王 曦 曹亚澄 韩 勇 唐昊冶 王如海 孙晓丽 孙玉芳（土壤与农业可持续发展国家重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），南京 210008）
摘 要 采用化学转化法可同时测定各种水体样品中硝酸盐的氮、氧同位素比值。在弱碱性环境中，镀铜镉粒将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后在弱酸性缓冲体系中叠氮酸根将亚硝酸盐转化为氧化亚氮。通过带有预浓缩装置的同位素比值质谱计测定氧化亚氮的氮、氧同位素比值，并用公式将其换算为硝酸盐的氮、氧同位素比值。通过国际标准样品和实验室标准样品的多次检测证实化学转化法具有适用范围广、灵敏度高、操作简便、准确的特点，其转化过程仅需两步，且需样量仅为4.5 μg NO3--N。δ15N和δ18O的测量精度分别为0.31‰和0.55‰，测定值与参考值的差异均小于1 σ，测量的精确度和准确度均可满足样品分析的需求。 关键词 硝酸盐；氧化亚氮；氮同位素比值；氧同位素比值
中图分类号 X132；0615.4+5 文献标识码 A
硝酸盐是氮元素在自然界中存在的主要形式之一，也是生物可用氮的主要形态。目前，由于人类活动的原因，环境中硝酸盐污染情况日益严重，成为全球性的环境问题，并引起了社会和科学工作者的极大关注。硝酸盐氮、氧同位素组成是研究全球氮循环的重要依据，可通过其来识别硝酸盐污染的来源和研究氮素的迁移转化过程。
常规分析水中硝酸盐氮、氧同位素组成的方法主要包括［1-4］：将样品去除杂质离子后低温浓缩，再通过离子树脂富集，并加入中和剂形成硝酸盐沉淀；将固体硝酸盐分离纯化后高温煅烧分别转化为N2与CO2气体送入气体质谱计中测定氮、氧同位素比值，或利用元素分析—同位素质谱联用仪同时测定硝酸盐的氮、氧同位素组成。
由于自然水体样品中硝酸盐浓度很低，因此常用的硝酸盐氮、氧同位素的分析方法的应用存在着诸多困难和局限性［5］：天然水体中硝酸盐的浓度较低，若要满足常规方法的测定要求，需要的样品量极大，一般需采集0.5～10 L样品，而很多实验可取得的水样量只有几十毫升，常规的采样无法满足分析的要求；前处理步骤多，过程繁琐，存在多步平衡反应，易引入交叉污染和同位素分馏，分析误差较大；硝酸盐的氮、氧同位素需分别测定，损失了氮、氧同位素的相关信息。
随着分析测试技术的发展，研究者们提出了新的检测方法，即测量由硝酸盐转化而来的氧化亚氮气体，
从而得到溶液中硝酸盐的氮、氧同位素比 值［8，12，17-20］。新检测方法一般分为化学转化法和生物转化法。生物转化法即细菌反硝化法是目前报道较多的方法，但仍存在生化反应复杂、普适性差和菌种性状易退化等诸多问题。而化学转化法与生物转化法相比具有反应稳定，反应机理简单，相关操作易掌握等优点。
因此，本文采用化学转化法将溶液样品中的硝酸盐转化为氧化亚氮，先通过金属镉将硝酸盐还原为亚硝酸盐，再运用叠氮酸盐将其转化为氧化亚氮。将产生的氧化亚氮输入配备自动捕集纯化浓缩系统的IRMS测定其氮、氧同位素比值，通过公式换算得出硝酸盐的氮、氧同位素比值。同时还利用IAEA的多个参考物质和不同来源的水样对方法的有效性、准确度和精密度进行了方法的验证。
*土壤与农业可持续发展国家重点实验室分析技术方法研究项目（Y412010010）资助
作者简介： 王曦（1981—），男，江苏南京人，硕士，工程师，主要从事环境中轻稳定性同位素研究。E-mail：xiwang@ issas.ac
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王 曦等：化学转化法测定水体中硝酸盐的氮氧同位素比值
3期1 材料与方法
1.1 方法原理
在弱碱性环境中，镀铜镉粒将溶液中的NO 3-还原为NO 2-：
NO 3
- + Cd + H 2O
NO 2
- + Cd 2+
+2OH
-
然后在酸性缓冲介质中NO 2-与N 3-反应，生成N 2O。当反应体系的pH>2时，反应过程为［6］：
NO 2
-
+ H +HNO 2
HNO 2 + H 2O
H 2NO 2+ + OH
-H 2NO 2+ + N 3- 慢slow
N 3NO + H 2O 快fast N 2O + N 2
当反应体系中存在大量卤素离子时，反应速率会加快，其机理可能为［7］：
NOCI + N 3
- 快fast N 3NO + CI - 快fast N 2O+N 2N 2O为非对称分子，其分子结构为N-N-O，N 2O的δ15N Air ‰为两个氮原子δ15N Air ‰的平均值，即：
（1）
而反应中产生的N2O，则是由参加反应的NO2- 提供的一个氮原子和一个氧原子，N3-提供的一个氮
原子构成。还原得到的NO2-的氮、氧同位素比值与原溶液中NO3-相同。因此，存在以下关系：（2）δ18O SMOW ‰（N 2O）=δ18O SMOW ‰（NO 2-） =δ18O SMOW ‰（NO 3-）（3）
因此，在N 3-的氮同位素比值恒定时，反应产生的N 2O的氮、氧同位素比值与NO 3-的氮、氧同位素比值成线性关系，其相关曲线的理论斜率分别为0.5（N）和1（O）。经质谱测定所得的N 2O的氮、氧同位素可通过公式换算为溶液中NO 3-的氮、氧同位素比值。
1.2 仪器与主要试剂
仪器装置：SARTORIUS PB-10酸度计，可精-1有机玻璃管或苯乙烯管；带痕量气体全自动预浓缩装置的气体稳定同位素比值质谱仪：Elementar TraceGas -Isoprime100，连续流进样模式。
主
要
试
剂：NaCl（AR.）、HCl（0.5 mol
L -1）、咪唑溶液（1 mol L -1）、镀铜镉粒（Skalar AnalyticalB.V. cat No ：13913）、NaN3溶液（2 mol L -1）、醋酸溶液（20%）、NaOH 溶液（6 mol L -1）。1.3 样品制备与分析
样品制备步骤参见图1。
δ15
N Air ‰（N 2O）=
δ15N Air ‰（15N -N -O）+δ15N Air ‰（N -15N -O）
2
δ15N Air ‰（N 2O）=
δ15N Air ‰（N 3-）+δ15N Air ‰（NO 2-）
2
δ15
N Air ‰（N 3
-）+δ15N
Air ‰（NO 3-）
2
=
图1 转化操作流程图
Fig. 1 Flowchart of the conversion operation
样品稀释：用0.5 m o l L -1 N a C l 溶液稀释样 品［9］，使样品中NO 3--N浓度降至20 μmol L -1。过高的NO 3--N浓度会降低NO 2- 转化成N 2O的产率并产生同位素分馏现象，对检测结果产生不利影响。对于Cl -低于0.5 mol L -1的样品，需向样品中加入NaCl固体使样品中Cl -浓度达到要求。一次反
应需要约16 ml水样，为保证平行检测和损耗的需要，样品稀释后的体积须在40 ml以上。一次检测需要
NO 3--N浓度为20 μmol L -1的水样16 ml，所需的NO 3--N量为0.32 μmol，约4.5 μg。
pH调整：将样品和标准溶液的pH调至8.00。利用HCl和咪唑形成弱碱性的缓冲体系。样品先加入数滴0.5 mol L -1 HCl使pH降至2～3，空白样品只需加入1滴0.5 mol L -1 HCl溶液。然后，通过滴入1 mol L -1 咪唑溶液使样品的pH升至8.00。先加入4滴咪唑溶液并测定pH，然后每加入2滴咪唑溶液再测
绵堵住。用40 ml 0.5 mol L-1 NaCl溶液（pH 8.00）冲洗管路并活化。然后将20 ml调节过pH的样品移入25 ml的烧杯中并将还原镉柱的流入端和流出端均放入烧杯中，持续还原80 min。还原完成后，用空白缓冲溶液，即40 ml 0.5 mol L-1 NaCl溶液（pH 8.00）再次冲洗管路。在移动还原镉柱时空气不能进入还原镉柱，以免氧化镉柱。
化学转化：转化过程参考了Schilman和McIlvin
的相关研究［8，12］，并加以改进，使之更易于操作。取16 ml经过还原的样品移入50 ml顶空瓶并密封。将此顶空瓶连入真空系统抽至真空，并立即注入一定量的高纯氦气以消除顶空瓶中的负压。将15 ml 20% 乙酸溶液和15 ml 2 mol L-1 NaN3溶液混合。用注射器抽取0.8 ml混合溶液注入装样品的顶空瓶中并剧烈震荡1 min，然后将顶空瓶放入30℃水浴中静置。由McIlvin［12］的研究可知，为了抑制反应体系中存在的氧交换副反应，需要建立一个碱性更强的反应体系。但是，提高溶液pH亦会降低NO2-转化为N2O的反应速率。根据他们的研究结 果［12］，反应体系合适的pH必须介于4～5之间。在样品溶液中加入0.8 ml混合溶液后，反应体系的pH 为4.5。在静置30 min后取出顶空瓶，并用1 ml注射器注入0.5 ml 6 mol L-1 NaOH溶液将反应体系pH提升至10以上，终止反应。每批样品在处理时均加入空白样品同时测定，以检测顶空样品瓶的密封情况和试剂空白。空白样品产生的N2O的信号值应保持在0.6 nA以下［8］。
质谱测定：抽取一定量的顶空瓶上部的气体注入带自动预浓缩装置的同位素比值质谱计中，测定气体样品中N2O的氮、氧同位素比值［10］。
2 结果与讨论
2.1 影响N2O产率的因素
还原体系p H的影响：镀铜镉粒的还原能力与缓冲体系的p H有关，p H越低，还原能力越强［11］。本文选择了不同pH的缓冲体系进行还原。所得结果如图2所示。
由图2可知，当pH低于8.00时，还原产率均超过了90%，可满足试验的需求。但pH较低时，镀铜镉粒的还原能力过强，NO3-被还原为NO2-后，可能会进一步被还原为N2O，降低了还原成NO2-的产率。且NO3-被镀铜镉粒还原成N2O的反应中还存在NO2-与H2O的氧原子的交换反应。因此选择还原体系pH为8.00。这样既可满足还原产率的需求，也可抑制NO3-被还原为NO2-后进一步被还 原成N2O。待遇留人
还原时间的影响：初期试验时，发现将样品溶液以5 ml min-1的速度通过还原镉柱不足以将溶液中的NO3-全部转化为NO2-。还原反应不完全易产生同位素分馏现象。同时，还发现还原产率随还原时间的增加而递增。本试验将还原镉柱的流出端和流入端均置于样品中，使样品在还原镉柱中循环反应一段时间。还原产率随还原时间的变化关系如图3所示。
图2 不同pH溶液的还原产率
Fig. 2 Yield of reduction relative to pH
图3 还原产率与还原时间的关系
Fig. 3 Relationship between yields and duration of the reaction 由图3可知，当还原时间达到60 min时，
还原产率超过90%，满足试验的需求。而还原时间超过80 min时，产率接近100%，样品中的NO3-已基本
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王 曦等：化学转化法测定水体中硝酸盐的氮氧同位素比值
3期上转化为NO 2-。为降低试验误差，提高结果的精度，本试验将还原时间确定为80 min。
还原温度的影响：在HCl和咪唑缓冲体系中镀铜镉粒的还原能力与体系温度的关系如图4所示。
到平衡所耗费的时间产生影响，温度越高，反应达到平衡所需的时间越短。我们选择25℃为反应温度。25℃与室温接近，因此易于控制，同时也有助于稳定试验条件，减少误差并提高试验精度。2.2 结果的换算曲线
根据化学反应原理，转化生成的N 2O的氮、氧同位素比值与溶液中NO 3-的氮、氧同位素比值应成线性关系。因此，可通过测定N 2O的氮、氧同位素比值再换算成NO 3-的氮、氧同位素比值。首先，需要建立不同同位素比值的NO 3-及其转化生成N 2O间的关系曲线，通过这个关系曲线去计算未知样品中NO 3-的氮、氧同位素比值。本文将国际标准物质USGS-34和USGS-32分别配置为NO 3-浓度20 μmol L -1的溶液A和B，并将A、B两种溶液按不同体积比例混合，从而形成不同丰度的硝酸盐溶液样品。其混合比例及溶液中NO 3-的丰度理论计算值如表1 所示。
将编号1-7的硝酸盐溶液进行转化并测定N 2
O
图4 不同体系温度时还原产率与还原时间的关系
Fig. 4 Relationship between yield and duration of the reaction
万事无忧4
relative to temperature of the system
由图4所示，体系温度对还原反应的平衡未表现出明显影响。体系处于不同温度时，还原产率均可达到近100%。不同的体系温度仅对还原反应达
表1 不同丰度硝酸盐溶液配比及氮、氧同位素比值理论值
Table 1 Theoretical values of nitrogen isotope ratios and oxygen isotope ratios of NO 3- in the solutions different in volume ratio
溶液编号No.体积比（VA ∶VB ）Volume ratio （VA ∶VB ）
理论计算值
Theoretical value
δ15NAir （‰）
δ18OSMOW （‰）
16∶0 -1.8-27.925∶1 28.5-19.034∶2 58.8-10.043∶3 89.1 -1.152∶4119.4 7.861∶5149.7 16.87
0∶6
180.0
25.7
的δ15N Air ‰和δ18O SMOW ‰。根据基本原理所述，在使用同一次制备的NaN 3—CH 3COOH溶液进行转化时，N 3-的氮同位素比值保持恒定，生成的N 2O的氮、氧同位素比值与硝酸盐的氮、氧同位素比值存在一定的相关性。将不同丰度NO 3-的氮、氧同位素比值与转化形成的N 2O的氮、氧同位素比值一一对应，得到NO 3- - N 2O换算曲线，其结果如图5和图6所示。将水样转化产生的N 2O的氮、氧同位素比值代入换算曲线中，利用换算曲线公式即可计算出样
品中NO 3-的氮、氧同位素比值。
由图5和图6可知，N 2O的氮、氧同位素比值与溶液中NO 3-的氮、氧同位素比值存在很好的线性相关性，其相关系数R 2均大于0.999。
N 2O 气体中的两个氮原子分别来自于N 3-和NO 2-，其δ15N Air 的换算曲线的理论斜率应为0.5。而实际换算曲线的斜率约为0.45，低于0.5。造成这种现象的原因可能与试剂中含有微量硝酸盐及试验用水中溶解的N 2O有关。而N 2O气体中的氧原子
计算机科学与探索来自于NO3-，其δ18O SMOW的换算曲线的理论斜率应为1，但实际上仅为0.88。这应是由溶液中NO2-与H2O分子间的氧交换反应造成的。McIlvin［12］的研究表明，在转化体系pH为4.5的情况下，溶液中仍存在11%～13%的氧交换反应，这与本文的试验结果相符。2.3 试验精度和准确度的测定
将USGS-35、IAE A-NO-3和实验室中已知氮、氧同位素比值的两个工作标准样品硝酸钾（ST-1、ST-2）配置成NO3--N浓度为20 μmol L-1溶液，并按此方法进行处理，得到的结果如表2 所示。
图5 N2O与硝酸盐的δ15N换算曲线
Fig. 5 δ15N conversion curve between N2O and NO3-
图6 N2O与硝酸盐的δ18O换算曲线Fig. 6 δ18O conversion curve between N2O and NO3-
表2 标准物质氮、氧同位素测定结果
Table 2Nitrogen isotope ratios and oxygen isotope ratios measured of the reference materials
标准样品编号Standard No.
δ15N Air‰δ18O SMOW‰
参考值
Reference value
（‰）
测定值
Measurement value
（‰）
参考值
磨合剂Reference value
（‰）
测定值
Measurement value
（‰）
USGS-35 2.7 2.93±0.31（n1）=6）57.557.53±0.58（n=6）2）IAEA-NO-3 4.7 4.49±0.34（n=6）25.625.70±0.51（n=6）ST-1 3.7 3.82±0.30（n=6）11.411.05±0.55（n=6）ST-214.614.68±0.29（n=6）24.524.45±0.54（n=6）
1）n为重复次数 The n was the number of repetitions
2）此结果通过将换算曲线外延计算得出 This result was calculated through extension of the curve
由表2看出，不同硝酸钾的同位素比值的测量结果重复性较好，δ15N的测量精度约为0.31‰，δ18O的测量精度约为0.55‰；参考值与标准物质证书参考值也很接近，测定值与参考值的差异均小于1σ，可满足分析的需求。
2.4 试验所需的最低样品量
本试验使用的同位素比值质谱仪的m/z44基线的信号强度约为1 nA，选择样品产生信号为3倍噪声时的浓度为该方法测定所需的最低样品量。通过试验可知，当溶液中NO3--N浓度为2.5 μmol L-1时，16 ml 溶液样品转化生成的N2O信号峰高为3 nA，即当16 ml 样品中含有约0.04 μmol NO3--N 时转化产生的N2O产生峰高约3nA的信号，如图7 所示。
将实验室标准ST-1和ST-2均配制为2.5 μmol L-1NO3--N溶液，并通过本方法测定其氮、氧同位素比值。其测量精度和准确度如表3所示，均可满足测试的要求。
2.5 试验的有效范围
为了进一步检验该方法的有效测量范围，本文
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王 曦等：化学转化法测定水体中硝酸盐的氮氧同位素比值
3期对不同浓度的ST-1标准溶液进行转化，并测定其还原产率及生成的N 2O的氮、氧同位素比值。还原产率如图8所示，当NO 3--N浓度在2.5～160 μmol L -1时，在本实验条件下，还原产率均接近100%，NO 3-浓度对还原产率影响不显著。
由ST-1标准样品转化得到的N 2O的氮、氧同位素比值为δ15N Air -4.66‰，δ18O SMOW +46.19‰。而不同浓度ST-1标准溶液氮同位素比值测定结果
如图9所示，当溶液中NO 3--N浓度由2.5μmol L -1上升至160 μmol L -1时，转化产生的N 2O的δ15N
Air
图7 最低样品量谱图
Fig. 7 Chromatogram of the sample minimum in weight
表3 最低样品量标准物质氮、氧同位素测定结果
Table 3 Nitrogen isotope ratios and oxygen isotope ratios measured of the reference materials with the sample minimum in weight
标准样编号Standard No.样品量Sample amount （µmol ）δ15N Air ‰
δ18O SMOW ‰
参考值Reference value
（‰）测定值Measurement value
（‰）
参考值Reference value
（‰）测定值Measurement value
（‰）
ST -10.04 3.7 3.85±0.77（n 1）=6）11.411.31±0.85（n=6）ST -2
0.04
14.6
14.51±0.82（n=6）
24.5
彭斯24.70±0.90（n=6）
1）n 为重复次数 The n was the number of repetitions
并不随N O 3-浓度改变而产生显著的差异。但对氧同位素而言，当溶液中NO 3--N浓度在2.5～20 μmol L -1时，N 2O的δ18O SMOW 基本一致，当溶液中NO 3--N浓度大于20 μmol L -1时，N 2O的δ18O SMOW 出现显著下降，如图9所示。这一结果表明，溶液中较高的NO 3--N浓度（>20 μmol L -1）会在一定程度上影响所测定的氧稳定同位素比值结果。这可能与较高浓度的样品需要更长的转化
时间才能达到反应平衡有关。因此，当样品中 NO 3--N浓度高于20 μmol L -1时，应将其稀释以减少试验误差。
2.6 不同来源样品的测定结果
本文应用此化学转化法分析了太湖苏州地区不同来源的水体样品，包括地表水、降水和土壤提取液。地表水的采样地点包括苏州地区主要河
中国早期政治制度的特点流、水库、湖泊等，同时采集地表水采样地点的
图8 不同浓度硝酸盐溶液的还原产率
Fig. 8 Yields of reduction relative to concentration of NO 3--N
图9 不同浓度硝酸盐溶液转化产生N 2O 的δ15N Air 、
δ18O SMOW
Fig. 9 δ15N Air and δ18O SMOW of N 2O generated from the
solution relative to concentration of NO 3-
N
