微生物有着一整套可塑性极强和极精确的代谢调节系统，以保证上千种酶能正确无误、有条不紊地进行极其复杂的新陈代谢反应。从细胞水平上来看，微生物的代谢调节能力要超过复杂的高等动植物。这是因为，微生物细胞的体积极小，而所处的环境条件却十分多变，每个细胞要在这样复杂的环境条件下求得生存和发展，就必须具备一整套发达的代谢调节系统。在长期进化过程中，微生物发展出一整套十分有效的代谢调节方式，巧妙地解决了这一矛盾。例如，在每种微生物的遗传因子上，虽然潜在着合成各种分解酶的能力，但是除了一部分是属于经常以较高浓度存在的组成酶（constitutiveen-zyme）外，大量的都是属于只有当其分解底物或有关诱导物存在时才合成的诱导酶（induceden-zyme或inducibleenzyme）。通过代谢调节微生物可最经济地利用其营养物，合成出能满足自己生长、繁殖所需要的一切中间代谢物，并做到既不缺乏也不剩余任何代谢物的高效“经济核算”。 微生物细胞的代谢调节方式很多，例如可调节营养物质透过细胞膜而进入细胞的能力，通过酶的定位以限制它与相应底物的接近，以及调节代谢流等。其中以调节代谢流的方式最为
重要，它包括两个方面，一是“粗调”，即调节酶的合成量，二是“细调”，即调节现成酶分子的催化活力，两者往往密切配合和协调，以达到最佳调节效果。
利用微生物代谢调控能力的自然缺损或通过人为方法获得突破代谢调控的变异菌株，可为发酵工业提供生产有关代谢产物的高产菌株。有关的实际例子将在本节后部分进行介绍。 在发酵工业中，控制微生物生理状态以达到高产的环境条件很多，如营养物类型和浓度，氧的供应，pH的调节和表面活性剂的存在等。这里要讨论的则是另一类方式，即如何控制微生物的正常代谢调节机制，使其累积更多为人们所需要的有用代谢产物。由于一些抗生素等次生代谢产物的代谢调控十分复杂且目前还不够清楚，因此，下面所举的例子都是一些小分子主流代谢产物。现分三方面来介绍。
（一）应用营养缺陷型菌株以解除正常的反馈调节
在直线式的合成途径中，营养缺陷型突变株只能累积中间代谢物而不能累积最终代谢物。但在分支代谢途径中，通过解除某种反馈调节，就可以使某一分支途径的末端产物得到累积。
1．赖氨酸发酵 如图6-62所示，在许多微生物中，可用天冬氨酸为原料，通过分支代谢途径合成出赖氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸。赖氨酸是一种重要的必需氨基酸，在食品、医药和畜牧业上需要量很大。但在代谢过程中，一方面由于赖氨酸对天冬氨酸激酶（AK）有反馈抑制作用，另一方面由于天冬氨酸除用于合成赖氨酸外，还要作为合成甲硫氨酸和苏氨酸的原料，因此，在正常的细胞内，就难以累积较高浓度的赖氨酸。
为了解除正常的代谢调节以获得赖氨酸的高产菌株，工业上选育了Corynebacteriumglutami-cum（谷氨酸棒杆菌）的高丝氨酸缺陷型菌株作为赖氨酸的发酵菌种。这个菌种由于不能合成高丝氨酸脱氢酶（HSDH），故不能合成高丝氨酸，也不能产生苏氨酸和甲硫氨酸，在补给适量高丝氨酸（或苏氨酸和甲硫氨酸）的条件下，在含有较高糖分和铵盐的培养基上，能产生大量的赖氨酸。
2．肌苷酸（IMP）的生产肌苷酸是重要的呈味核苷酸，它是嘌呤核苷酸生物合成过程中的一个中间代谢物。只有选育一个发生在IMP转化为AMP或GMP的几步反应中的营养缺陷型菌株，才可能累积IMP。C．glutamicum的IMP合成途径及其代谢调节机制可见图6-63。从图中可以看出，该菌的一个腺苷酸琥珀酸合成酶（酶12）缺失的腺嘌呤缺陷型，如果在其培养基中补充少量AMP就可正常生长并累积IMP。当然，假如补充量太大，反而会引起对酶2的反馈抑制。
（二）应用抗反馈调节的突变株解除反馈调节
抗反馈调节突变菌株，就是指一种对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性的组成型菌株，或兼而有之的菌株。在这类菌株中，因其反馈抑制或阻遏已解除，或是反馈抑制和阻遏已同时解除，所以能分泌大量的末端代谢产物。有关抗反馈调节菌株的特性和选育方法可见第七章第五节和第八章第二节。
例如，当把Corynebacteriumcrenatum（钝齿棒杆菌）培养在含苏氨酸和异亮氨酸的结构类似物AHV（α-氨基-β-羟基戊酸）的培养基上时，由于AHV可干扰该菌的高丝氨酸脱氢酶、苏氨酸脱氢酶以及二羧酸脱水酶，所以抑制了该菌的正常生长。如果采用诱变（如用亚硝基胍作为诱变剂）后所获得的抗AHV突变株进行发酵，就能分泌较多的苏氨酸和异亮氨酸。这是因为，该突变株的高丝氨酸脱氢酶或苏氨酸脱氢酶和二羧酸脱水酶的结构基因发生了突变，故不再受苏氨酸或异亮氨酸的反馈抑制，于是就有大量的苏氨酸和异亮氨酸的累积。如进一步再选育出甲硫氨酸缺陷型菌株，则其苏氨酸产量还可进一步提高，原因是甲硫氨酸合成途径上的两个反馈阻遏也被解除了（参看图6-52）。
（三）控制细胞膜的渗透性
微生物的细胞膜对于细胞内外物质的运输具有高度选择性。细胞内的代谢产物常常以很高
的浓度累积着，并自然地通过反馈阻遏限制了它们的进一步合成。采取生理学或遗传学方法，可以改变细胞膜的透性，使细胞内的代谢产物迅速渗漏到细胞外。这种解除末端产物反馈抑制作用的菌株，可以提高发酵产物的产量。
1．通过生理学手段控制细胞膜的渗透性 在谷氨酸发酵生产中，生物素的浓度对谷氨酸的累积有着明显的影响，只有把生物素的浓度控制在亚适量情况下，才能分泌出大量的谷氨酸（表6-11）。
生物素影响细胞膜渗透性的原因，是由于它是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅基，此酶可催化乙酰CoA的羧化并生成丙二酸单酰辅酶A，进而合成细胞膜磷脂的主要成分——脂肪酸。因此，控制生物素的含量就可以改变细胞膜的成分，进而改变膜的透性和影响谷氨酸的分泌。
当培养液内生物素含量很高时，只要添加适量的青霉素也有提高谷氨酸产量的效果。其原因是青霉素可抑制细菌细胞壁肽聚糖合成中转肽酶的活性（见本章第三节），结果引起其结构中肽桥间无法进行交联，造成细胞壁的缺损。这种细胞的细胞膜在细胞膨压的作用下，有利于代谢产物的外渗，并因此降低了谷氨酸的反馈抑制和提高了产量。
2．通过细胞膜缺损突变而控制其渗透性 应用谷氨酸产生菌的油酸缺陷型菌株，在限量添加油酸的培养基中，也能因细胞膜发生渗漏而提高谷氨酸的产量。这是因为油酸是一种含有一个双键的不饱和脂肪酸（十八碳烯酸），它是细菌细胞膜磷脂中的重要脂肪酸。油酸缺陷型突变株因其不能合成油酸而使细胞膜缺损。
另一种可以利用石油发酵产生谷氨酸的Corynebacteriumhydrocarbolastus（解烃棒杆菌）的甘油缺陷型突变株，由于缺乏a-磷酸甘油脱氢酶，故无法合成甘油和磷脂。其细胞
内的磷脂含量不到亲株含量的一半，但当供应适量甘油（200μg/ml）时，菌体即能合成大量谷氨酸（72g/L），且不受高浓度生物素或油酸的干扰。
纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，但绝大部分无法被充分利用。用纤维素酶把纤维素水解成葡萄糖，是现代酶工程中最令人鼓舞的新进展之一? 。把含纤维的自然资源及纤维废料加以充分利用，转化成糖类作为食品工业和发酵工业的原料或制成优质饲料，具有深远的现实意义。国内外科研工作者已先后筛选和培育了许多产纤维素酶的菌种，其中木霉属菌株产生的纤维素酶活力较高。由于其粗酶制剂中含有较高活力的C，酶和C 酶 ，因而成为当前生产上应用较多的菌种。但与淀粉酶和蛋白酶相比，其生产规模小，酶的活力也较低，酶解效率不高。当前的研究攻关主要集中以下两个方面：一是通过菌种筛选、基因克隆等手段来提高酶的产量和活力， 以降低产酶成本，改进酶的回收利用；二是改变天然纤维素酶的结构，以提高其对酶作用的敏感性 。笔者曾于2001年从福建香菇烂筒及其地下部土壤中分离到19株真菌，并于2002年对其进行摇瓶发酵，测定其酶活性，初步筛选到一株酶活比生产菌株康氏木霉更高的菌株c本文报道其筛选过程及初步试验结果。
1 材料与方法
1．1 供试菌株供试菌株系笔者2001年从福建香菇烂筒及其地下部土壤中分离获得到的19
株真菌，其代号分别为C真3、C放1、C放2、J1、E瓣、S4、H真6、E细J1白、K真2、I2、E细1、B放1、土木、C真l1、C放2l、N真1、E缈和M辨。以康氏木霉(菌株号为R，购自上海工业微生物所，福建农林大学食科学院食品微生物实验室保藏)为参比菌株。
1．2 培养基
1．2．1 斜面菌种谢尔宾斯基(母种)培养基选用马铃薯蔗糖琼脂培养基，简称PDA。
1．2．2 粗酶发酵培养基
按参考文献[4]略加修改： (NH4)2HPO4 2 g、ZnSO4 ·7H2 O 4.4mg、K2HPO4 0 2 g、M nSO4·4H2O 1．0 mg、KH2PO4 0．8 g、柠檬酸铁5 mg、CaCI：20 mg、酵母膏1．0 g、MgSO .7H2O 0.9 g、蛋白胨2 g、维生素B1100 、水1000ml、稻草粉3 g。每个500ml三角瓶分装上述培养液150 ml，121 c【=灭菌30分钟。1．3 粗酶液的制备将各菌株的试管菌种(PDA母种)接入100 ml无菌水中摇匀，按6％ 接入粗酶发酵液体培养基中，置摇床振荡培养7天(29~C、160转／分钟)，然后用滤纸过滤，得粗酶滤液(待测液)。
1．4 滤纸酶活的测定按参考文献[5]，酶活力以540 nm的吸光度(A)表示。
1．5 CMC酶活的测定按参考文献[6]，酶活力以540 nm的吸光度(A)表示。
1．6 B一葡萄糖苷酶活的测定按参考文献[6]，酶活力以540 nm的吸光度(A)表示。
1．7 滤纸崩溃的测定取15 mm×150 mm试管1支，加入醋酸缓冲液1 ml，粗酶液4 ml及天府热线1cm×3 cm新华滤纸一张，摇匀，使滤纸全部浸入溶液中，然后将试管置于40℃恒温水浴中保温2小时，取出观察滤纸崩溃情况，结果以“+” 的多少表示滤纸崩溃程度 J。
2 结果与分析
2．1 19个供试菌株与对比菌株R的滤纸酶活比较分别测定19个菌株发酵液的滤纸酶活，结果显示，它们的吸光度(A值)分别为：c龇0．032、I：楼宇智能化论文0．039、l自0宝石岛．032、K真2 0．030、E细31 0．030、E细1 0．028、C真30．034、C放1 0．023、B放1 0．022、N真1 0．022、M细40．022、E娜0．021、土木0．020、H宴6 0．020、R0．019、渔港之夜E雏0．016、S4 0．016、C翼11 0．016、C鲫0．西部矿山012、J，0．011，CK (空白，对照)为0．010。结果说明，C真3、E细 Jl白、K真2、I2、E细1、C放2具有较高的滤纸酶活，可参加下一步的复选试验。
2．2 7个菌株纤维素酶的活性比较 已知纤维素酶的作用方式：C。酶是使天然纤维素晶体分链，起一个分离和水合作用，从而使天然纤维素裂解成为直链纤维素；而c 酶虽不能水解天然纤维素，但能水解直链纤维素的13一l，4一葡萄糖苷键生成纤维二糖，纤维二糖再经13一葡萄糖苷酶水解成为葡萄糖。前人研究认为，纤维素的降解关键是滤纸酶活的高低，
再结合13一葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作参考 。为此，挑选上述试验中滤纸酶活性较高的7个菌株进行进一步试验，主要测定其滤纸酶活、CMC酶活和13一葡萄糖苷酶活。各菌株均设3个处理，取其平均值(表1)。
结果显示，滤纸酶活：Cl3：I2>Jl白>E细l>Eml>K真2：Cm；CMC酶活：Cl3>E细3l>I2>K真2>Cm >E细I>Jl白；13一葡萄糖苷酶活：Jl白>K真2>cl3>Cm >Eml>I2>E细I。综合上述结果，可选出c真3、Jm和I2三个较高产酶菌株。
2．3 3个较高产酶菌株与参试对比菌株R的酶活性比较对上述试验选出的3个菌株和参试对比菌株R(康氏木霉)所产生的纤维素酶，分别进行滤纸崩溃测定和CMC酶活、13一葡萄糖苷酶测定。各菌株均设3个处理，取其平均值(表2)。从表2可以看出，滤纸崩溃能力以cl3最高，其CMC酶活与参试对比菌株相似，但13一葡萄糖苷酶活稍小于康氏木霉。综合上述测定结果与前人经验 ，可初步筛选出一株产纤维酶活比生产菌株康氏木霉更高的菌株c ，建议进行进一步试验。
2．4 优化条件下Cl3菌株的纤维素酶活性经初步优化试验，发现30~C、摇瓶时间7天、pH 5．5时，Cl3的酶活较高。为此，进行了一次验证试验。试验结果(表3)表明，在以上优化条件下，Cl3菌株产生的纤维素酶的活性有较大的提高。建议对cl3进行进一步的优化试验，
以探明最适的产纤维素酶条件，提高其酶活。
3 小结与讨论
3．1 通过对19个菌株发酵液的滤纸酶活、CMC酶活、13一葡萄糖苷酶活进行测定，初步筛选出产纤维素酶活力较高的cl3菌株。初步试验表明，在30~C、摇瓶时间7天、pH 5．5时，cl3菌株产生的纤维素酶的活性有较大提高。建议对Cl3进行进一步的优化试验，以探明其最适的产酶条件，或对其进行进一步的诱变，以提高其酶活性应用于生产实践。
3．2 本试验条件下，纤维素酶的活性测定可能存在一定的误差。造成误差的原因是多方面的，滤纸的物理结构、试验的重复次数以及分光光度计的稳定性等均有影响。据有关资料分析，酶活测定的重复次数达10次时，误差一般不超过10％ 。此外，由于试验时仅考虑进行对比筛选，没有同时测定葡萄糖浓度标准曲线，这也是本研究的不足。在以后的试验中，应进一步改进。
