去甲基化酶TET2在套细胞淋巴瘤中的表达及其作用机制 刘小柳;雷坚;邹立新;彭浪
【摘 要】目的:探讨去甲基化酶TET2 mRNA在套细胞淋巴瘤(MCL)中的表达及其作用机制.方法:实时定量PCR检测TET2 mRNA表达,免疫比法检测DNA中5-hmC水平,甲基化特异性PCR检测p15基因甲基化水平,并分析它们间的相互关系.结果:MCL患者TET2 mRNA表达水平及5-hmC含量均低于正常对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),TET2 mRNA水平与5-hmC含量呈正相关;MCL中p15基因甲基化率(5/20)高于对照组(0/10);MCL患者中,与p15未甲基化组比较,p15甲基化组的TET2 mRNA表达水平更低、5-hmC含量更低(P＜0.05).结论:TET2可能通过调节5-hmC生成,从而改变p15基因的甲基化态势,影响MCL的发生发展. 【期刊名称】《华夏医学》
【年(卷),期】2017(030)001
【总页数】4页(P19-22)
【关键词】套细胞淋巴瘤;TET2;5-羟甲基化胞嘧啶;p15;甲基化
【作 者】刘小柳;雷坚;邹立新;彭浪
【作者单位】长沙市第四医院血液肿瘤科,湖南长沙,410006;湖南省肿瘤医院病理科,湖南长沙,410013;长沙市第四医院血液肿瘤科,湖南长沙,410006;长沙市第四医院血液肿瘤科,湖南长沙,410006
【正文语种】中 文
【中图分类】R733
套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma, MCL)属于非霍奇金淋巴瘤中B细胞亚类中的一种，以Cyclin D1过度表达为其分子遗传学特征[1]。作为一种侵袭性高、早期发现困难的淋巴瘤，MCL相关的分子病理机制仍不明确。DNA甲基化作为重要的表观遗传学机制之一，通过改变染质结构和基因转录活性在造血系统生理及病理中发挥重要作用[2]。Leshchenko等[3]采用HELP技术比较MCL患者与正常人的基因组甲基化状态，发现MCL中CDKN2B、MLF-1、PCDH8和HOXD8高甲基化，CD37、HDAC1、NOTCH1和CDK5低甲基化，提示MCL存在基因甲基化异常。哺乳动物TET蛋白家族具有使5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5-mC)羟基化为5-羟甲基化胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5-hmC)的功能，而5-hmC有潜在去甲基化作用[4]。作为1种新的表观遗传学标志，继5-mC后，5-hmC被称为“第6种核苷酸”，并推动了人类基因组中去甲基化作用的研究。Barbara等[5]对102例MCL患者进行测序，发现TET2在4%患者中发生突变。但TET2及5-hmC在MCL中的作用，国内尚未见相关文献报道。笔者采用实时定量PCR法检测TET2在MCL中的表达，免疫检测DNA中5-hmC含量，并探讨其与p15基因甲基化的关系，为MCL发生、发展的分子病理机制提供数据支撑。 1.1 一般资料
本研究收集2014年1月至2016年12月经湖南省肿瘤医院及长沙市第四医院确诊的初治MCL外周血标本共20例作为研究对象。所有入组病例均经组织病理学及免疫组织化学、骨髓或外周血免疫表型确诊。另选10例正常人外周血标本作为对照。抽取各研究对象外周血3 ml，密度梯度离心法(Ficol1)分离外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)备用。
1.2 主要试剂
荧光定量SYBR qPCR Mix (QPS-201，日本TOYOBO公司)；基因组DNA提取试剂盒 (DP-304，北京天根生物科技有限公司)；羟甲基化DNA定量试剂盒 (免疫比法) MethylFlashTM Hydroxymethylated DNA Quantification Kit (P-1036，美国Epigentek公司)；SssI甲基转移酶(美国New England Biolabs公司)；DNA甲基化硫化修饰试剂盒 (EZ DNA Methylation-Gold KitTM)(ZYMO RESEARCH公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 实时定量PCR 利用TRIzol试剂提取总RNA，取等量RNA按照 first strand cDNA synthesis Kit说明，进行逆转录获得cDNA。取 1 μl cDNA作为模板，按照SYBR qPCR Mix说明书构建PCR反应体系。人TET2及内参GAPDH引物如下：TET2，sense 5′-CCCACAGAGACTTGCACAACAT-3′，antisense 5′- CTGGCTCTGCTAACATCCTGAC-3′；GAPDH，sense 5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，antisense 5′- GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3′。每样品重复3孔，置于 Real-time PCR仪进行实时定量检测。采用双标准曲线法计算TET2 mRNA的相对表达水平，以溶解曲线证实扩增的特异性。
1.3.2 5-hmC含量测定 采用基因组DNA提取试剂盒提取各研究对象基因组DNA。羟甲基化DNA定量试剂盒(免疫比法)由美国Epigentek公司提供，按说明书进行5-hmC检测。每个样本重复3次。首先通过建立OD值与阳性对照HC5量的标准曲线，运用Microsoft Excel线性回归计算标准曲线的斜率(OD/ng)，运用以下公式计算：5-hmC(ng)=(样本OD-HC4阴性对照OD)/(斜率×5)；5-hmC(%)= 5-hmC(ng)/ 样本DNA的量(ng)×100%。
1.3.3 甲基化特异性PCR(MSP) 使用EZ DNA甲基化试剂盒进行DNA的重亚硫酸盐修饰。PCR引物由上海生物工程有限公司合成。p15非甲基化引物[6]：sense 5′- TGTGATGTGTTTGTATTTTGTGGTT -3′，antisense 5′- CCATACAATAACCAAACAACCAA -3′，片段长度为154 bp；p15甲基化引物：sense 5′- GCGTTCGTATTTTGCGGTT -3′，antisense 5′- CGTACAATAACCGAACGACCGA -3′，片段长度为147bp。将用SssI甲基转移酶处理的正常血细胞的DNA用作阳性对照。以重亚硫酸盐修饰的DNA为模板，进行PCR反应。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，通过凝胶成像分析仪观察。
1.4 统计学处理
采用SPSS 19.0统计学软件对数据分析，选择双向检验，定义P<0.05为有统计学意义。连续变量资料采用中位数及范围进行描述，采用Mann-Whitney U检验进行比较。数值变量的相关性分析采用Spearman相关分析。
2.1 MCL患者PBMC中TET2 mRNA表达及5-hmC水平
MCL患者的TET2 mRNA表达量显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05) (图1A)。 MCL患者DNA中5-hmC含量低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05) (图1B)。TET2表达水平与5-hmC含量间的相关系数r = 0.645，P<0.05(图1C)。
2.2 MCL患者PBMC中p15基因甲基化及其与TET2 mRNA/5-hmC的相关性
采用甲基化特异性PCR方法对10例对照及20例MCL患者的p15基因甲基化态势进行检测，每个样品的甲基化或非甲基化引物扩增存在目的条带，证明基因组DNA的重亚硫酸盐修饰成功(图2)。p15基因甲基化检测结果显示：对照组10例均未出现甲基化，20例MCL患者中5例(25 %)存在p15基因甲基化。
观察p15甲基化与未甲基化组的TET2 mRNA表达水平结果显示,p15甲基化组的TET2 mRN
A表达低于未甲基化组；比较p15甲基化与未甲基化组
的5-hmC水平结果显示,p15甲基化组的5-hmC水平低于未甲基化组。详见表1。
作为一种潜在的抑癌基因，TET2在正常人体多种组织中表达，但在造血细胞中表达最高[7]。笔者发现MCL患者PBMC中TET2 mRNA表达较正常对照组低。TET基因编码蛋白具有催化5-mC转变为5-hmC的功能[8]，笔者发现MCL患者5-hmC含量低于正常对照，提示MCL中存在基因组的异常甲基化。进一步对MCL中TET2 mRNA表达水平与5-hmC含量的关系分析，发现TET2 mRNA表达与5-hmC含量成正相关，提示作为一种去甲基化酶，TET2的表达可以影响DNA中5-hmC的含量。
MCL以Cyclin D1过度表达为其分子遗传学特征，因此，为观察TET2及5-hmC在调节其他靶基因甲基化中的作用，笔者选择在细胞周期调节中发挥重要作用的抑癌基因p15作为目的基因，对其甲基化态势进行分析。Hutter等[9]检测发现，71例MCL患者中p15甲基化发生率为62 %，并且p15甲基化的MCL有较低的增殖指数。Chim 等[10]分析发现，23例MCL中p15基因甲基化发生率为8.7 %。两项研究中p15基因甲基化在MCL中的发生率存在明显差异。笔者发现20例MCL患者中p15基因甲基化发生率为25%，推测这些差异可能与MSP
所用引物及人种不同等因素相关，但p15基因甲基化在MCL患者中发生率高于正常对照，提示p15基因的甲基化在MCL发生发展中存在一定作用。
尽管p15甲基化在MCL中存在异常，但其甲基化修饰机制目前尚不明确。Aoki等[11]发现p15的甲基化与多种DNMT的表达并无关系，是否存在其他的甲基化与去甲基化调节机制尚不清楚。笔者的研究显示p15高的甲基化发生率与TET2低表达及低5-hmC含量相关，提示TET2可能通过催化5-hmC的产生，参与MCL患者中p15去甲基化的调节。TET2及其催化产物5-hmC在p15甲基化修饰及表达过程中可能发挥了调控作用，但其确切的内在联系及临床意义尚待深入研究确定。
【相关文献】
[1] INAMDAR A A, GOY A, AYOUB N M, et al. Mantle cell lymphoma in the era of precision medicine-diagnosis, biomarkers and therapeutic agents[J]. Oncotarget, 2016, 7(30):48692-48731.
[2] HERMAN J G, BAYLIN S B. Gene silencing in cancer in association with promote hypermethylation[J]. N Engl J Med, 2003, 349: 2042-2054.
[3] LESHCHENKO V V, KUO P Y, SHAKNOVICH R, et al. Genomewide DNA methylation analysis reveals novel targets for drug development inmantle cell lymphoma[J]. Blood, 2010, 116(7): 1025-1034.
[4] ORR B A, HAFFNER M C, NELSON W G, et al. Decreased 5-hydroxymethylcytosine is associated with neural progenitor phenotype in normal brain and shorter survival in malignant glioma[J]. PLoS One, 2012, 7(7):e41036.
