刘译阳;韩燕;李国卫;崔凤
【摘 要】The ubiquitin-conjugating enzymes play key biochemical roles in the ubiquitination modifica-tion.The in vitro ubiquitination assay is essential to the study of the predicted ubiquitin-conjugating enzyme, which supplies important clues for the following study.So far,the in vitro ubiquitin-conjugating enzyme ac-tivity analysis needs huge amount of works such as protein expression and purification.The process is com-plex,and the ratio of false negative is high.In this study,we developed a new system to detect the plant ubiq-uitin-conjugating enzyme activity which omits the protein purification and in vitro reaction steps in the old method.This new system is more convenient and stable.We applied this system to detect Arachis hypogaea UBC34 and Eutrema salsugineum(Thellungiella salsuginea)UBC33, and proved the ubiquitin-conjugating enzyme activity of these two proteins.%泛素结合酶是一类在泛素化修饰过程中起重要生物化学功能的蛋白.对于被预测为泛素结合酶的蛋白进行体外泛素化活性检测,是确定其泛素结合酶功能必不可少的试验步骤, 试验结果可以为后续研究提供重要的线索.目前体外泛素化反应存在体外表达纯化蛋白工作量大、反应复杂、假阴性率高等问题.本研究针对以上问题进行了改良,开发出一种新的植物泛素结合酶活性体外检测方法,该方法无需裂解细胞提取、纯化蛋白,也不需要做体外反应,简便易行,结果更稳定可靠.应用该方法对花生泛素结合酶AhUBC34和盐芥泛素结合酶TsUBC33进行了检测,结果证明这两个蛋白都具有泛素结合酶活性. 【期刊名称】《山东农业科学》
【年(卷),期】2018(050)003
【总页数】5页(P120-124)
强制系统【关键词】泛素结合酶;体外泛素化检测;检测方法;花生;盐芥
【作 者】刘译阳;韩燕;李国卫;崔凤
【作者单位】山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物栽培生态生理重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物栽培生态生理重点实验室,
山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物栽培生态生理重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物栽培生态生理重点实验室,山东济南 250100
生铁冶炼【正文语种】中 文
【中图分类】无叶风扇控制器S18;Q55
泛素(ubiquitin，Ub)介导的26S蛋白酶体系统通过参与降解生长发育中不正常的蛋白为生物提供足够的氨基酸供应，并通过降解一些限速步骤的蛋白来精确调节生物的生理过程，为生物生长发育以及应对外界环境的变化提供便利，对生物维持正常的生理功能非常重要。泛素介导的26S蛋白酶体降解途径中主要参与分子包括泛素、泛素活化酶(Ub-activating enzyme)E1、泛素结合酶 (Ub-conjugating enzyme)E2、泛素连接酶 (Ub-protein ligase)E3、26S蛋白酶复合体(26S proteasome)以及去泛素化酶(deubiquitylating enzymes，DUBs)。泛素化过程是以上几种酶协同作用的结果。首先，泛素的C末端甘氨酸残基在ATP存在的情况下被E1激活，激活的泛素通过硫酯键结合到E1的一个半胱氨酸上；然后激活的泛素再被转移到E2蛋白的活性半胱氨酸残基上；随后在E3的
作用下E2上的泛素共价结合到靶蛋白赖氨酸残基上；这个过程不断重复形成多泛素化蛋白。多泛素化的蛋白经过26S蛋白酶体进行降解，成为单个的氨基酸残基，同时去泛素化酶把多泛素链拆解成单个的泛素，重新进行利用[1]。其中泛素结合酶是一类在26S蛋白酶体降解途径中起重要生物化学功能的蛋白[2]。目前的研究表明，泛素结合酶是多泛素链组装的关键因子，控制了泛素链的起始和延伸，决定了底物泛素化修饰的类型和最终结果[3]。
对于预测为泛素结合酶的蛋白来说，对其进行体外泛素化活性检测，是确定其泛素结合酶功能必不可少的，试验结果可以为其后续的研究提供重要的线索。目前的泛素结合酶体外泛素化反应体系存在如下缺点：泛素结合酶体外泛素化检测所需的主要分子包括Ub、E1、E2蛋白都需要利用大肠杆菌进行体外表达，然后裂解细胞提取蛋白，有一些还需要进行纯化，纯化后的蛋白为了维持其活性需要保存在-80℃冰箱，过程复杂，工作量大。另外传统的体外泛素化反应检测需要配制反应缓冲液，将Ub、E1、E2等蛋白都加入反应缓冲液中，在一定温度和条件下进行反应。反应缓冲液中必须包含ATP以提供能量，ATP化学性质不稳定，反应缓冲液难以长时间保持活性；体系中加入各种蛋白的量以及反应时间和条件也不相同，都需要各自摸索条件，工作量巨大。如果检测不到泛素结合酶活性，无法区
性蚀
分是由于蛋白表达、纯化、保存、冻融和反应等步骤的问题，还是蛋白本身没有泛素结合酶的功能，容易造成假阴性[4,5]。本研究针对以上泛素结合酶体外泛素化反应体系存在的缺点进行了改进，研究出一种用于体外检测泛素结合酶活性的方法，并利用该方法对花生泛素结合酶AhUBC34和盐芥泛素结合酶TsUBC33进行检测。
猪肉精1 材料与方法
1.1 材料与试剂
LB培养基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1% NaCl，去离子水配制，高压蒸汽灭菌)；IPTG；以上试剂均为进口或国产分析纯试剂。反转录试剂盒购自TaKaRa公司。表达蛋白所用大肠杆菌菌种BL21(DE3)和蛋白表达载体pGEX-6P-1由中国科学院遗传与发育生物学研究所谢旗研究员馈赠。载体pACYCDuet和pCDFDuet由华南师范大学阳成伟教授馈赠。Flag抗体(F725)购自Sigma-Aldrich公司。辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗(D110058)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 体外泛素结合酶活性检测体系的建立香蜜果
选择拟南芥AtUBA2作为E1[4]，构建蛋白表达载体pGEX-6P-1-AtUBA2；选择拟南芥AtUb[4]作为ubiquitin供体，构建蛋白表达载体pACYCDuet-AtUb。 将pGEX-6P-1-AtUBA2转入BL21(DE3)感受态细胞，挑取1个单克隆，命名为C1，保存菌种，用IPTG诱导表达蛋白，将C1诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染，脱后观察蛋白诱导表达情况。将上述成功诱导E1蛋白表达的菌种制备感受态细胞备用。
将pACYCDuet-AtUb转入C1感受态细胞，挑取1个单克隆，命名为C2，保存菌种，用IPTG诱导表达蛋白，将C2诱导前和诱导后样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝染，脱后观察蛋白诱导表达情况。将上述成功诱导E1蛋白和Ub蛋白表达的菌种制备感受态细胞备用。
C1和C2株系感受态细胞即是泛素结合酶活性检测体系的主要组分。下一步只需将待检测E2构建到与pGEX-6P-1和pACYCDuet复制起点不一样的蛋白表达载体质粒上，分别转化C1和C2感受态细胞，分别诱导蛋白表达，通过蛋白印迹方法检测待测E2蛋白是否有符合E2+Ub分子量迁移的条带即可。
1.3 基因扩增及原核表达载体构建
利用拟南芥AtUBC10上游引物5′-CGGAATTCGATGGCGTCGAAGCGGATCTTG-3′和下游引物5′-ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCCCATGGCATACTTCTGAG-3′将AtUBC10蛋白C端加上Flag标签并构建到pCDFDuet载体上。
花生AhUBC34 氨基酸序列为：MAEKSCIKRLQKEYRALCKEPVSHVVARPSPNDILEWHYVLEGSEGTPFAGGYYYGKIKFPPEYPYKPPGISMTTPNGRFMTQKKICLSMSDFHPESWNPMWSVSSILTGLLSFMMDNSPTTGSVNTTTAEKQRLAKSSLSFNCKNATFRKMFPEYVEKYNQEQQLSEQVPPEQASSEAAPNDTSPKVLLEKNLDSTEEGTKRVEQLKVVKKNGKQPFPAWMMLLLFSIFGVVMALPLLQL。据预测AhUBC34是一个跨膜蛋白，为增加蛋白的可溶性，我们利用AhUBC34上游引物5′-CGGAATTCGATGGCAGAAAAGTCATGTATCAAG-3′和下游引物5′-ACGCGTCGACTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCTTGCTTTCCGTTTTTCTTTACAACC-3′扩增出去掉跨膜域并在C端加上Flag标签的AhUBC34，之后用EcoRⅠ和SalⅠ将改造后的AhUBC34构建到pCDFDuet载体上。
