.1 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋0.2 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋0.3 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋0.4 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋0.5 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ -0.6 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ -
2.2 血凝试验结果 病毒液灭活前平均HA价为8.4log2，灭活后平均HA价为8.4log2，表明BEI在灭活前后对AIV的效价无影响（见表2）。白嘉轩
表2 灭活前后HA价结果批次 灭前HA价（log2）灭前平均HA价灭后HA价（log2）灭后平均HA 价88.41 88.42 8 83 9 94 9 95 8 8
2.3 病毒完整性检测结果 通过设计的HA引物对病毒灭活前后提取的总RNA进行检测，终浓度0.5%的BEI在37℃灭活病毒24h后，5批样品均扩增不到目的条带（见图1）；该结果与灭活效果结果一致，表明在这些条件下病毒已经被灭活。
2.4 BEI灭活疫苗安全性试验结果 观察至免疫后14d，各试验组鸡只均健活，剖检观察疫苗吸收良好，未出现异常情况。
图1 病毒灭活前后HA基因扩增结果M：DL-2000Marker；1：阴性对照；2：灭前病毒HA基坦克巷战
因；3：第1批灭后病毒；4：第2批灭后病毒；5：第3批灭后病毒；6：第4批灭后病毒；7：第5批灭后病毒
2.5 BEI灭活疫苗效力试验结果 BEI灭活疫苗和对照疫苗免疫14d、21d后分别采血进行抗体水平检测，结果BEI灭活疫苗免疫14d、21d的平均效价分别为7.27log2、8.35log2，同批抗原对照甲醛灭活疫苗免疫14d、21d的平均效价为6.33log2、7.66log2（见表3）。由试验结果看出，禽流感病毒BEI灭活疫苗诱导鸡只产生抗体的能力高于甲醛灭活疫苗。
3 讨论
禽流感是对我国养禽业危害较大的疫病之一。预防该病主要采用禽流感灭活疫苗，传统的AIV灭活方法是使用甲醛灭活，易使病毒表面融合蛋白抗原受到破坏，同时可能存在灭活病毒不彻底，免疫动物易发生感染现象［4］。BEI灭活疫苗的最大特点就是BEI破坏病毒的核酸，使病毒完全丧失感染力，而不损坏其蛋白质衣壳，保留其保护性抗原，病毒的免疫原性几乎不受破坏［5-6］。从实际应用考虑，BEI灭活剂为瓶装固体粉末，性质稳定，便于运输和保存，同时配制简单，灭活效果好，使用成本较低，适合于大生产应用。本研究使用终浓度0.5%BEI能够完全灭活禽流感病毒，由BEI灭活的禽流感病毒制成灭活疫苗对
免疫动物安全，并且能保持良好的免疫原性，21d的免疫效价为8.35log2，同比的甲醛灭活疫苗免疫效价只有7.66log2，说明BEI灭活疫苗诱导鸡只产生抗体的能力要优于甲醛灭活疫苗。虽然研究已经获得了实验室BEI灭活禽流感病毒的浓度和灭活时间，但还要在实际生产中对BEI灭活剂灭活禽流感病毒的浓度和时间进行深入的探讨。
表3 BEI灭活疫苗免疫效果组别 试验动物数量 免疫剂量 抗体效价（GMT）14d（log2） 14d平均效价 21d（log2） 21d平均效价BEI灭活疫苗1 10 0.3 6.667.277.628.352 10 0.3 7.06 7.573 10 0.3 7.32 8.324 10 0.3 7.45 9.285 10 0.3 7.85 8.98甲醛灭活疫苗6 10 0.3 5.49 6.33 6.867.667 10 0.3 6.14 6.718 10 0.3 6.08 7.159 10 0.3 7.08 8.8810 10 0.3 6.88 8.69对照11 10 - 0 0 0 0
