王卫国;胡晓伟
【摘 要】Grape wine is rich in nutritional and health care contents and has a set of health care function such as anti-cardiovascular and cere-brovascular disease,anti-oxidative,anti-bacterial and anti-cancer,sleeping-enhance,etc.The compounds of polyphenols from grapes wine were broadly respected as they possess strong antioxidant,anti-bacterial and anti-cardiovascular capacity.But the polyphenol oxidase destroyed the antioxidant capacity ofpolyphenols,so the nutritional and health effects of wine greatly reduced.The deep research for polyphenols and polyphenol oxidases in wine not only helps the research,development and production of grape wine,but also supplies with references for the research of the science of food,medicine and fruits wine.The health effects of wine and the variety,origin,preparation method,determining method of enzymatic activity and influencing factors of enzymatic activities in wine were summarized,aiming to provide a reference for the stable production and quality-improving of wine.%葡萄酒富含多种营养与
保健成分,具有预防心脑血管疾病、抗氧化、抗菌、抗癌、助眠等保健功效,葡萄酒中多酚类物质因具有极强的抗氧化、抗菌与预防心脑血管疾病等生理药理活性而倍受人们推崇,但多酚氧化酶会氧化破坏葡萄酒中的多酚,不仅会使葡萄酒变变质变味,还会使其营养和保健价值明显降低.对葡萄酒中的多酚以及多酚氧化酶进行深入研究不仅有利于优质葡萄酒的研发与生产,还将为相关食品药品与果酒科学的研究提供借鉴.该文主要对目前国内外对葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的种类、制备方法、酶活测定方法、酶活的影响因素等内容的研究现状进行了概述,并对有待加强的研发内容及其前景进行了展望.
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2017(036)008
【总页数】4页(P16-19)
【关键词】葡萄酒;多酚;多酚氧化酶;研究现状;展望
【作 者】王卫国;胡晓伟
混合交换【作者单位】河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001;河南工业大学生物工程学院,河南郑州450001门萨邦苏
【正文语种】中 文
【中图分类】TS262.61
葡萄酒含有大量对人体有益成分，且富含具有抗氧化等作用的多酚类物质。但葡萄酒中多酚氧化酶的存在，严重破坏了葡萄酒中的多酚，这样不仅使葡萄酒中的多酚类物质含量大幅度降低，还会使葡萄酒变变质变味，不仅使其营养和保健价值明显降低，甚至使其丧失商品性。因此，葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的深入研究不仅对葡萄酒的研发生产及其保健功效的推广应用具有重要意义，还将为相关食品药品与果酒科学的研究提供借鉴。本文主要对目前国内外葡萄酒中多酚及多酚氧化酶的种类、制备方法、酶活测定方法、酶活的影响因素等内容的研究现状进行了概述，并对有待加强的研发内容及其前景进行了展望。
多酚类化合物是含有多个酚性羟基和芳香族基团的一类物质[1]，自然界中有超过6 500种的多酚或酚类化合物及其衍生物，存在于植物果实或果蔬中的多酚，是人类每天从食物中
摄入的抗氧化物质中数量最多的一类[2]。多酚类化合物不但具有优良的抗氧化功能，还具有强化血管壁弹性、促进肠胃消化、降血脂、提高人体免疫力、预防动脉硬化以及血栓形成的作用，同时也能抑制细菌与癌细胞生长[3-4]。研究发现，葡萄酒中含有超过50种多酚化合物，是葡萄酒中种类最多的抗氧化物质，包括单宁、原花青素、花青素、白藜芦醇等[5-8]。由于葡萄酒多酚化合物所包含的化合物类型比较多，不是单一成分，所以它所发挥的作用自然高于单一成分的功效[9]。上述几大类葡萄酒中的多酚类物质的研发现状概述如下。
1.1 单宁
单宁又名单宁酸，在药典上又被称为鞣质或鞣酸，是由一些非常活跃的基本分子通过缩合或聚合作用形成的一类复杂高分子多元酚类化合物。1962年，单宁被定义为能够沉淀生物碱、明胶及其他蛋白质，分子质量为500～3000Da的水溶性多酚化合物[10]。根据单宁化学结构的不同，可将葡萄酒中的单宁分为水解单宁和缩合单宁[11-12]。常温下单宁为淡黄至浅棕粉末，有特殊气味，味极涩，溶于水、丙酮、乙醇，不溶于乙醚和氯仿。容易吸潮，在空气中易氧化使其颜加深，本身毒性很低[13]。单宁的各种性质，包括自由基
清除能力和蛋白质结合能力等，主要取决于其化学结构特征，尤其是聚合度大小[14]。虽然人们对单宁的认识和研究已有较长时间，商业上亦常宣传葡萄酒中的单宁对于健康的重要性，但由于人们对其研究不够深入，尚缺乏强有力的理论支撑，所以，其用途目前还是以工业应用居多，作为多羟基化合物的天然单宁的在健康领域的研发应用有待加强。
1.2 花苷
花苷又名花青素，广义的花苷还包括原花青素，存在于植物根、茎、叶、花等器官细胞，以糖苷形式存在于液泡中，从而使植物呈现出不同彩[15]。花苷是花青素的糖苷，葡萄酒在发酵、陈酿和处理过程中会形成多种花苷类衍生物。
花苷是葡萄酒呈现颜的物质基础，不仅对葡萄酒的颜呈现起重要作用[17-19]，还对葡萄酒的品质具有重要影响，其存在形态及含量高低会直接影响葡萄酒的度、调及稳定性，还有口感等。在酸性环境中，B环上的取代基对花苷的颜具有影响。不同取代基所发生的颜变化不同，如增加羟基使其颜变红，增加甲氧基使其颜变成紫而且稳定性增强。由于糖苷化以及酰化反应，使花苷的颜变红。另外，葡萄酒中的酚类、类黄酮等多酚物质也会和花苷形成氢键，发挥辅素作用，使葡萄酒颜呈现蓝紫
调[20]。虽然人们已认识到花苷对葡萄酒的颜呈现和品质具有重要影响，并认识到环境因子如温度、光照、氧气和多酚氧化酶等对酒酒质影响很大，但花苷的稳定性机制及花苷与多酚氧化酶的相互作用研究还较少开展，葡萄酒中花苷的生理药理功能尚未深入研究致使其应用范围受限，鉴于素类药物如维生素B2、维生素B12等对人类健康的重要性，可以相信，花苷的深入研究定有广阔的前景。
1.3 白藜芦醇模糊神经网络
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物[21-23]，有顺式白藜芦醇和反式白藜芦醇两种结构，红葡萄酒中主要以反式白藜芦醇为主，顺式异构体在葡萄提取物中未检测到，可能在发酵期间被合成。葡萄酒中白藜芦醇受葡萄品种、生长环境和葡萄酒酿造工艺以及葡萄被微生物感染程度等因素影响。白藜芦醇主要存在于葡萄皮中，所以葡萄酒发酵时间长短以及浸皮效果的好坏是决定其白藜芦醇含量高低的重要因素。
流行病学调查发现，饮用葡萄酒可以有效减少心脑血管疾病的发生率，后来发现这一功效主要归功于白藜芦醇，因为白藜芦醇可以有效地抑制血小板聚集和低密度脂蛋白形成，调节脂蛋白代谢，降低人体血脂，防止血栓形成。白藜芦醇在人体生理过程中具有很强的抗KINGXCON
playsc氧化和抗自由基能力，能够抑制多种氧化酶活性[24-26]，在癌细胞的起始、增殖、发展3个主要阶段均有抑制乃至逆转作用[27]。此外，白藜芦醇及其衍生物还具有护肝、抗炎及激活长寿基因等作用。虽然人们对白藜芦醇的研究报道较多且已相当深入，但对其药理功能还需开展更为广泛深入的研究，希望在不远的将来其对疾病防治的功能能得到国家官方食品与药物管理局（food and drug adm inistration，FDA）的认可，有几个药品级的产品投放市场，真正为人类的健康事业做出应有的贡献。
2.1 葡萄酒中多酚氧化酶的类型
多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）是动植物和微生物中普遍存在的一类含铜离子蛋白酶。早在1883年，日本学者YOSHID A[28]发现漆树液汁变硬，猜测这种现象可能是由某种活性物质导致；1938年，KEILIN D等[29]利用蘑菇提取纯化出一种酶，并将其命名为多酚氧化酶。多酚氧化酶存在广泛，是引起许多农产品及其副产品褐变甚至变质的一种酶。
多酚氧化酶在氧参与的情况下能够把邻苯二酚氧化成对应的邻苯醌，邻苯醌会进一步发生反应形成黑褐物质。这种褐变不仅会使葡萄酒变，还会直接或间接破坏葡萄酒中的营
养物质，使葡萄酒的品质发生变化。王月晖等[30]分析了27种酿酒红葡萄品种中多酚氧化酶的酶活、总酚以及褐变之间关系，发现不同酿酒红葡萄品种中多酚氧化酶的酶活力、总酚含量及褐变度之间存在显著性差异，多酚氧化酶的活力与多酚含量之间无显著相关性，但与褐变呈正相关。李青青等[31]测定了葡萄酒酿造过程中多酚氧化酶的酶活变化、失活温度、葡萄酒的pH值、游离SO2、总SO2变化，结果发现葡萄酒的pH值变化不大、而游离SO2是影响多酚氧化酶活性的主要原因，pH值在一定范围内对多酚氧化酶活性的影响很小。葡萄酒中主要存在两种多酚氧化酶，一种是酪氨酸酶，另一种是漆酶[32]。
酪氨酸酶，又被称为儿茶酚酶，是葡萄果实中存在的一种正常酶类。研究发现，刚结果时，多酚氧化酶的酶活非常高，被榨成葡萄汁后，一部分酪氨酸酶发生反应，剩余酪氨酸酶依旧在果汁中，但酪氨酸酶活性相比之前提高很多，笔者认为，这种现象可能是与氧气接触更多的缘故。当酿制葡萄酒时，随着对葡萄醪液的不断处理，酪氨酸酶活性逐渐下降。酪氨酸酶在pH 3～5时活性最强，pH 7时最稳定；酶活在30℃时最高，55℃条件下对其加热30m in，就可以使酪氨酸酶失活一大部分。所以，酪氨酸酶的存在对葡萄酒的稳定性影响很大。
漆酶并不是葡萄果实中本身存在的一种酶，是由灰霉菌所分泌的酶类。漆酶存在于一些受到灰霉菌危害的葡萄果实之中。漆酶能够轻而易举的溶于葡萄汁液中，相比酪氨酸酶，漆酶的危害更大，它能对多种多酚类物质产生作用。漆酶在pH 3～5时酶活最大，最适温度为40～45℃。但是经加热处理，漆酶就会很快失去活性。因此，在葡萄酒酿造的任何一个阶段都必须对漆酶进行防治，常用防治方法有通入二氧化硫和加热等，但笔者认为，更主要更主动的防治方法是在葡萄种植以及葡萄酒的酿造与储藏过程中防治灰霉菌的感染。
2.2 多酚氧化酶的酶活测定方法
多酚氧化酶活性测定的方法主要有检压法、氧电极法、比法以及碘量滴定法等。检压法是多酚氧化酶酶活特性研究最常用的一种方法，其原理是在有氧条件下，儿茶酚等底物与多酚氧化酶发生氧化还原反应。在一定时间内，酶催化底物发生氧化还原的反应速率与氧气消耗量呈线性关系，根据瓦氏呼吸仪测定一段时间内氧气消耗率，进而计算多酚氧化酶酶活。检压法虽然测得的多酚氧化酶酶活比较准确，但此方法存在操作繁琐和耗时长的缺陷。分光光度法于1974年被人们广泛采用，其原理是通过测量单位时间内儿茶素被多酚氧化酶氧化产生的有产物的光密度或吸光度值的变化量来计算多酚氧化酶的酶活。后来由
于技术原因，改用邻苯二酚作为底物替换儿茶素。分光光度法测定多酚氧化酶活性的特点是操作简单、重复性好，但受仪器设备限制，对吸光度值变化较小或光密度过高的样品，分光光度法无法准确测定。除上述两种方法之外，还有一种灵敏度较高，准确性较好的氧电极法也常被用来测定多酚氧化酶活性。随着研究的深入，越来越多的测定多酚氧化酶酶活的方法被报道，如极谱电极法、碘量滴定法等[33-34]。
2.3 多酚氧化酶的分离提取与纯化园林古建筑
通常根据多酚氧化酶存在的材料种类来选择分离提取方法，材料性质的差异决定了多酚氧化酶的分离提取方法的不同，丙酮法和匀浆浸提法是常用的两种提取多酚氧化酶的方法。丙酮法操作简单，且提取出的多酚氧化酶体积较小，便于研究和贮存，但由于丙酮容易使蛋白质发生变性，所以丙酮法提取的酶活普遍较低。匀浆浸提法除了能除去提取物中杂蛋白之外，还能最大限度地保存多酚氧化酶的酶活[35]。其实，将匀浆法和丙酮法结合使用应是一种更好的多酚氧化酶的提取方法。
