张传明;冷雪梅;蒋雯雯;杨敏
【摘 要】Through cultivating Rabies virus strain CVS-11 on Neuroma cells, and testing the ti-ter and potency of different batches of harvested fluid, to get the experiment data for Rabies vaccine manufacture and process optimization. The first and second harvesting virus titers were higher than 107.0 FFU/0.1 mL, virus virulence between 106.4 and 107.0 LD50/0.03 mL, and can be used of manufacture Rabies vaccine. The third harvesting virus titer was about 106.0 FFU/0.1 mL, virus virulence was between 105.0 and 105.3 LD50/0.03 mL, and was not useful for Rabies vaccine manufacture.%本研究通过神经瘤细胞（NA）培养CVS-11株狂犬病病毒，并测定不同批次的病毒毒价，为优化狂犬病疫苗的生产工艺提供数据支持，具有实际意义。病毒培养和检测结果表明，第1次和第2次收获的病毒液病毒含量较高，在107.0 FFU/0.1 mL以上，毒力为106.4～107.0 LD50/0.03 mL；而第3次收获的病毒含量则较低，只有106.0 FFU/0.1 mL左右，毒力为105.0～105.3 LD50/0.03 mL。第1次和第2次收获的病毒液可用于制备狂犬疫苗，第3次收获的病毒液因毒价较低不适于制备狂犬疫苗。 【期刊名称】《现代畜牧兽医》
【年(卷),期】2014(000)007
【总页数】3页(P42-44)
【关键词】神经瘤细胞;狂犬病病毒CVS-11株;病毒含量;病毒毒力
【作 者】张传明;冷雪梅;蒋雯雯;杨敏
【作者单位】常州同泰生物药业科技有限公司，江苏 常州 213136;常州同泰生物药业科技有限公司，江苏 常州 213136;常州同泰生物药业科技有限公司，江苏 常州 213136;常州同泰生物药业科技有限公司，江苏 常州 213136
【正文语种】中 文
【中图分类】S852.659.5
狂犬病是由狂犬病病毒引起的人畜共患的烈性传染病，也是迄今为止人类病死率最高的传
染病，几乎达到100%[1]。欧美日等国通过对宠物注射和野生动物投喂口服疫苗等免疫手段已有效控制了狂犬病，发病人数每年不超过10例[2]。我国每年人用狂犬病疫苗和抗血清总费用超过100亿元，但近10年来，每年仍有2 000～4 000人死于狂犬病，居世界第二位，仅次于印度，投入和产出严重不对称[3-4]。
我国对狂犬病防治非常重视，人用狂犬疫苗和兽用狂犬疫苗生产企业正加大力度开发生产高效、安全的狂犬疫苗，尤其是兽用疫苗生产企业。近两年农业部批准的兽用狂犬疫苗有中国兽医药品监察所的Flury株冻干灭活疫苗、辽宁成大的PV2061株灭活疫苗、唐山怡安的CTN1株灭活疫苗、辽宁益康的Flury株灭活疫苗、解放军军事兽医研究所的CVS-11株灭活疫苗、常州同泰的SAD株灭活疫苗等，再加上以前批准的Flury株减毒活疫苗等，共有近10个品种上市供应。
狂犬病减毒活疫苗存在毒力返强的风险，在西方发达国家和我国的人医方面已禁止使用，在我国的宠物犬上也不建议使用[5-6]。我国的城市犬和大部分农村地区已逐渐淘汰减毒活疫苗，转而使用狂犬病灭活疫苗，只有部分落后地区的农村仍有少量减毒活疫苗在使用[7]。
诗2000>拜金一族
异物志现将CVS-11株狂犬病毒的初步培养和毒价检测试验汇报如下。
1.1 材料
1.1.1 神经瘤细胞（NA细胞） 原始细胞从美国Kansas State University引进，经常州同泰生物药业科技有限公司传代、鉴定和保管。
1.1.2 CVS-11病毒 原始毒种从美国Kansas State University引进，经常州同泰生物药业科技有限公司传代、鉴定和保管。狮子王球
1.1.3 荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体 购于美国Fuj irebio公司。
1.1.4 培养基、胰酶、血清等 使用的DMEM培养基、胎牛血清均从国内采购，胰酶购于GIBCO公司。
凤斗1.2 方法
1.2.1 NA细胞培养传代 用DMEM培养基培养传代NA细胞，培养液配方为：90%DMEM，10%牛血清，0.03%谷氨酰胺，用7.5%NaHCO3调节pH 7.2～7.4，培养温度为37℃。将
已长成致密单层的NA细胞倒去培养液，用0.25%胰酶消化，细胞出现间隙时弃胰酶液，加适当体积的培养液，分至新瓶中置37℃培养。一般3～4 d可长成致密细胞单层。
1.2.2 CVS-11病毒培养 在NA细胞单层达到90%左右时，弃去原有培养液，更换维持液，然后接种CVS-11病毒，置33～35℃培养。接毒后4、7、10 d收获病毒，前2次收获同时加入新鲜维持液继续培养，收获液除去颗粒和存留细胞，分装，置-60℃以下保存。
1.2.3 病毒含量检测 用直接免疫荧光法检测CVS-11病毒含量。
1.2.3.1 病毒稀释 准备2块96孔细胞培养板，先在第1块96孔板每孔中加入180μL培养液；在第1列孔中加入20μL待检病毒原液，充分混匀；从第1列孔中吸出20μL加入到第2列孔中，充分混匀；依次类推，直至加到最后一列孔；从第1列孔到第8列孔稀释度分别为10-1～10-8；每个稀释度6孔。
1.2.3.2 加样 取出第2块96孔板，将第1块96孔板中的病毒稀释液吸至第2块96孔板的相应孔中，每孔100μL。并设不加病毒的培养液对照。
1.2.3.3 培养 在每孔中加入100μL含2×104NA细胞悬液，混匀，置37℃、5%CO2培养箱培
养48 h。
1.2.3.4 固定 弃掉96孔培养板中的培养液，用pH 7.2、0.07 mol/L的PBS洗板1次，再用80%丙酮洗板1次，然后用80%丙酮室温固定30 min，弃丙酮后置于室温干燥。
1.2.3.5 荧光染 每孔加入50μL工作浓度的荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，轻轻摇晃后放入湿盒中37℃孵育30 min；弃掉荧光标记抗狂犬病病毒核蛋白抗体，用PBS洗2次；再把96孔板轻轻扣在吸水纸上吸掉多余的PBS。
1.2.3.6 观察 置于荧光显微镜下观察。通过荧光病灶形成的稀释度及荧光病灶的孔数来计算病毒荧光灶单位(FFU)。
计算公式为：
X0：100%被感染的稀释度的对数值；d：稀释倍数的对数值；N：每一个稀释度重复孔数；n：从100%被感染到100%没有被感染的稀释度阳性孔数。
以上结果求反对数即为病毒含量FFU/0.1 mL。1.2.4 毒力测定 先将CVS-11病毒样品用PBS
液10倍系列稀释，取3个适宜的稀释度，脑内接种11～13 g小鼠，每个稀释度5只，每只0.03 mL。同时用一组（5只）作为对照，只注射用于稀释病毒的PBS而不含病毒，每天观察小鼠两次，记录小鼠发病和死亡数量，攻击后最初4 d内死亡的小鼠不作统计，第5天后死亡和呈现典型脑病症状的小鼠进行计算统计，观察14 d。根据死亡和呈现典型脑病症状数据用Spearman-Käber公式计算半数致死量（LD50）。
2.1 不同批次CVS-11病毒液病毒含量检测结果本试验培养了3批CVS11病毒液，每批5只2 000 mL克氏瓶（每瓶实际装液量300 mL），均进行3次收获，每批每次收获的病毒液约1 500 mL，批号分别为20121001-1、20121001-2、20121001-3、201210 02-1、20121002-2、20121002-3、20121003-1、20121003-2、20121003-3。病毒含量检测结果见表1。
每批第1次和第2次收获的病毒液病毒含量都在107.0FFU/0.1 mL以上，而第3次收获的病毒含量则较低，只有106.0FFU/0.1 mL左右。
2.2 不同批次CVS-11病毒液毒力 用小鼠脑内接种法将每批收获的3次病毒液进行了毒力检测，结果见表2。
每批第1次和第2次收获的病毒液毒力均在106.4～107.0LD50/0.03 mL，而第3次收获的病毒液毒力较低，在105.0～105.3LD50/0.03 mL。
目前CVS-11株狂犬病毒一般用于狂犬抗体检测中和试验的检测病毒，也有一些单位用其生产狂犬病疫苗，如解放军军事兽医研究所就是用CVS-11病毒成功注册了动物用狂犬病灭活疫苗。本课题组成功注册申报了SAD株狂犬病灭活疫苗后，拟用CVS-11株病毒与SAD株病毒制成二价苗，因此开展了神经瘤细胞培养CVS-11病毒的前期试验，通过用NA细胞培养CVS-11病毒，观察该病毒在NA细胞上的培养和增殖规律，为将来联苗的研究提供一些试验数据。
CVS-11株狂犬病毒可在BHK细胞上生长，但在神经瘤细胞上的适应性更好，产毒量更高，因此选用NA细胞做为培养基质。根据以上三批病毒培养试验结果，发现CVS-11病毒在神经瘤细胞上培养，第1次和第2次收获的病毒毒价较高，相应的毒力也较高，而第3次收获的病毒毒价和毒力相对较低。因此，将来在疫苗制备时采用前两次收获的病毒液，以保证疫苗的效价和免疫效果。
如要将培养收获的CVS-11病毒制备狂犬病二价苗，还需要将CVS-11病毒液灭活，与SAD
病毒液按一定比例混合，加入一定浓度的氢氧化铝佐剂。用制好的疫苗免疫试验犬，定期采血检测犬的抗体水平，观察二价苗的免疫效果，这是下一步的工作。CVS-11病毒的灭活方法、及与SAD病毒的最佳配比还需进一步试验来证实。
【相关文献】《手机里的秘密》
[1]俞永新.狂犬病和狂犬病疫苗[M].第二版.北京：中国医药科技出版社，2007，1-4.
