李林株;郭灵敏;杜佩铭;黄尚书
【摘 要】目的 探讨肝细胞肝癌组织标本中FUCA1的表达,分析其与临床病理参数及预后的关系.方法 采用Western Blot和qRT-PC技术对72例肝癌患者癌组织与癌旁的FUCA1表达水平进行检测,结合临床病理资料、随访数据,采用Kaplan-Meier和Log-rank进行预后分析,Cox回归进行危险因素的单、多因素分析.结果 FUCA1在肝癌组织学标本中较癌旁组织呈低表达,肝癌组织中FUCA1蛋白低表达与肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶有关(P＜0.05).Kaplan-Meier生存分析和Log-rank检验指出:肝细胞肝癌中FUCA1高表达组患者比低表达组的总体生存率和无瘤生存率明显提高,差异具有显著性(P＜0.05).Cox回归预后分析发现:FUCA1表达量、肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶以及TNM分期为评价肝癌患者预后的独立因素.结论 FUCA1在肝癌组织中的表达水平比癌旁组织明显降低,与肝癌的肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶呈负相关且是独立的预后因子.FUCA1表达与肝癌预后联系紧密. 【期刊名称】《实用医学杂志》
【年(卷),期】2018(034)011
【总页数】4页(P1800-1803)
【关键词】肝癌;FUCA1;肿瘤侵袭转移;生存分析;预后
【作 者】李林株;郭灵敏;杜佩铭;黄尚书
【作者单位】广东省佛山市高明区人民医院 广东佛山528500;广东省佛山市高明区人民医院 广东佛山528500;广东省佛山市高明区人民医院 广东佛山528500;广东省佛山市高明区人民医院 广东佛山528500
【正文语种】中 文
肝细胞性肝癌（简称肝癌）在世界上肿瘤发病率中排名第五［1］，每年新发病例约100万，也是我国常见的恶性程度最高的肿瘤之一［2］。肝癌的预后不良主要是因为缺乏有效的方法以及进行根治性切除后仍然有较高的复发率［3-5］。目前肝癌的具体发病机制仍不明确。因此，对肝癌发病因素的深入探索和新的方法的研究具有重要意义。
FUCA1是糖基水解酶29蛋白家族中的一员［6］，它参与糖蛋白、糖脂等生物活性的大分
子的分解代谢反应，并广泛分布于人体的组织细胞、血液和体液中［7］。已有研究表明FUCA1的突变会导致代谢异常进而引起岩藻糖苷贮积症，但其与癌症的关系还不是很明确［8-10］。本研究选择可手术肝癌患者为研究对象，探讨FUCA1的表达与临床病理参数及预后的关系，考察其作为临床侵袭及预后的预测指标的可能性。
1 对象与方法
1.1 研究对象 所有标本均为广东省佛山市高明区人民医院普通外科2011年7月至2016年12月具有完整随访资料的原发性肝细胞肝癌患者72例。所有患者均知情同意，开展实验已获得伦理委员会批准。
1.2 主要试剂和仪器 总RNA提取试剂盒（OME⁃GA，美国）；qRT⁃PCR反转录试剂盒（RR047A，Ta⁃KaRa，大连）；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒（RR820A，TaKaRa，大连）；FUCA1抗体和GAPDH抗体（Abcam，美国）。
1.3 Western blot检测FUCA1蛋白表达 通过蛋白裂解法收集肝癌组织和癌旁组织蛋白，使用BCA法确保各孔上样量相等，进行垂直电泳，转膜，TBS漂洗，封闭液封闭2 h。加入稀
释的兔抗人FUCA1和GAPDH单克隆抗体，4℃孵育过夜，TBST洗涤后加入二抗，在室温下1 h后，再TBST洗涤，暗室内发光显影。
1.4 总RNA的提取和cDNA的合成 根据OMGA公司提供的总RNA提取试剂盒使用离心柱法提取72例癌与癌旁组织的总RNA。检测RNA溶液的浓度和纯度A260/A280介于1.8～2.1即可用于逆转录成cDNA。使用2%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA完整性。将模板RNA按照TakaRa公司qRT⁃PCR反转录试剂盒说明配置为20 μL体系，进行逆转录为cDNA。
1.5 qRT⁃PCR测定FUCA1在癌症标本中mRNA表达 使用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，以β⁃actin为内参对照，反应体系为20 μL，根据试剂盒说明配置。FUCA1引物序列为：上游：5′⁃GAAGC⁃CAAGTTCGGGGTGTT⁃3′，下游：5′⁃GGGTAGTTGT⁃CGCGCATGA⁃3′。β⁃actin 引物序列为：上游：5′⁃AGAGCCTCGCCTTTGCCCATCC⁃3′，下游：5′⁃ATA⁃CACCCGCTGCTCCGGGTC⁃3′。
用ABI 7500荧光PCR仪测定FUCA1的mRNA表达水平。实验结果以β⁃actin 为内参，使用 2⁃ΔΔCt计算CT值［11］。实验重复3次。
1.6 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。使用Student t、χ2检验进行数据分析，Kaplan⁃Meier计算生存曲线，以Log⁃rank进行检验，使用Cox回归进行单、多因素分析。所有统计采用双侧概率检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 FUCA1在肝癌组织学标本中高表达 通过Western blot和qRT⁃PCR实验结果，发现FUCA1在72例肝癌组织中表达明显低于对应癌旁组织（图1～3）。
图1 FUCA1在HCC患者癌与癌旁组织的蛋白水平表达Fig.1 The FUCA1 protein expression in HCC tumor and adjacent normal tissues注：T，肝癌组织；N，癌旁组织
图2 72例肝癌组织与对应癌旁组织中FUCA1蛋白表达量Fig.2 The FUCA1 protein expression in HCC tumor and adjacent normal tissues in 72 pateints注：**P＜0.05
图3 72例肝癌组织与对应癌旁组织中FUCA1 mRNA表达量Fig.3 The FUCA1 mRNA expression in HCC tumor and adjacent normal tissues in 72 pateints注：**P＜0.05
2.2 FUCA1与肝癌的进展密切相关 通过分析72例患者的病历资料和后期随访资料，联系所取标本FUCA1的表达量发现：FUCA1与肝癌的肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶相关（P＜0.05，表1）。这表明FUCA1的低表达与肝癌的侵袭性和转移有关。进而通过免疫组化（IHC）染，将72例临床患者组织根据FUCA1的表达量分为两组：18例为高表达组，54例为低表达组。每张IHC染图片的染强度和阳性细胞百分比由3位病理学家双盲评分。染强度被评为：0（阴性）、1（阳性）、2（强阳性）；阳性细胞百分比评分为：0（0%）、1（1% ～25%）、2（26% ～ 50%）、3（51% ～ 75%）、4（76% ～100%）。所得两组分数相乘即为总分（范围为0～8），定义小于4分为FUCA1低表达组，高于4分为FUCA1高表达组。通过Kaplan⁃Meier生存分析，结果表明FUCA1低表达组的总体生存率和无瘤生存率明显高于FUCA1高表达组（P ＜0.05，图4、5）。其次，通过Cox回归分析发现：FUCA1表达量、肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶以及TNM分期为评价肝癌患者预后的独立因素（P＜0.05，表2、3）。
3 讨论
癌症的侵袭和转移是肝癌患者失败和预后不良的主要原因，肝癌的进展是一个复杂的
包括细胞蛋白水解、癌症细胞的运动，以及新血管生成的过程［12-14］。因此研究影响肝细胞癌预后的因素对临床上肝癌具有重要意义。
近年来有证据指出随着结肠癌的恶化，FU⁃CA1的表达逐渐减少［15］，提示FUCA1可能在结肠癌中表现为抑癌基因的功能。然而FUCA1在肝癌中的表达和其与肝癌的预后关系还不得而知。本研究发现FUCA1相对于肝癌组织，在癌旁组织的蛋白和mRNA的表达量明显增高。FUCA1的表达与肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶密切相关。Kaplan Meier生存分析显示，相对于高表达，FUCA1低表达的肝癌患者总体生存率和无瘤生存率均明显下降，说明FUCA1表达下调是不良的预后因子。同时，Cox回归多因素分析提示，FUCA1表达、肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶以及TNM分期为评价肝癌患者预后的独立因素。因此，在肝癌中，FUCA1的表达水平与肿瘤大小、血管侵袭、卫星灶以及TNM分期一样，可作为潜在的预后因子。
本研究发现单因素分析中肿瘤大小对应总体生存率和无瘤生存率差异无统计学意义，但是在多因素回归分析中肿瘤大小是评价患者预后的主要独立因素之一。推测肿瘤大小可能与其他危险因素具有一定的协同作用从而导致此类情况或存在病例选择偏倚有关。
图4 FUCA1表达与总体生存率Fig.4 The expression of FUCA1 and the overall survival
表1 FUCA1表达水平与肝癌临床病理指标间的关系Tab.1 Correlation between the expression of FUCA1 in 72 HCC tissues and their clinicopathological characteristics 例指标 例数FUCA1表达量低表达 高表达 χ2值P值年龄（年）＞50≤50性别33 39 26 28 70.4660.590 11男 女52 20 39 15 130.0001.000 AFP（ng/mL）＞400≤400 HBsAg 33 39 26 28 5 8 1 0.0741.000+-32 40 23 31 0.3000.597肝硬化+-33 39 26 28 0 99 7 1 0.4660.590肝功能Child⁃Pugh class B Child⁃Pugh class A肿瘤大小（cm）＞5≤5卫星灶16 56 15 39 1 1 1 7 3.8570.056 30 42 15 39 1517.143＜0.001+-45 27 39 15 3 6 1 8.7110.005血管侵犯+-34 38 30 24 2 4 1 4 6.0190.016 TNM分期Ⅰ/ⅡⅢ/Ⅳ56 16 40 14 16 2 1.7140.326
图5 FUCA1表达与无瘤生存率Fig.5 The expression of FUCA1 and the disease free survival
表2 肝细胞肝癌临床病理指标单因素生存分析Tab.2 Univariate survival analysis of OS and DFS in 72 patients with HCC指标年龄（年）性别AFP（ng/mL）HBsAg肝硬化肝功能肿瘤
大小（cm）卫星灶血管侵袭TNM分期FUCA1表达水平总体生存HR 1.117 0.596 0.767 0.840 1.127 1.236 0.704 2.656 2.388 3.634 2.512 95%CI 0.659～1.895 0.336～1.058 0.450～1.308 0.495～1.423 0.667～1.905 0.674～2.267 0.407～1.216 1.449～4.870 1.398～4.079 1.987～6.645 1.261～5.007 P值0.681 0.077 0.330 0.516 0.656 0.494 0.208 0.002 0.001＜0.001 0.009无瘤生存HR 1.251 0.530 0.759 0.884 1.071 1.123 0.652 2.590 2.562 3.946 2.359 95%CI 0.742～2.108 0.301～0.932 0.447～1.288 0.524～1.490 0.636～1.804 0.603～2.091 0.378～1.125 1.431～4.685 1.507～4.354 2.145～7.257 1.214～4.586 P值0.400 0.027 0.307 0.643 0.796 0.715 0.124 0.002 0.001＜0.001 0.011
表3 肝细胞肝癌临床病理指标多因素生存分析Tab.3 Variate survival analysis of OS and DFS in 72 patients with HCC指标FUCA1表达水平肿瘤大小（cm）卫星灶血管侵袭TNM分期总体生存HR 2.501 2.165 1.991 1.998 2.431 95%CI 1.121～5.581 1.038～4.417 1.010～3.925 1.034～3.859 1.264～4.676 P值0.025 0.039 0.047 0.039 0.008无瘤生存HR 2.198 1.937 1.908 2.135 2.661 95%CI 1.010～4.786 0.930～4.033 0.972～3.744 1.126～4.051 1.384～5.115 P值0.047 0.077 0.060 0.020 0.003
