mvkkk替罗非班通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路对氧糖剥夺心肌细胞的干预作用△pvc再生颗粒
李冰，段宏宇，李玉梅，郝一鸣
（内蒙古包钢医院心血管内科，内蒙古包头014010）
摘要：目的探讨替罗非班对氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）心肌细胞的干预作用，并探索其相关 机制。方法H9C2细胞被分为正常组、模型组、替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组。建立OGD细胞
模型，以MTT曲线确定最终的实验浓度和作用时间为替罗非班100nmol/L，作用时间为24h。以流式细胞仪
检测细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；以酶联免疫吸附试验法检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）浓度；以Western Blot法检测磷脂酰肌醇-3
激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）、磷酸化PI3K（phosphorylation PI3K，p-PI3K）、蛋白激酶B（protein
kinase B，AKT）和磷酸化AKT（phosphorylation AKT，p-AKT）的表达。结果和模型组比较，替罗非班组、抑制
剂组、替罗非班+抑制剂组的ROS和TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低，p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的
表达水平显著升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组p-PI3K/PI3K和
p-AKT/AKT的表达水平显著降低，ROS和TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论替罗非班可调控PI3K/AKT信号通路，对OGD心肌细胞起到保护作用。
关键词：替罗非班；心肌细胞；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路；细胞活性氧
中图分类号：R33文献标志码：A文章编号：1007-9688（2021）02-0209-05
Intervention effect of tirofiban on oxygen-glucose deprivation myocardial cells through phosphatidylinosi⁃tol3-kinase/protein kinase B signaling pathway
LI Bing，DUAN Hong-yu，LI Yu-mei，HAO Yi-ming
（Department of Cardiovascular Medicine，Inner Mongolia Baogang Hospital，Baotou，Neimenggu014010，China）Abstract：Objectives To investigate the effects of tirofiban on oxygen-glucose deprivation（OGD）myocardial cells
and explore its related mechanisms.Methods H9C2cells were divided into normal group，model group，tirofiban group，inhibitor group and tirofiban+inhibitor group.OGD cell model was established.The final experimental concentration
and action duration were determined by MTT curve as100nmol/L of tirofiban，and the action duration was24hours.
Reactive oxygen species（ROS）was detected by flow cytometry.Malondialdehyde（MDA），tumor necrosis factor-α
（TNF-α），interleukin-6（IL-6），atrial natriuretic peptide（ANP）and brain natriuretic peptide（BNP）were detected
by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expressions of phosphatidylinositol3-kinase
（PI3K），phosphor⁃
ylation PI3K（p-PI3K），protein kinase B（AKT）and phosphorylation AKT（P-AKT）were detected by Western blot.
Results Compared with model group，ROS and concentrations of TNF-α，IL-6，ANP and BNP in tirofiban group，inhibitor group and tirofiban+inhibitor group decreased significantly（P<0.05），and expression levels of p-PI3K/PI3K and
p-AKT/AKT increased significantly（P<0.05）.Compared with inhibitor group，expressions of p-PI3K/PI3K and p-
AKT/AKT significantly decreased，ROS and concentration of TNF-α，IL-6，ANP and BNP significantly decreased in
tirofiban+inhibitor group（P<0.05）.Conclusions Tirofiban can regulate PI3K/AKT signaling pathway and protect OGD
myocardial cells.
Key words：tirofiban；myocardial cells；phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B signaling pathway；reactive
oxygen species
doi：10.3969/j.issn.1007-9688.2021.02.18·实验研究·
△基金项目：内蒙古医科大学科技百万工程（联合）项目（项目编号：YKD2016KJBW（LH）042）。
作者简介：李冰（1971-），女，主任医师，研究方向为心血管内科。
通信作者：郝一鸣，E-mail：**************
心肌梗死是由于心脏冠状动脉等主要血管堵塞或狭窄导致的心肌组织缺血、低氧、营养物质供应不足、代谢产物清除减少，从而造成心肌细胞凋亡、心肌组织坏死的心血管疾病［1-3］。而心肌梗死最
有效的方法是修复心肌梗死后心肌组织，改善其循环作用［4］。替罗非班是一种重要的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抑制剂，能够有效强化抗血小板，改善冠状动脉血流和心肌灌注，显著降低手术后的主要不良心血管事件的发生率。本研究构建氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）心肌细胞损伤模型，通过测定胞外炎症水平及过氧化物水平，观察替罗非班对损伤心肌细胞的修复效果及氧化应激信号蛋白磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B （protein kinase B，AKT）的变化，初步探索替罗非班对受损心肌细胞功能修复的作用机制。
1材料和方法
1.1主要试剂
大鼠心肌细胞H9C2购自中国科学院细胞库；替罗非班购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LY294002抑制剂购自APExBIO；活性氧（reac⁃tive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自Beyotime；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒购自南京建成；磷酸化（phosphorylation，p）-AKT 兔抗购自Abcam（Ab38449，稀释比例为1∶1000）；兔抗鼠PI3K购自Abcam（Ab191606，稀释比例为1∶1000）；兔抗鼠p-PI3K购自Abcam（Ab182651，稀释比例为1∶1000）；兔抗鼠p-AKT购自Abcam （Ab38449，稀释比例为1∶1000）；丙二醛（malondi⁃aldehyde，MDA）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（i
灌铅nterleukin，IL）-6、心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自Bioswamp；兔抗鼠AKT购自Bioswamp （PAB34089，稀释比例为1∶1000）；山羊抗兔IgG羊抗购自Bioswamp（SAB43711，稀释比例为1∶10000）。
1.2氧糖剥夺造模
收集H9C2细胞，分布于6孔板中，5×105个/孔，每孔2mL，用DMEM正常条件培养24h，使细胞贴壁。采用含2%胎牛血清的DMEM无糖培养基，在37℃，5%二氧化碳+95%氮气的培养箱中继续培养15h。按照LDH测定试剂盒说明书进行检测细胞上清液LDH活性，评估OGD模型。
1.3MTT法筛选替罗非班处理浓度及时间
收集OGD细胞模型，调整细胞密度，分布于96孔板中，5×103个/孔，每孔100μL。待细胞培养至贴壁后，分别加入1、10、100、1000nmol/L替罗非班，培养24、48h。每孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h。去上清，加入150μL二甲基亚砜，低速振荡10min。酶标仪检测490nm处吸光值。
1.4细胞分组与处理
将H9C2细胞分为正常组、模型组、替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组。除正常组采用正常
DMEM培养外，其他组细胞均进行OGD模型构建，替罗非班组加入100nmol/L替罗非班；抑制剂组加入5μmol/L的PI3K抑制剂LY294002；替罗非班+抑制剂组加入5μmol/L的LY294002和100nmol/L替罗非班。
1.5酶联免疫吸附试验检测方法
收集各组细胞上清液2mL，5000r/min离心5min，取上清进行ELISA检测。根据试剂盒的说明书稀释标准品，绘制标准曲线。在酶标包被板上待测样品孔中先加细胞上清液40μL，再加生物素标记的抗体10μL，加入酶标试剂50μL。用封板膜封板后置37℃温育30min。弃去液体，每孔加入显剂A和B各50μL，37℃避光显10min。每孔加入终止液50μL，终止反应。酶标仪检测540nm吸光值，代入标准曲线的回归方程式，分别计算细胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6、ANP和BNP浓度。
1.6流式检测细胞活性氧水平
将细胞接种于6孔板，按照说明书配置终浓度为10μmol/L的DCFH-DA，待测细胞处置好后，去上清，加入稀释好的DCFH-DA使细胞能被充分盖住为宜，细胞培养箱内孵育20min。无血清培养液洗涤细胞3次，洗掉黏附在细胞表面的DCFH-DA。利用流式仪进行检测，平均荧光强度则可表示ROS水平的高低。
1.7Wes Western blo
tern blot t检测细胞p-PI p-PI33K/PI K/PI33K、p-AKT/ AKT的表达水平
冰面上RIPA蛋白裂解液裂解细胞，每5min振荡1次，裂解20min，4℃下15000r/min离心30min，吸取上清液获取总蛋白。根据二辛可酸（BCA）蛋白定量结果上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离2.5h，转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1h，4℃下分别孵育p-PI3K、
PI3K 、p-AKT 、AKT 一抗过夜，PBST 洗10min ，重复3次。室温孵育二抗1h ，PBST 洗10min ，重复3次，曝光显影。采用BIO-RAD Image Lab 软件进行灰度值分析。
1.8统计学分析
所有数据均采用统计软件SPSS 22.0进行分析处理。计量资料以（x ±s ）的形式表示，两组间比较采用t 检验，多组间数据比较选择单因素方差分析，两两比较采用q 检验。以P <0.05表示差异具有统计学意义。2结
果
本草茶>烤翅料
2.1
氧糖剥夺模型评估和正常组比较，OGD 模型组细胞LDH 释放量显著升高，差异有统计学意义（P <0.05），说明OGD 模型组细胞出现损伤，见图1。
2.2
替罗非班处理浓度及时间筛选结果MTT 结果显示，在一定范围内，替罗非班浓度越高，OGD 模型细胞活性越大，且24h 比48h 的促进效果更佳，但当替罗非班浓度大于100nmol/L 后，细胞增殖速度开始减慢，见图2。因此，选择100nmol/L ，作用时间为24h 为最终实验中替罗非班的处理浓度及时间。
2.3替罗非班对氧糖剥夺心肌细胞活性氧水平
的影响
DCFH-DA 荧光强度表示细胞ROS 水平，和正常组比较，模型组含高水平ROS 细胞比例显著增多，差异有统计学意义（P <0.05）；和模型组比较，替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组含高水平ROS 细胞比例显著降低，差异有统计学意义（P <0.05）；和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组含高水平ROS 细胞比例显著降低，差异有统计学意义（P <0.05），见图3。
图1细胞上清液LDH 浓度比较
注：与正常组比较，*
P
<0.05
图2
MTT 检测替罗非班对OGD
心肌细胞增殖的影响
图3各组流式细胞检测细胞ROS 水平比较
注：与模型组比较，*P <0.05；与抑制剂组比较，*
P <0.05
1）∗
p-AKT/AKT p-PI3K/PI3K
1）∗
1）∗
图4各组p-PI3K/PI3K 、p-AKT/AKT 的表达的比较（1=
正常组、2=模型组、3=替罗非班组、4=抑制剂组、5=替罗非班+抑制剂组）
注：与模型组比较，*P <0.05；与抑制剂组比较，
1）*P <0.052.4替罗非班对氧糖剥夺心肌细胞炎症因子的影响
和正常组比较，模型组细胞MDA 、TNF-α、IL-6、ANP 、BNP 浓度显著升高，差异有统计学意义（P
<0.05）；和模型组比较，替罗非班组、抑制剂组、替
罗非班+抑制剂组的MDA 、TNF-α、IL-6、ANP 、
BNP 浓度显著降低，差异有统计学意义（P <0.05）；和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组的MDA 、TNF-α、IL-6、ANP 、BNP 浓度显著降低，差异有统计学意义（P <0.05），详见表1。
表1
各组心肌细胞炎症因子浓度比较
［x±s ］
组别MDA （nmol/L ）TNF-α（pg/mL ）
IL-6（pg/mL ）ANP （pg/mL ）BNP （ng/mL ）正常组806.79±29.92157.85±3.8098.54±2.97
297.05±5.51118.35±3.97模型组1363.61±22.59*
267.64±1.33*171.92±4.71*480.72±5.89*213.04±3.75*
替罗非班组922.38±16.941)*184.94±3.131)*120.77±1.991)*363.96±3.171)*143.79±1.401)*
抑制剂组1170.22±32.881)*
244.25±2.921)*159.56±4.651)*453.19±4.521)*193.92±3.421)*
替罗非班+抑制剂组1043.22±30.162)*
218.13±2.082)*141.91±2.582)*400.04±6.272)*176.53±1.682)*
注：与正常组比较，*P <0.05；与模型组比较，1）*P <0.05；与抑制剂组比较，2）*
P <0.05
2.5Wester Western n blot 检测p-PI p-PI33K/PI K/PI33K 、p-AKT/AKT 的表达结果
和正常组比较，模型组p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P <0.05）；和模型组比较，替罗非班组、替罗非班+抑制剂组的p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P <0.05）；和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组的p-PI3K/PI3K 和p-AKT/AKT 的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P <0.05），见图4。
3讨论
超氧化物歧化酶是机体内重要的清除ROS 自由基的一类因子，是细胞抗氧化功能的重要保
障。氧化应激可诱导心血管功能异常，引发动脉
粥样硬化和心肌梗死等心血管疾病［5-6］。机体中ROS 的产生和清除平衡被打破，则会致机体氧化还原作用失衡，从而产生氧化应激反应。过量的ROS 促进脂质过氧化反应形成过氧化物，导致脂质代谢异常，并引发血液流变学改变，促进血管平滑肌的增殖，改变炎症细胞的迁移行为，破坏血管内皮细胞的稳定性和完整性［7］。MDA 是ROS 与细胞膜或者细胞内的不饱和脂肪酸反应生成过氧化脂质的过程中所产生的另外一种代谢产物，能够反映出细胞内过氧化脂质生成的量与速度。氧化应激损伤是形成心肌缺血症的重要病理原因之一［8-9］。在本研究结果中，OGD 细胞模型出现ROS 、MDA ，以及促炎因子TNF-α、IL-6浓度明显升高的情况，而经替罗非班或（和）PI3K 抑制剂处理后，OGD 心肌细胞ROS 和MDA 、TNF-α、IL-6浓度均显著下降，且提示替罗非班对OGD 心肌细胞的损伤和氧化应激有显著的保护作用。
Yang 等［10］研究证明，在兔的离体心脏缺血再灌注实验中，以PI3K 信号通路阻断剂处理后，心肌梗死显著增加，证明PI3K 信号通路在心肌缺血再灌注中起到了关键的保护作用。同时，用LY294002作为抑制剂阻断，可见AKT 的磷酸化水平降低，且AKT 对心肌缺血再灌注的损伤保护作用也消失。因此，作者认为，PI3K 可以通过促使其下游的AKT 磷酸化而对心肌缺血再灌注的损伤发挥保护作用。
在本研究中，替罗非班处理OGD 心肌细胞后，炎症因子减少，标志着损伤水平的ANP 、BNP 浓度也降低，提示细胞损伤减少，替罗非班对OGD 心肌细胞具有一定的保护作用。但
本研究结果存在与其他研究不一致情况，相关研究显示PI3K抑制剂LY294002可加重缺血缺氧心肌细胞的损伤效应［11］，但是在本研究结果中，抑制剂对OGD心肌细胞ROS、促炎因子、ANP、BNP浓度均有一定的抑制效果，推测其原因可能与细胞状态、试剂差异、实验操作等有关。在鄂璐莎等［12］研究结果中，抑制剂LY294002可抵消高密度脂蛋白对PI3K/AKT信号通路的调控作用。本研究结果显示，替罗非班可缓解抑制剂LY294002对
PI3K/AKT信号通路的阻断作用，减轻OGD细胞炎症因子及ROS水平。
综上，替罗非班对OGD心肌细胞具有显著保护作用，减轻其炎症反应和ROS水平，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关，但还需进一步实验进行验证。
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（收稿日期：2020-04-03）
