马 巍1，吴 玲2，刘 淼1，任惠民2，扬广笑3，王全颖3，王德利1
(1西安交通大学第一医院骨科;2西安交通大学医学院人体解剖学教研室，西安 710061;
3
西安华广生物工程有限公司，西安 710025)
摘 要：目的 克隆人神经生长因子基因编码区。方法 由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ，利用PCR 法，从
DNA 中扩增出人神经生长因子编码区基因DNA 片段；将获得的基因片段插入p GEM 2T 2Easy 质粒中，转化到大肠
杆菌DH5α后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切核苷酸序列分析技术鉴定重组质粒。结果 经质粒DNA 酶切分析及序列测定，获得了人神经生长因子DNA 片段序列。结论 首次由人白细胞DNA 中克隆获得了人神经生长因子基因，为神经生长因子的基因提供了前提条件。关键词：神经生长因子；聚合酶链反应;T 2载体；基因克隆
中图分类号:Q781 文献标识码:A 文章编号:167128259(2002)0420338204
Cloning and sequencing the human NGF gene
Ma Wei ,Wu Ling ,Liu Miao ,Ren Huimin ,Yang Guangxiao ,Wang Quanying ,Wang Deli (Department of Orthopedic ,First Hospital ,Xi ’an Jiaotong University ,Xi ’an 710061,China )ABSTRACT :Objective Molecular cloning and sequencing of t he human nerve growt h f act or gene.Methods
By ext racting t he human genomic DNA f rom t he w hite blood cells as templates ,t he gene of N GF was cloned by PC R and T 2vect or cloning met hod.The p ositive clones were identified by t he rest riction enzymes ,and t hen t he amplified cloning was sequenced and analyzed.
Re sults The comp arison of t he cloned gene of N GF wit h
t he GenBank sequence (V 01511)showed t hat bot h of t he sequences were identical and of 353bp lengt h.Conclusion
Cloning t he N GF gene f rom t he human genomic DNA has p aved t he way f or f urt her study on gene t herap y of nervous system damage.
KE Y WOR DS :nerve growt h f act or (N GF );p olymerize chain reaction (PC R );T 2vect or ;gene clone
收稿日期:2002201224 修回日期:2002204226
作者简介：马巍(19622)，男(汉族)，在读博士生，主治医师，研究方向：神经损伤的基因和脊柱疾患.
人神经生长因子(human nerve growth factor ,
HN GF )是最早被发现，且被了解最多的细胞生长调节因子；也是中枢和外周神经元存活、生长及分化所必须的营养因子。N GF 对损伤的神经元有促进再生和保护作用。在退行性神经系统疾病的防治，促进神经母细胞分化等方面均具有重要的临床应用价值。N GF 直接提纯较为困难，产量低微，用基因工程方法生产前景广阔。我们由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ，利用PCR 法，扩增出人神经生长因子编码区基因DNA 片段，为进一步将神经生长因子应用于临床提供了可能。1 材料与方法
1.1 用于扩增人白细胞DNA 中N GF 基因的两条PCR 引物 上游引物为:5’2CGG 2T AC 2CAT 2GTC 2
CAT 2GTT 2GTT 2CT A 2C 23’,5’端插入Kpn Ⅰ酶切位
点；下游引物为:5’2CGG 2G AT 2CCT 2CAG 2G CT 2CTC 2ACA 2G CC 23’,5’端插入Bam H Ⅰ酶切位点。1.2 试剂 模板来自健康成人末梢血白细胞DNA 。p GEM 2T Easy 质粒购自Promega 公司。限制性内切
酶Kpn Ⅰ、Bam H Ⅰ、T aq DNA 聚合酶、T4DNA 连接酶等购自华美生物工程公司。其它试剂及全部实验设备均由西安华广生物工程公司提供。
1.3 人白细胞DNA 的提取[1] ①抽取健康成人
末梢血5mL 加入抗凝剂后混匀;②离心3000r ・min -1弃血清加PBS 缓冲液5mL 及白细胞分离液12.5mL ，缓慢加入并3000r ・min -1离心15min 。
③抽提白细胞后3000r ・min -1离心15min 弃上清，使用白细胞裂解液(含蛋白酶K 200mg ・L -1等)重悬沉淀;④离心后分装于4个1.5mL 管中加入0.9mol ・L -1NaCl 液混匀;⑤加等体积酚氯仿抽提离心10000r ・min -110min ，移水相加等体积冰
第23卷第4期2002年8月西安交通大学学报(医学版)
J our nal of Xi ’an J iaot ong U niversity (Med Sci )Vol.23No.4
Aug.2002
无水乙醇置于-20℃2h ;⑥离心12000r ・min -1
10min 后弃上清,70%(体积分数)冰乙醇重悬后10000r ・min -110min ;⑦真空负压干燥5min ，将沉淀溶于20μL TE (p H8.0),4℃保存备用。1.4 PCR 扩增目的基因[2] ①在100μL 反应总体积中，加入1μL (0.1mg ・L -1)DNA 模板,1μL (50μmol ・L -1)上游引物,1μL (50μmol ・L -1)下游引物,2μL (10mmol ・L -1)dN TPs ,10μL 10×T aq DNA 聚合酶缓冲液,80μL 消毒去离子水。最后在体系表面加50μL 石蜡油;②沸水中煮5min 后，立即冰浴2
min ，加1μL (1U ・μL -1)Taq DNA 聚合酶入反应体系;③在PCR 仪上扩增目的基因，设定条件为94℃
60s ,49℃60s ,72℃90s ,30个循环后，再72℃延伸5min ;④取5μL PCR 反应产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定;⑤其余PCR 产物琼脂糖凝胶电泳法回收，正丁醇浓缩，酚：氯仿抽提，无水乙醇沉淀;⑥将沉淀溶于20μL TE (pH8.0),4℃保存备用。1.5 PCR 产物的克隆 ①用T4DNA 连接酶连接质粒p GEM 2T Easy 和PCR 产物,10μL 反应体积中加入1μL (50mg ・L -1)载体DNA ,3μL (0.5g ・L -1)PCR 产物,5μL 2×T4DNA 连接酶缓冲液,60℃水浴5min ，立即冰浴2min ，再加入1μL (3U ・
μL -1)T4DNA 连接酶，放14℃水浴过夜;②用
CaCl 2法制备感受态大肠杆菌DH5
α;③连接产物转化感受态细胞，并将转化菌在表面涂有X 2gal 和
IPTG 的琼脂平板(Amp +)上进行培养;④挑选单个白菌落，接种于10mL LB 培养液,37℃振摇培养16h ;⑤用碱裂解法小提质粒，限制性内切酶酶切分析法筛选阳性克隆(见图1)
。
图1 N GF 基因的克隆策略
1.6 核苷酸序列分析克隆基因序列测定 鉴定后
的阳性重组质粒DNA ，用T7启动子和SP6启动子作为双向测序引物，双脱氧末端终止法测定克隆
基因序列。
2 结 果
2.1 PCR 产物 以人末梢血白细胞DNA 作为模板
进行PCR 扩增，所得产物和PCR 分子质量标准参照
物相比较，在琼脂糖凝胶电泳上获得了预期约739bp 的DNA 片段(见图2)，该值与理论值724bp 加上3个
保护碱基和两个限制性内切酶识别序列相符。
图2 PCR 产物
a.PCR 标尺
b.PCR 产物
2.2 PCR 产物克隆结果 克隆构建的重组质粒
命名为p GEM 2T/hN GF ，大小为3015bp +724bp 。理论上，用Kpn Ⅰ,B am H Ⅰ双酶切可得到3009bp 和730bp 两个可见片段；用B am H Ⅰ单酶切，可将重组质粒线性化，大小约为3.7kbp 一个片段。根据推论，琼脂糖凝胶电泳结果显示，实际值与理论值完全一致(见图3)
。
图3 PCR 产物克隆结果
a.λDNA/Hind Ⅲ标尺
b.PCR 标尺
c.Eco RI 酶切鉴定
d.Bam H Ⅰ酶切鉴定
e.PGEM 2T 质粒对照
2.3 克隆基因序列分析 DNA 序列测定的结果
9
334期马 巍，吴 玲，刘 淼，等1人神经生长因子的基因克隆和序列分析
(图4)与G enBank 提供的已知序列(V01511)比
较，所克隆的hN GF 基因从起始密码子A TG 到终
止密码子TA G 全长共724bp ，序列基本相同
。
图4 N GF 基因序列比较
3 讨 论
N GF 基因自Scort 首次克隆出来后，多种动物的编码N GF 的基因克隆也相继获得，经序列比较，不同种属来源的N GF 基因序列高度同源，最高可达98%3。已有研究表明,N GF 基因为单拷贝基
因，定位于染体1短臂，为编码307个氨基酸残基的前体。而成熟的N GF 仅由一个外显子编码，无内含子4,5。
我们由人末梢血白细胞中提取细胞总DNA ，利用PCR 法，扩增出人神经生长因子成熟肽编码区基因DNA 片段，用T7启动子和SP6启动子作
043 西安交通大学学报(医学版)第23卷
为双向测序引物，双脱氧末端终止法测定克隆基因序列,DNA序列测定的结果与G enBank提供的已知序列(V01511)比较，所克隆的hN GF基因从起始密码子A TG到终止密码子TA G全长共724bp 的序列一致。第57位碱基发生突变，碱基G变为碱基A，而G AA和G A G所编码的氨基酸均为谷氨酸，故不影
响蛋白的结构和活性。最近国内所克隆的成熟段N GF的序列中有11个碱基与国外文献报道的不同，其中多个编码氨基酸发生改变，作者推测可能是中国人基因的特殊性所致6～8。但从我们的结果来看，这一推测有待商榷。本文方法简单可行，其结果将为利用基因工程的方法大量生产和纯化高纯度的N GF提供良好的基础。
参考文献:
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(编辑 韩维栋)
(上接第334页)
3 讨 论
SH2SY5Y细胞是人成神经瘤(是小儿最常见的脑部肿瘤之一)细胞的一种，它具有一定神经元的特性，在全反式维甲酸(RA)的作用下可以分化为神经元表型的细胞，是一个研究神经系统生理、病理很好的细胞模型。构建其cDNA表达文库对研究脑部肿瘤、神经基因表达具有一定的意义。
本文利用RD2PCR技术建立SH2SY5Y细胞基因片段文库，由136组亚文库组成，每亚组中根据碱基相差20个定为不同的DNA带进行克隆筛选，这样分离片段具有目的性，避免了大规模、重复性测序。运用这种方法，已经分离得到了1200余个DNA片段克隆，平均每一个亚组由9～10个克隆组成。人类基因组约有3万个基因，基因的表达具有时间、空间的特异性，大多数基因是处于静息状态，在哺乳类动物细胞中大约有5000种mRNA分子。也就是说应用RD2PCR技术可以克隆将近1/4的细胞表达的基因。其中漏掉的基因克隆可能是由于胶分辨率的所限，相差20个碱基以下的基因片段不能被选择出来。目前克隆的测序正在进行中。
由于在实验中需要对样品进行标记，特别是在0.2mL的PCR管上，面积较小，有时是几个亚组克隆同时进行，这样需要一个很好的标记系统，使在实验进行中不至于样品混淆。本实验中采取的方法是:S b a，第一个字母为s，代表SH2SY5Y细胞,a为分组号,b是克隆编号，这样编码所用的数字较少；其容量也比较大，在实验过程中，每个亚组中一般挑出30个以上的克隆，也就是说它的容量最少是136×30。这种编码方法在软件中，为了信息注册方便，将分组号和克隆号分离开来，成为2个字段。
应用RD2PCR技术建立片段文库主要目的是将所分离的片段用于制备DNA芯片的探针，对这些片段的信息管理，作者应用FOXPRO编写的软件(暂命名为cDNA基因芯片探针数据库)，具有以下优点:①界面小，便于浏览。一个界面基本上可以了解到一个基因段的全部信息。②检索比较方便。在此软件中设置了几个检索的切入口，如:G i2 no、Version以及在Title和Comments中的描述，可以迅速查到所要的基因。③设置了Internet连接的快捷键。通过单击图标可以快速连到DDJB、NCB I、EMBL和B IOSINO(中国的核酸数据库)。
④具有报表功能。单击列表，可以按任意一个字段进行排序。⑤数据可以导出到Excel中。
作者正在从以下几个方面对该软件进一步完善,Sequence是一个备注性的字段，在查功能中不能对其进行查；对其中的数据进行自动更新；该软件对于生物信息学方面研究具有一定的参考价值。进一步，该软件可以外挂其它生物信息学相关软件(如GEN EDOC)，就可以进行多序列比对。特别对于将上述RD2PCR片段用于基因芯片的靶基因之前，通过进一步分析，可以对选择的基因片段进行优化，以增加制备基因芯片的实用性。
致谢：衷心感谢本实验室的工作人员冯亦教、刘丽等的帮助。
参考文献:
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(编辑 邱 芬)
143
4期马 巍，吴 玲，刘 淼，等1人神经生长因子的基因克隆和序列分析
