杨霄;黄华伟;伍远安;万译文;李小玲;黄向荣
【摘 要】以石墨烯为吸附剂,制作了石墨烯-管尖固相萃取装置,结合液相谱-串联质谱,建立了一种同时测定贝类中10种脂溶性贝类毒素的方法.实验对提取剂、石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量等实验参数进行了详细优化.在最优的实验条件下,10种脂溶性贝类毒素在各自相应浓度范围内线性良好,相关系数均大于0.99,方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别在0.1～1.1μg/kg和0.3～3.2μg/kg之间;对阴性牡蛎样品进行3个水平的加标回收实验,10种脂溶性贝类毒素的回收率在72.0％～101.2％之间,相对标准偏差小于15％.结果表明,该方法灵敏度高,操作简单高效,适用于贝类水产品中脂溶性贝类毒素的检测分析. 【期刊名称】ups检测《谱》
【年(卷),期】2019(037)005
【总页数】7页(P505-511)
【关键词】码图石墨烯;管尖固相萃取;液相谱-串联质谱;脂溶性贝类毒素;贝类
【作 者】杨霄;黄华伟;伍远安;万译文;李小玲;黄向荣
【作者单位】电磁水泵湖南省水产科学研究所,湖南长沙 410153;农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153;湖南省水产科学研究所,湖南长沙 410153;农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153;湖南省水产科学研究所,湖南长沙 410153;水产高效健康生产湖南省协同创新中心,湖南常德 415000;农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153;农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153;湖南省水产科学研究所,湖南长沙 410153;农业部渔业产品质量监督检验测试中心(长沙),湖南长沙 410153
【正文语种】中 文
【中图分类】洗衣机面板O658
贝类毒素(海洋生物毒素)特指主要由海洋有毒微藻或微生物产生,能够在海洋生物尤其是双壳贝类中富集的、对其他生物包括人类产生危害的一大类小分子有毒化合物[1]。贝类毒素是目前已知的最毒的一类有机化合物之一,人误食了含有毒素的贝类后会有一定的健康风险,
由这些海洋生物毒素引起的疾病包括头痛、呕吐和腹泻,严重时可导致死亡。贝类毒素根据其溶解性可分为水溶性贝类毒素和脂溶性贝类毒素。脂溶性贝类毒素是指一些含有聚醚类结构,具有热稳定性,易溶解于甲醇、乙醚等非极性有机溶剂的微藻毒素。目前常见的脂溶性贝类毒素主要有米氏裸甲藻贝毒素(gymnodimine, GYM)、螺环内酯毒素(spirolides, SPX1)、蛤毒素(pectenotoxin, PTX2)、原多甲藻酸毒素(azaspiracids, AZA1、AZA2、AZA3)、大田软海绵酸(okadaicacid, OA)及其衍生物鳍藻毒素(dinophysistoxins, DTX1、DTX2)、虾夷扇贝毒素(yessotoxin, YTX)等。欧盟对贝肉中部分毒素的安全限量如下:OA、PTX和AZA均为160 μg/kg, YTX为1.0 mg/kg, GYM、SPX等环亚胺类毒素还未设定安全限量[2]。脂溶性贝类毒素具有脂溶性特征,容易在贝类体内长期累积,且其毒性大,中毒后反应快,无适宜的解毒剂,不仅严重威胁着消费者的身体健康和生命安全,同时也严重制约着水产养殖业的健康可持续发展,因而受到国际社会的重点关注[3]。
传统的贝类毒素检测方法为小老鼠生物分析法(MBA法),但因其不能判定多种毒素的具体组分,且灵敏度和准确度均欠佳,已被欧盟于2012年采用液相谱-串联质谱(LC-MS/MS)法(EN 16204-2012)替代。LC-MS/MS法具有灵敏度高、特异性强的特点,虽然使用该方法检测贝类毒素的研究在我国起步较晚,但发展最为迅速,目前采用LC-MS/MS法一次性分离多种贝类
毒素已经成为该领域的研究热点[3-10]。
贝类产品基质较为复杂,样品前处理过程中必须充分地减少基质对目标物测定的干扰,国内已有的研究报道多采用功能性聚合物等吸附剂填充的固相萃取柱[3-7]或基质分散固相萃取技术进行样品前处理过程中的富集和净化[8-10]。固相萃取技术(solid-phase extraction, SPE)是一种常用于样品前处理领域的经典萃取技术[11,12]。但传统的SPE仍存在一些不足之处,如萃取过程繁杂耗时,萃取装置、耗材成本高,制备流程复杂,吸附剂填料选择范围小,因此,开发更优异的样品前处理技术或改进传统SPE技术对贝类样品中贝类毒素的灵敏、快速、低成本检测显得尤为重要。
石墨烯(graphene)是2004年英国曼彻斯特大学物理和天文学系的Novoselov和Geim等[13]发现的一种新型二维平面碳纳米材料。由于其具有大的比表面积、大的共轭体系、很强的疏水性和化学稳定性等特点,石墨烯在电子、信息、能源、材料、催化、吸附和生物医药等领域具有潜在的应用价值[14,15]。石墨烯作为一种新型的吸附材料,目前已经在固相萃取、固相微萃取、磁性固相萃取、分散固相萃取、基质固相分散萃取、微型化固相萃取等样品前处理领域得到较为广泛的关注和应用[15-18]。
样品前处理技术的趋势之一是装置的小型化[19]。管尖固相萃取是一种小型化的样品前处理技术,具有吸附剂和有机溶剂用量少、操作简便快速等优点。由于其具有大的比表面积、高的吸附容量等特点,石墨烯是一种理想的可用于制作小型化固相萃取装置的吸附材料[20]。石墨烯-管尖固相萃取技术将石墨烯和管尖固相萃取各自的优点相结合,在样品前处理领域具有良好的研究价值和应用前景。目前,该技术已成功应用于环境水样[20]、牛奶[21]、果汁[22]、贝类产品[23]、豆芽[24]、减肥补充剂[25]、人血浆[26]等复杂基质样品中目标化合物的分析检测。
本实验制作了设计简单、环保、低成本的石墨烯-管尖固相萃取(graphene-based pipette tip solid-phase extraction, G-PT-SPE)装置,并将其应用于贝类产品前处理的富集和净化过程,结合LC-MS/MS技术,建立了一种简单、快速测定贝类产品中10种脂溶性贝类毒素的方法。实验对提取剂、石墨烯的用量、淋洗剂的种类和用量、洗脱剂的种类和用量等实验参数进行了优化。在最优的实验条件下,将建立的新方法成功应用于实际贝类样品的分离检测,取得了满意的结果。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
TSQ Quantum Access液相谱-串联质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司);高速冷冻离心机(日本日立公司);漩涡振荡器(美国Fisher公司);氮吹仪(美国Organomation公司);中沃超纯水仪(中沃水务环保科技有限公司)。
GYM(CRM-GYM-b,(2.50±0.13) μg/mL)、SPX1(CRM-SPX1,(7.0±0.4) μg/mL)、PTX2(CRM-PTX2-b,(4.40±0.13) μg/mL)、OA(CRM-OA-d,(8.4±0.4) μg/mL)、DTX1(CRM-DTX1-b,(8.52±0.66) μg/mL)、DTX2(CRM-DTX2-b,(3.8±0.2) μg/mL)、AZA1(CRM-AZA1-b,(1.30±0.07) μg/mL)、AZA2(CRM-AZA2-b,(1.22±0.06) μg/mL)、AZA3(CRM-AZA3,(1.04±0.04) μg/mL)、YTX(CRM-YTX-c,(4.92±0.23) μg/mL) 标准溶液均购自加拿大海洋生物科学研究所(NRC);甲醇、乙腈、正己烷(谱纯,德国Merck公司);甲酸(LC-MS级,美国Sigma公司);实验用水为超纯水(18.2 MΩ·cm);石墨烯(厚度:约1 nm,片径:1～100 μm)购自南京吉仓纳米科技有限公司。
贝类样品主要包括僧帽牡蛎(Saccostreacucullata)、紫贻贝(Mytilusedulis)和毛蚶(Scapharcasubcrenata),于2017年6月到9月采自福建省福州、漳州、厦门的贝类养殖户和
水产品市场。贝类样品运至实验室后用水洗净,开壳取其贝肉,沥干水分,匀浆,于-18 ℃冷冻保存。
1.2 标准溶液的配制
准确移取适量的10种贝类毒素标准溶液,用甲醇稀释配制成混合标准溶液,其中OA、DTX1、DTX2、YTX的质量浓度为0.5 mg/L, PTX2的质量浓度为0.25 mg/L, GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3的质量浓度为0.125 mg/L。
1.3 样品处理
1.3.1 提取
称取2.0 g (±0.02 g)样品于50 mL离心管中,加入5 mL甲醇,涡旋混匀1 min,超声提取5 min, 8 000 r/min离心5 min,将上清液转移至另一个50 mL离心管中。向下层残渣中加入5 mL甲醇重复提取一次,合并上清液。在提取液中加入甲醇饱和的正己烷5 mL,涡旋混匀1 min,静置分层弃去正己烷层。于40～50 ℃下氮吹至约0.5 mL,加入2.5 mL水涡旋混匀,超声1 min, 12 000 r/min离心5 min,待净化。
1.3.2 G-PT-SPE装置组装及SPE净化过程led日光灯灯座
取200 μL、1 mL移液头各一个,用甲醇和水洗涤干净后于室温下晾干。根据200 μL移液头的形状特点在头末端一固定的位置填充适量的脱脂棉,称取2.0 mg石墨烯粉末填装到200 μL头中,再往头石墨烯层上端填充适量的脱脂棉。然后根据1 mL移液头的形状特点在头下端一固定位置切去一段并将其插入到上述200 μL头上端即组装成G-PT-SPE装置。依次用1 mL甲醇和1 mL水预处理小柱,然后加入提取液,再用1 mL 10%(v/v)的甲醇水溶液淋洗,最后用1 mL 1%(v/v)氨水甲醇溶液洗脱,收集洗脱液,用甲醇定容至1 mL,过0.22 μm滤膜,滤液供LC-MS/MS测定。
1.4 空白基质标准曲线的绘制
取空白基质样品,按1.3节的样品前处理方法制备空白基质溶液,添加适量1.2节中配制的混合标准溶液,配制成OA、DTX1、DTX2、YTX的质量浓度为2、10、20、100、200 μg/L, PTX2的质量浓度为1、5、10、50、100 μg/L, GYM、SPX1、AZA1、AZA2、AZA3的质量浓度为0.5、2.5、5、25、50 μg/L的基质标准系列工作溶液,并分别上机进行测定。以被测组分的峰面积y为纵坐标,质量浓度x(μg/L)为横坐标,绘制空白基质标准曲线。压力容器制造
